猪a1-岩藻糖转移酶基因（FUT1）M857位点遗传变异分析

猪a1-岩藻糖转移酶基因（FUT1）M857位点遗传变异分析 猪a1-岩藻糖转移酶基因(FUT1)M857位 点遗传变异分析 遗HEREDITAS(Beijing)2007年9月,29(9):1071—1076 ISSN0253-9772WWW.chinagene.ca研究报告 DOh10.1360/yc-007-1071 猪a1.岩藻糖转移酶基因(FUT1)M857位点遗传变异 分析 吴圣龙,包文斌,鞠慧萍,朱国强,李碧春,陈国宏 1.扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009; 2.扬州大学兽医学院,扬州225009 摘要:肠毒素大肠杆菌(ETEC)FI8是BI起仔猪断奶后水肿和腹泻病的主要病原菌,a-l岩藻糖转移酶(FUT1)基 因是ECECF18侵染猪小肠的受体蛋白基因.利用PCR.RFLP了1个野猪以及20个中外家猪猪种(群) 共696个个体在Fu基因开放阅读框架的857核苷酸位点的遗传变异,结果表明:在所有猪种中,均未检测 到抗性的型纯合子,在外来猪种杜洛克和约克夏,国内猪种临高猪和杂交猪种中检测到AG型杂合子,外来 猪种中的皮特兰,长白猪以及除临高猪外的所有国内猪种和野猪均表现为极端的单态分布,只有易感的GG基 因型.研究结果提示,中国地方猪种不具备抵抗ETECFI8大肠杆菌的 遗传基础,与外来猪种确实存在差异,这 种差异可能与各自不同的起源有关,ETECFI8抗性基因可能起源于 欧洲野猪;并推测猪种的生长速度与ETEC Fl8大肠杆菌病的发生具有密切的关系. 关键词:大肠杆菌FI8;Fu基因;遗传变异 AnalysisofgeneticvariationsatM857locusoftheal?Fucosy?trans? ferase(FUT1)ORFinpigs WUSheng—Long,BAOWen—Bin,JUHui—Ping,ZHUGuo—Qiang,LI Bi—Chun, CHENGuo—Hong 1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhOUUniversity,YangzhOU225009China Abstract:EnterotoxigenicEscherichiacoliFI8(ETECFI8)ISthemainpathogenthatcausesedemadiseaseand post-weaningdiarrheainpiglets,andal-fucosytransferase(FU不)genehasbeenidentifiedasareceptorgeneencodingthe receptorforETECFI8bacteria.Inthisstudy,themethodofPeR—RFLPWasu sedtOinvestigatetheamong21breedsin— eludingonewildboarbreedand20westerncommerciaiandChinesenativepig breeds(populations).Theresultsshowed thatnoneoftheindividualsinall21breedspossessedtheresistantAAgenotype.thegeneticpolymorphismsoftheFUTl locuswereonlydetectedintwowesternpigbreeds(DurocandYorkshire),Lingaopigandhybridpigbreeds,whilethewild boarandalltheotherChinesepigbreedsonlypossessedthesusceptibleGGgenotype.TheresultsindicatedthatChinese nativepigbreeds,unlikewesternpigbreeds,l砬 kthegeneticbackgroundontheresistancetOETECF18bacteria.Thismay beowetotheirdifferentorigination,astheresistancegenetOETECF18mightbeoriginatedfromEuropeanwildboar.It 收稿日期:2007一O3,19;修回日期:2007—05—11 基金项目:江苏省高技术研究项目(编号:BG2006302)和扬州大 学自然科学基金资助项目(编号:NK0513119)[SupportedbyProgramof DevelopmentStrategiesofScienceandTechnologyofJiangsuProvince(No.BG2006302)andProgramofNatureScienceFundofYang’ zhouUniversity(No.NK0513119)】 作者简介:吴圣龙(1963一),男,江苏泰兴人,博士,副研究员,研究方向: 动物遗传资源评价,保护与利用研究.E-mail:yddkwsl@163.com 通讯作者:陈国宏(1963一),男,江苏扬州人,教授,博士生导师,研究方 向:动物遗传资源评价,保护与利用研究.E-mail:ghchen@yzu.edu.ca 1072蘧HEREDITAS(Beijing)2007第29卷 wasalsoinferredthatedemadiseaseandposvweaningdiarrheacausedbyETE CF18hadcloserelationshipwiththegrowth speedofpigs. Keywords:EscherichiacoliF18;FUTlgene;geneticvariation 在猪病中,断奶前后仔猪腹泻和水肿病是由肠 毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli, ETEC)F18引起的最常见的急性,致死性传染病,该 病发病率和死亡率均较高,治愈率很低fl】.ETEC F18能否致病直接取决于仔猪小肠黏膜上皮细胞 刷状缘有无与F18黏附素相应的受体,即E.coliF18 受体(ETECF18R).Vogeli等【引研究表明,Fu”基 因是ETECF18受体蛋白基因,位于猪染色体6qll 区段,开放阅读框(ORF)的长度为1098bp;Meijer. ink等H】研究也表明,1岩藻糖转移酶基因(FUT1)开 放阅读框架M307和M857处可存在G/A突变位点, 并且均是G对A为显性,即AA型为ETECF18R 抗性猪,GG型为敏感猪,杂合子AG型也同样为敏 感猪,Meijerink等H将F”作为ETECF18R的候 选基因,在250头的瑞士大约克,杜洛克,汉普夏, 皮特兰等猪种中进行基因型测定,依据测定结果通 过适当的选种选配,成功实施了抗性育种. 国内外大多数基因的研究均集中在其 M307位点的多态性分析【5】,然而对M857位点的 研究相对较少.鉴于上述情况,本研究有选择性地 系统分析研究了野猪和国内外20个家猪品种共计 696个个体在基因M857位点的多态性,并对 M857位点进行了克隆,测序,从DNA水平进一步 证明对该位点多态性分析的可靠性,旨在为抗病育 种提供详实的参考数据. 1材料和方法 1.1实验材料 实验动物杜洛克猪,约克夏猪,长白猪和淮猪 采自安徽省农科院种猪场,皮特兰猪采自常熟市畜 禽良种场,梅山猪,枫泾猪,二花脸猪和苏太猪采 自江苏省苏州市苏太猪育种中心基因库,东北民猪 和松辽黑猪采自吉林省农科院种猪场,乐平花猪, 万安花猪和修水杭猪分别采自江西省乐平市,万安 县和修水县的畜牧良种场,荣昌猪采自重庆市畜牧 科学研究院荣昌猪实验场,临高猪采白海南省临高 县种猪场,五指山猪采白海南省农科院五指山猪育 种中心,藏猪采自西藏自治区林芝地区,苏姜猪采 自江苏省姜堰市种猪场,三元杂交猪采自江苏省扬 州市三元杂交瘦肉型猪繁殖场,野猪采自安徽省金 寨县.每个个体采耳组织块约1.0g,放入1.5mL的 Eppendoff管内于冰盒中取回实验室备用. 1.2组织DNA提取 猪耳组织DNA的提取采用常规酚/氯仿抽提 法们. 1.3引物设计和PCR条件 根据GenBank上公布的猪Fu基因序列 L50534设计引物,正向:5.TTACCTCCAGCAG. GCTATGGAC.3,反向:5.ACCAGCAGCGCAAA. GTCCCTGAC.3,预期扩增片段为174bp.引物送 交上海基康生物技术有限公司合成. M857位点PCR反应总体系25L,包括基因组 DNA(100ng/~tL)2L,10xbuffer2.5L,dNTP(2.5 mmol/I.tL)混合物2L,引物(5pmoL/L)各2L, Taq酶(5uL)0.2L,加灭菌蒸馏水补足至25 p.L.M307位点PCR扩增条件为:94?预变性5min, 94?变性40S,56?复性40S,72?延伸45S,共进 行30个循环,然后72?后延伸10min,最后放入4 ?保存备用. 1.4PCR产物酶切反应 选用AcfI对PCR产物进行消化,酶切反应 总体系为10L,包括PCR扩增产物3L,限制 性内切酶0.2~tL(1OU/gL),10xbuffer1I.tL,ddH20 5.8L,置37?恒温反应2h后经8%的聚丙烯酰胺 凝胶电泳银染分析. 1.5PCR产物克隆和序列测定 采用DNAFragmentPurificationKit纯化得到 的PCR产物,16”C条件下与pMD18.TVector连接 12h,并转化至大肠杆菌DH5~t感受态,筛选出阳性 重组菌后,进一步抽提重组菌质粒DNA,经BamH 第9期吴圣龙等:猪al一岩藻糖转移酶基因()M857位点遗传变异分 析1073 I和Hind?限制性内切酶双酶切后,经1.0%琼脂 糖电泳检测证实插入目的片段与预期的片断大小相 一 致.用RV-M和M13.47通用引物对鉴定的阳性克 隆5端和3进行测序. 2结果与分析 2.1PCR扩增 21个猪种696个个体在M857位点的PCR扩增 产物经10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测见图1,为 174bp,与预期的扩增片段大小相一致. l74 图1F不基因M857扩增产物 M:pUC19DNA/MspI(HpaII1分子量. Fig.1PCRamplifiedproductsofFUTlgene M:pUCl9DNA/MspI(HpaII)Markers l9O l47 2.2M307的PCR.RFLP分型 F【,基因M857扩增产物经限制性内切酶 AciI酶切后仅产生2种带型,其基因型分别定义为 GG和AG,带型I为136bp/38bp,带型?为174 bp/l36bp/38bp(图21.带型I说明等位基因G存在 一 个AciI酶切位点,扩增产物能被AciI完全消化; 当该位点发生点突变后,由于酶切位点的消失仅产 857 TGGCGATGGGCGGGAGGCCGC GG 图3GG~flAG基因型M857处突变的测序峰图 Fig.3ThemutationatM857locusinGGandAGgenotype 生174bp的片段,与被消化片段形成杂合子就形成 了带型?. bp 19O 147 l1O 图2F不基因M857扩增产物AciI酶切图 M:pUCl9DNA/MspI(HpaII)标准分子量:1-3,6~8:GG型;4,5:AG. Fig.2PCRamplifiedproductsofFUTlgenedigestedby AciI MwaspUCl9DNA/MspI(HpaII)marker;1-3,6-8:GG;4,5:AG. 2.3F”基因M857的序列测定结果和分析 在M857位点处,由于该位点未找到AA型纯合 子,随机挑选3个GG型个体和6个AG型个体进行 克隆和测序,结果发现M857处GG型个体碱基为 C,6个AG型个体在该位点处碱基c突变成T(图3); 在其他位点处序列与GenBank报道的一致.从上述 F【,不基因M857序列测定表明M857处存在C/T突 变,而并非A/G突变. 2.4各猪种F【,”基因M857的基因频率和基因型 频率 根据21个猪种M857位点带型的测试和分析, 各猪种基因型频率和基因频率统计结果见表1. 在所有检测的猪种中,均未检测到AA型纯合 子,只有在外来猪种杜洛克和约克夏中检测到AG 型杂合子,外来猪种中的皮特兰,长白猪以及除临 高猪外的所有国内猪种和野猪均未发现AA,AG型 857 TGGCGATGGGTGGGAGGCCGC 篷HEREDITAS(Seijing)2007第29卷 表1各猪种F”基因M857的基因型频率及其等位基因频率 Table1GenotypefrequenciesandallelefrequenciesofFUT1geneinvariousp igbreeds 个体,全部为GG型个体,呈极端偏态分布.临高猪 和杂交猪种均检测到AG型和GG个体. 3讨论 对本研究21个猪种中的Fu不基因开放阅读框 857bp位点的多态性进行分析,M857位点经AciI 酶切后仅产生两种不同的酶切片段,其中外来猪种 中杜洛克和约克夏同时存在AG和GG两种基因型; 国内地方猪种中,临高猪表现得较为特殊,31个临 高猪中有9个个体存在AG型,其余猪种均仅存在 GG型,这一结果与晏学明等[6,71在研究M307时检 测到国内地方猪种中除临高猪外均仅存在GG型相 一 致.对于临高这一猪种在研究该基因时所表现的 特殊性以及M307和M857两位点间是否存在一定 的相关还是值得探讨的问题. M857位点只有在外来猪种杜洛克和约克夏中 检测到AG型杂合子,外来猪种中的皮特兰,长白猪 以及除临高猪外所有的国内地方猪种均未发现从 型纯合子和AG型杂合子,均为GG型纯合子,呈极 端偏态分布.晏学明【1IJ对外来猪种和国内地方猪种 Fu”基因M857位点研究中也发现,所有的国内地 方猪种均不存在AA基因型和AG基因型,全部为 GG基因型,呈极端偏态分布;而外来猪种M857位 点基因具有多态型,均检测到AA基因型.晏学明 等,,施启顺等和刘月环【等人分别对杜洛克, 皮特兰,约克夏,长白猪和汉普夏等对5个外来猪 种和几十个国内地方猪种M307位点的研究中,发 现所有的地方猪种均未检测到AA型个体,而且除 临高猪外,所有的国内地方猪种均未发现AG型个 体,全部为GG型,呈极端偏态分布,而杜洛克,皮 特兰,约克夏和长白猪等外来猪种中M307位点基 因具有多态性.这与本研究M857位点的结果一致, 可见M307位点和M857位点在外来猪种中具有多 态性,但在中国地方猪种中没有AA基因型存在. 第9期吴圣龙等:猪a1.岩藻糖转移酶基因(FUT1)M857位点遗传变 异分析1075 对M857位点克隆和测序的结果发现,该位点 存在C/T突变,突变的结果导致氨基酸由精氨酸变 为色氨酸,Meijerink等[4在国外猪种中发现该位点 突变为A,G氨基酸改变为精氨酸到谷氨酸,与本 研究的结果不一致.这也表明中国猪种和国外猪种 抗病性状的遗传基础可能存在差异.该位点的变 异是否在中国猪种中具有普遍性,还有待进一步 验证. 本实验结果和相关研究均表明中国地方猪种均 不具备抵抗ETECF18大肠杆菌的遗传基础,我们 认为这种差异并非由于众多中国地方猪种Fu基 因研究中所分析的猪种以及每个猪种所包括的猪数 量均偏少,或每个猪种所测猪群血源太窄,而是由 于在抵抗ETECF18大肠杆菌病的遗传基础上与外 来猪种确实存在差异.中国地方猪种起源于亚洲野 猪,外来猪种起源于欧洲野猪[1.1扪,本试验亚洲野 猪全部为GG型,呈极端偏态分布;中国地方猪种 与外来猪种F基因M857遗传背景的差异也可 能与这种不同的起源有关,本试验虽然未能获得欧 洲野猪的,但有理由相信ETECF18抗性基因 可能起源于欧洲野猪. 国内近l0个省份ETECF18大肠杆菌病(主要 诱发仔猪水肿病)的流行病学调查结果表明,外来猪 种和含外血的杂种猪发病率高于国内地方品种 猪[1,这种普遍现象一方面进一步证实抵抗ETEC F18大肠杆菌病的遗传基础上与外来猪种确实存在 差异,另一方面似乎与中国地方猪种不具备抵抗 ETECF18大肠杆菌的遗传基础这一事实不符.本研 究初步推测,猪种的生长速度与ETECF18大肠杆 菌病的发生具有密切的关系,猪种较高的生长速度 往往伴随着较高发病率的产生,国内外养猪生产实 践中生长速度快的仔猪发病率高于生长速度慢的仔 猪这一事实充分证实了这个推断.在长期的进化过 程中,F基因可能发生突变,在外来猪种长期的 培育和选择过程中,外来猪种更侧重生长速度的提 高和改良,针对生长速度的高度人工选择,往往引 发水肿病发病率的快速上升,猪种为了适应这种高 强度的选择压力,致使A基因的基因频率上升;而 国内地方猪种在进化和形成过程中受到的生长速度 方面的选择压力很小,生长速度普遍较低,虽然不 具有抗性基因,但ETECF18大肠杆菌病的发病率 仍然明显低于国外生长速度较快的猪品种. 在养猪生产实践中,为了克服地方猪种生长速 度较慢这一缺点,近年来已大量引入外来猪种进行 杂交改良,杂交后代在生长速度提高的同时,水肿 病的发病率也会随之提高,尽管近年来养猪生产中 营养条件和环境条件已得到大大改善,但是在这种 情况下,全国猪水肿病的发病率仍然呈逐年上升趋 势【l训.究其原因,主要是因为养猪生产中,国内地方 猪种的比例呈逐年下降趋势,杂交猪种和外来猪种 的饲养规模不断扩大,目前已占我国养猪生产的主 导地位.可见,虽然在生产实践中可以通过控制诱 发猪水肿病发生的诸多因素,使之在一定程度上降 低F18大肠杆菌病的发生率,但提高抗性基因A的 基因频率仍然十分必要.中国地方猪种普遍生长速 度较慢,猪水肿病的发病率很低,因此,不需要针 对F基因而改变中国地方猪种固有的遗传结构. 但在商品化养猪生产中,例如在三元杂交猪的生产 中,建议引进外来猪种时应当选用F基因AA型 纯合子作为第一父本和终端父本,针对这种基因型 进行标记辅助选择和标记辅助选配,培育出专门化 的抗病配套系,进而从遗传基础上降低猪水肿病的 发病率. 参考文献(References): [I】ImberechtsH,DeGreveH,SchlickerC,BouchetH,Pohl P’CharlierGBertschingerH,WildP’VandekerckhoveJ, vailDamllleJ.CharacterizationofF107fimbriaeofEs. cherichiacoli107/86,whichcausesoedemadiseasein pigsandnucleotidesequenceofF107majorfimbrialsub— unitgene,fedA.InfectImmun,1992,60(5):1963—1971. 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