第二信使因子对牛卵母细胞体外成熟的影响
第二信使因子对牛卵母细胞体外成熟的影
响
8口一oof
苇l6卷筘l旁
l996年1月Ch1nese
国兽医
Sc1ence
Vo1.16
Jan.
No.1
l996
第二信使因子对牛卵母细胞体外成熟的影响
-
壬德顺卢克焕(广西农业大学动物繁殖研究室.南宁530005?---—_一
,——_——一
A一.’摘要
矗研究旨在确定第二信使圈子对牛卵母细胞体外成熟的影响.并探讨通过添加双丁酰
cAMP(dboAMP)及其激活剂,延长成熟时间,以提高卵母细胞胞质成熟质量的可行性.成熟液
雨加0lmmol/L的dbcCMP对牛卵母细胞成熟后的囊胚发育率有促进作用(46.j比
385.<108】成熟培养间为22h时0.1mmo],L的dbcAMP或dbcGMP对卵母
细胞的分裂率,囊肛发育车受其囊胚的孵化率均无明显影响cP>00-3)dbcAMP或
dbcGMI~玎非母缅胞的成熟具延迟作用但这种延迟作用围彼此混旨而消失随着成熟培养时
问约延_主.不管卵母细胞在抑制液(含有Immo]/LdbcAMP,0.2mmol/L异溴甲基黄嘌呤.
20rr,mol/L趺黄嘌呤.0lmmol/L腺苷的成熟液中的培莠时间长短其分裂蜜和囊胚发育
率均随之下砗.成熟液雨加蛋白激酶C(PKC)的激活剂(-30p.mol/LOAG卡丁5.umol/L
A23ls7>,可昭显降低卵母细胞的囊胚发育率(215%比333P<O.O5结果表明,cCMP
对牛卵母细胞质的成熟具促进作用而cAMP和cGMP对此过程无作用.且还对跑梭的成熟
略具延迟作用PKC的激括不利于牛卵母细胞质的正常成熟
关键词—
g-—
fg,~竺三:生量塑堕=壁壁篮苴蛋白激酶C
中图分类号Q78
关于第二信使对牛卵母细胞体外成熟
影响的报道很少,对卵母细胞成熟后的功
能状态变化.119受精能力和胚胎发育能力
的影响则尚未见有报道本研究通过测定
牛卵母细胞体外成熟后的体外受精及胚胎
体外发育能力,探讨了环一磷酸核苷和蛋
白激酶c(PKC)的激活剂等第二信使因子
对牛卵母细胞体外成熟的影响同时,考虑
到卵母细胞核质成熟的不同步性,对通过
抑制卵母细胞的核成熟.延长成熟培养时
间,以使卵母细胞的胞质得充分成熟的
可行性进行了探讨,
本文收到日期:l991l22l
1
与
1.1试剂及培养液配制TCM一199购自
Gibco公司.次黄嘌呤,异溴甲基黄嘌呤
(1BMX),积丁酰环一磷酸腺苷
(dbcAMP),双丁酰环一磷酸鸟苷
(dbcGMP),双丁酰环一磷酸胞苷(dbc
CMP),腺苷,l油酰2乙酰反甘油酯
(OAG)及钙离子载悻A23l87等均购自
Sigma化学公司OAG及钙离子载体
A23187先溶于二甲基亚碾(DMSO)中.再
用培养液稀释至工作浓度,并使DMSO在
培养液中最终含量低于0.1卵洗l液
第期石德顺等:第二信使围子对牛卵母细胞体外成熟的影响
(W1)为TCMl99加5发情牛血清
(OCS).成熟及胚胎培养液(CM)为TCM
199加l0OCS.卵洗2液(W2),获能液
及受精液均为改进的台罗氏液.除获能液
外.所有培养梭均添加10Iu/L青霉素及
1O0mg/L链霉素.培养液的消毒用膜孔为
0.22m的微孔滤膜滤过进行
1.2材料来源及处理在屠宰场收集卵
巢后置于含有3,37CPBS的保温瓶
内.在3h内送回实验室用10mL注射器
自2,5mm的有腔卵泡回收卵母细胞.将
具有完整卵丘细胞层及均匀细胞质的卵母
细胞用作成熟培养试验.
回收2,5mm卵泡的颗粒细胞.先用
wl离心(300g)清洗2次.然后悬浮在
CM中制作颗粒细胞单层进行受精卵的体
外培养,或直接加入成熟培养皿中进行卵
母细胞的体外成熟
1.3卵母细胞的体外成熟及体外受精
将牛卵母细胞置于含有2mL成熟培养液
和5×10.个/L颗粒细胞的塑料平皿中.
在5CO39C的培养箱中培养22,36
h.卵母细胞成熟后.先用w2清洗2次,并
用吸管反复抽打去掉多余的卵丘细胞.然
后置于含有42止受精液(已含30mg/L
肝素)微滴中,添加6gtL经悬浮分离的活
动精于,使受精滴中的最终精子浓度为
1.5×10儿.含有精子及卵母细胞的受精
滴在39?,5C0的培养箱中孵育44,
46h.受精的结果以分裂到2,8细胞阶段
的卵母细胞比例来评定.
用于体外受精的精液系冷冻精液.精
液解冻后,置于含有1mL获能液的试管
中悬浮30,60rain,然后吸取上层的精
子.并离心清洗2次(300g)供体外受精
用.
1.4卵母细胞早期胚胎发育潜力的评定
卵母细胞受精后48h检查分裂率.并移
至含有颗粒细胞单层的微滴(90I)中共
培养5,7d.评定其早期胚胎发育能力.颗
粒细胞单层在移入胚胎2d前制备移入
时.换入新鲜培养液移入后.每2d换液1
次.培养5d后.记录发育到囊胚阶段的胚
胎数.
1.5试验设计
试验一通过5×2因子试验设计探
讨dbcAMP,dbcGMP,dbccMP及db
cAMP+dbcGMP对牛卵母细胞体外成熟
的影响各处理组的成熟培养时间分为22
h和28h.
试验二成熟培养液中不同浓度的
dbcCMP对牛卵母细胞体外成熟的影响.
牛卵母细胞随机分为5组,然后分别用含
不同浓度(0,10,,30,10O,300umol/L)dbc
CMP的成熟培养液成熟培养22h
试验三探讨在成熟分裂抑制剂(db—
cAMP,次黄嘌呤,腺苷和IMBX)存在的
条件下.通过延长成熟培养时间来提高卵
母细胞质成熟质量的可行性.根据卵母细
胞在抑制液(IM)和CM中的培养时间分
为6个处理组(详见表3).IM系在CM中
添加1.0mmol/I的dbcAMP,0.2retool/
L的IBMX,2.0mmo[/L的次黄嘌呤和
0.1mmol/L的腺苷
试验四采用2×2因子试验设计探
讨蛋白激酶C(PKC)激活剂OAG和
A23187对牛卵母细胞体外成熟的影响
卵母细胞随机分为4组.并分别在CM,
50~mol/LOAG,CMOAG5 CM——
~*mol/LA23t87和CM一50~mol/L
OAG+5~*mol/LA23187的成熟培养液
中成熟培养22h
l6统计
所得数据均用卡方分析
确定差异的显着性
中国兽医1996年
2结果
21dbcAMP,dbcGMP及dbeCYlP对牛
卵母细胞体外成熟的影响如表1所示.
当成熟培养时间为22h时.在成熟培养液
中添加0.1mmol/L的dbcCMP,卵母细
胞的囊肛发育率略有提高(P<0.08),并
显着高于0.1mmol/L的dbcAMP组(P
<0.01),当成熟培养时问由22h延长到
28h时.的分裂率及囊胚发育率均明显
下降【P<0.05).对照,dbcCMP和db
cAMP—dbcGMP组卵母细胞囊胚发育
率均明显下降(P<O.05).dbcAMP和
dbcGMP组的囊肛发育率则无明显变化
由此表明.dbcAMP和dbcGMP可能具有
一
定的卵母细胞成熟延迟效应.虽然该效
应在成熟培养时间为22h时并未明显表
现出来
表1dbcAMP,dbcGMP和dbcCMP对牛卵母细胞体外成熟的影响
注:上表数据鲁6在重复试验IdbcAMP,dbcGMP厦dbcCMP在成熟
诫中的雅度均为0.1mmoldL
A3,ab.P<005
2.2不同浓度的dbcCMP对牛卵母细胞
体外成熟的影响如表2所示.各组之间
的分裂率无明显差异(P>0.05),但100
~tool/L组的囊胚发育率则明显高于10和
300~mol/L组(P<0.O5).由此表明,
dbcCMP在成熟培养液中的最适浓度是
100#mol/L.
表2在不同浓度dbcCMP成熟液中牛卵
母细胞的分裂率及囊胚发育率
(m/L)恢数卵数及’%)及()
2.3延长卵母细胞成熟培养时间的可行
性探讨如表3所示,当成熟培养时间为
24h时.1组和2组卵母细胞分裂率和囊
胚发育率均无明显差异,说明IM的核成
熟抑制作用并不明显当成熟培养时问延
长到30h时,卵母细胞的分裂率明显下
降,囊胚发育率的下降仅见于培养在IM
12h的卵母细胞,而培养在IM2Oh的卵
母细胞.其囊胚发育率与对照组无明显差
异.当成熟培养时间延长到36h时,卵母
细胞的分裂率及囊胚发育率亦均连一步下
降.
2.4蛋白激酶c激活剂对牛卵母细胞体
外成熟的影响蛋白激酶c激活剂OAG
或钙离子载体A23187对卵母细胞的分裂
率和囊胚发育率均无明显影响(见表4).
第期石德顺等:第二信使因子对牛卵母细胞博外成熟的影响83
当这2种因子同时加到成熟培养液中时,囊胚发育率则明显下降
表3成熟培养时间及cAMP刺激剂对牛卵母细胞体外成熟的影响
注:试验重复4次;abc,P<005
表4OAG及A23l87对牛卵母细胞体外
成熟的影响
OAGA23187爱精井裂卵数囊旺育数
<gmol/L)(~mol/L)卵数丑()丑()
注试验重复5扶;ab.P<0.05
3讨论
cAMP的主要作用之一是维持卵母细
胞成熟分裂的静止状态.生发泡(Gv)即将
破裂之前,卵母细胞内cAMP的浓度将下
降’].在培养液中添加膜通透的cAMP
类似物或cAMP刺激剂能抑制卵母细胞
的体外自发成熟0j.另一方面.卵泡细胞
中cAMP的暂时升高又与促性腺激素诱
发的卵母细胞成熟分裂恢复有关.
cAMP的这一促进作用亦通过dbcAMP
和IBMX对大鼠和兔0”卵泡内卵母细
胞的短暂作用而得到证实.本研究观察到.
dbcAMP对牛卵母细胞的成熟具有一定
的延迟作用,与Sirard等报道的结果一
致.
本研究试图通过添加dbcAMP,次黄
嘌呤,腺苷和IMBX来延长成熟培养时
间,以提高卵母细胞质成熟质量.但结果与
期望的相反,无论IM作用时间的长短,卵
母细胞的分裂率和囊胚发育率均随着培养
时间的延长而降低.导致该结果的主要原
因是dbcAMP,次黄嘌呤,腺苷和IMBX
仅能部分和暂时地抑制卵母细胞的核成
熟,’而不能完全将卵母细胞的核维持在
GV阶段].因此.今后的研究重点应放在
牛卵母细胞成熟分裂的调控机理上.
有关cGMP在哺乳动物卵母细胞成
熟过程中作用的报道各不相同.Hubbard
等口”.认为cGMP在仓鼠卵母细胞的成熟
过程中是起抑制作用的,但在Hubbard
随后的报道中则表明,cGMP能促进LH
诱发仓鼠卵泡内卵母细胞的成熟并能通
过增强cAMP一磷酸二酯酶的活性,降低
cAMP的水平,而提高仓鼠卵母细胞的成
熟率0]本研究显示,dbcG道,尚无PKC对卵母细胞质
成熟影响的报道.本研究的结果显示.
OAG和A23187明显降低卵母细胞的胚
胎发育能力,而对卵母细胞的分裂率无影
响由此说明,PKC’可能与卵母细胞的核
成熟无关,但干扰卵母细胞质的正常成熟
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hamstersDevBio1.1986,118:343,351
EffectsofSecondMessengersontheinvitroMaturation
ofBovineOocytes
ShiDeshunLuKehuan(AnimatReproductionLaboratory,
Guang,z’iAgriculturalUniversity,Nanning530005)
AbstractTheobjectivesofthepresentstudyweretoexaminetheeffectsofseco
nd
messengerso13.theinvitromaturationofbovineoocytesandthepossibitityofimproving
thecytoplasmicnlaturationofoocytesbyextendingthenlaturationdurationinthepres—
eneeofdbcAMPandcAMP—elevatingagents.TheadditionofdbcCMPatac
oncentra—
第期石德顺等:第二信使因子对牛卵母细胞体外成熟的影响8j
tionof100txmo1./Ltothematurationmediumcausedanincrease(46.5VS38.5口/,.P
<0.08)intheproportionofoocytesdevelopingtoblastocysts,althoughthistreatment
didnotinfluencethecleavagerateofoocytesandthefrequencyofblastocystshatched
fromtheseoocytes(P>0.05).TheadditionofeitherdbcAMPordbcGMP(1O0umol/
L)tothematurationmedium’didnotinfluencethecleavagerate.blastocystyie
ldand
thepercentageofhlastocystswhichhatched(P>0.05)whenoocyteswerematuredfor
anormalperiodof22h.However.eitherdbcAMPordbcGMPseemedtOhave
aslight
maturationdelayingeffectonbovineoocytes,asindicatedbytheobservationthatthe
cleavagerateandblastocystyielddidnotchangeobviouslywiththeprolongationofmat
urationduration.ThisdelayingeffectofdbcAMPordbcGMPwasabolishedbymixing
themtogether.Thecleavagerateandblastocystyielddecreasedwiththeprolongationof
maturation,regardlessofthelengthoftimethatoocyteswereinfluencedbytheIM(1
mmo1./LdbcAMP.0.2mmol/LIBMX,2.0mmol/Lhypoxanthineand0.1mmol/L
adenosineInCM).TheexposureofoocytestotheactivatorsofPKC(0AGand
A23187)resultedinasignificantdecreaseintheb[astocystyield(21.5,O/.VS33.3),
althoughthecleavagerateofoocyteswasnotinfluencedbythistreatment.Inconclu—
sion,cCMPmayfavourthecytoplasmicmaturationofbovineoocytes,buteithercAMP
orcGMPdoesnotinfluencethisprocessandhasaminornuclearmaturationdelayingel-
fect.Activa~ionofPKCmayinterferewiththenormalcytoplasmicmaturationofboyine
oocytesinvitro.
Keywordssecondmessenger;invitromaturation;bovineoocytes;cyclicnuc[
eo—
side:protejnkinaseC