新颖抗真菌的硝吡咯菌素氧化物

新颖抗真菌的硝吡咯菌素氧化物 世界农药 WO订dPesticides Vbl_31NO.5 Aug.2009 新颖抗真菌的硝吡咯菌素氧化物 张兴锋编译 中图分类号:$482.2+92文献标志码:A文章编号:1009-6485(2009)05—0028—03 已知某些属的微生物f如假单胞菌属,青霉属, 芽孢杆菌属和链霉菌属)能产生许多很好的抗真菌, 抗细菌或抗癌细胞等活性物质,这些抗菌物质被用 来治疗人类的传染病或控制植物病原菌. 将活性微生物种群引入到农作物种子和根部的 土壤中,它们能够促进作物生长,控制病原菌的侵 害和改善土壤结构,从而达到作物增产的目的,故 此方法越来越来受到人们极大的关注.另外,用根 际微生物替代不易降解的化学农药来控制土传病害 已经越来越引起人们的注意.在此基础上,假单胞 菌f尤其是荧光假单胞菌)已成为众所周知的植物根 际促生菌以及抗菌微生物.已从假单胞菌菌中分离 到大量的不同种类的化合物,如?_含杂环,稀有氨 基酸,多肽和脂类等.假单胞菌属rRNAII群的假单 胞菌已被归入新建的伯克霍尔德氏菌属. 为确定植物根际土壤细菌能产生促进植物生长 和抗菌的物质,Md.ZakirSultan等人从洋葱伯克霍 尔德菌.cepacia)K87菌株的胞外分泌液中分离出 硝吡咯菌素和两种新的吡咯菌素衍生物.K87菌株 能够诱导黄瓜对炭疽病产生系统抗性,并且抑制主 要的病原真菌(如立枯丝核菌,胶孢炭疽菌和核盘菌). K87菌株胞外分泌液的萃取物经过纯化,分离 出具抗真菌活性的Iii,Ii咯菌素『3.氯.4.(2.硝基.3.氯 苯基)吡咯1和两种结构近似的硝吡咯菌素的生物氧 化物.本文介绍了上述两种复合物的分离并对其化 学结构进行了鉴定. C 123 图I化合物1,3的化学结构式 I材料与方法 I.I试验材料 OCH3 通过Waters质谱仪(Waters公司,曼彻斯特,英 国),配备WatersAllianceHPLC系统联用测定在ESI 正离子模式下的高分辨率TOF质谱,采用MassL),nx 软件(V4.1)进行数据处理;旋光性测定采用 Perkin.Elmer341.LC型旋光仪(Perkin.Elmer公司, 马萨诸塞州,美国1;紫外和红外光谱测定分别采用 岛津UV-2401型紫外分光光度计(Shimadzu公司, 京都,日本)和Perkin.ElmerBX傅立叶红外光谱仪 (Perkin—Elmer公司,马萨诸塞州,美国):H一乃C核 磁共振波谱测定采用VarianMercury400型核磁共 振仪fH谱400MHz,?C谱100MHz)(瓦里安公司, 帕洛阿尔托,加利福尼亚州,美国);H和?C化学 位移值参照氘代甲醇分别为3.30ppm和49.15ppm; 2D(COSY,HMQC,HMBC)核磁共振波谱采用 随机软件VNMR6.1C进行处理;柱层析采用反相 C一18硅胶柱(40,63gm,90xl00mm,Merck公司, 达姆斯达特,德国);中低压制备色谱测定采用 YamazenGR.200型色谱仪(Yamazen公司,大阪,日 本),配备540型泵,反相C.18硅胶柱(预装 C0SMOSIL40C18色谱柱,40x320mm,Nacalai Tesque公司,京都,日本),流速5mL/min;薄层色 谱采用Merck硅胶板(Kieselgel60,F254,20x20cm, 厚0.25mm,Merck公司,达姆斯达特,德国),在 254nm和365nm波长下显色或浸入甲醇:茴香醛. 硫酸显色剂f3:1)后加热显色.HPLC制备色谱采用 Waters600型色谱仪(Waters公司,曼彻斯特,英国), 配备996光电二极管阵列紫外检测器和反相 ChromosepC-18层析柱fMicrosob100—5C—l8, 21.4x250nllTl,瓦里安公司,帕洛阿尔托,加利福尼 亚州,美国1,检测波长210nm,流速7mL/min. AG.4菌株(NIASTB.1菌株)来自国家农业技术 研究院(水原,韩国);PDA,TSB,KBA等培养基 购自BectonDickinson公司和Sparks公司. 1.2菌株的分离与培养 K87菌株分离自大白菜根际土壤,通过对其16S 作者简介:张兴锋(1981--),男,硕士研究生,自由职业者.E-mail:xingfengzh@163.com ?29?世界农药第31卷 rRNA序列并提交NCBI进行比对,该菌株最终 被鉴定为洋葱伯克霍尔德菌.在含20%甘油的TSB 培养基上,K87菌株能够耐受-80?的低温;通过 划线培养活化后,接种到KBA培养基上,置于28? 培养7d. 1.3萃取与分离 将通过培养获得固体培养基(1OL)用机械搅拌 机粉碎,浸入20L甲醇中,室温下浸提2d.倾出 甲醇层,剩余培养基用另外的1OL甲醇进行洗涤. 将两部分甲醇浸提液混合后进行浓缩,得到18Og 褐色残渣.将残渣悬浮在100mL水中,以甲醛和水 进行通过反相C.18柱梯度层析,分离获得11个组 分.通过薄层层析,60%,80%甲醛溶液的洗脱液f组 分7,8和91混合后进行减压浓缩,得到578.7mg 棕色油状物.在反相C一18色谱柱上180rain用50% 到100%的甲醛溶液对其进行洗脱,后得到4种亚组 分.其中活性组分3和4混合(279.4mg)后经过反相 色谱柱(30%,60%E~腈溶液,70rain)纯化得到复合物 2(6.0mg,Rt=-35.1rain),3(3.2mg,Rt37.7rain), lr14.4mg,Rt68.9rnin). 1.4抑菌活性测定 通过纸片平板扩散法进行抑菌活性测定.在生 长一周的立枯丝核菌平板上打孔,取生长活跃的菌 丝块,置于PDA平板中央,28?培养1d.取直径 8mlTl的圆滤纸片,用待测样品浸透后,置于平板菌 丝外缘,28?下培养,3d后测定抑菌圈大小. 2结果与讨论 28?下K87菌株在KBA培养基中发酵7d后, 用甲醇浸泡后得到浸提物,通过一系列色谱纯化(如 中低压C.18反相色谱,C.18高效制备色谱等),从 180g粗提物中得到三种组分:l(14.4rag),2(6.0 rag),3(3.2rag). 组分I为前褐色油状物,经鉴定为硝吡咯菌素; 组分2也为前褐色油状物,旋光度.2.4(c0.25,甲醇), 质谱测定其质子化分子离子[M+H]+的质量为 302.9931f以M+H计为302.9939),表明其分子式为 Cl1H9C12N204.紫外最大吸收峰在214nm和303nm. 红外光谱表明其特征峰在3448,17l8和1654cm,, 表明其含有OH或NH,C=O,和C=C结构.组分 2的核磁共振H谱显示出质子信号[67.69(t, j=8.OHz),7.80(t,j=8.OHz),7.57(t,j=8.OHz)],表明含 有苯环三取代的特征性的ABC旋转模型;质子信号 (63_31)表明含甲氧基;质子信号(65.49)表明其为甲 川型.H.Hcosy谱峰表明芳氢H一57.69)与 H一4(67.8O),H一6(67.57)相偶联.I-ISQC谱峰分别 表明含C一5f6l33.2),C一4133.3),C一6130.7). HBMC谱峰中,质子H一4,H一6与四元CC一2(6149.4) 的关系;质子H.5显示出与四元CC一4(6126.9)和 C一6(6127.0)的关系.核磁共振谱图数据分析表明, 组分1,2中的三元苯环结构可推断为3.氯一2.硝基 苯基,而组分1中的苯酚H与组分2中不同,相对 重叠.另外HBMC谱峰表明依附于C一5(687.2)的质 子H.5(65.49)分别与甲氧基C(655.6)和3个四元C C.2(~167.0),C一4(6l45.6),C一3(~132.2)具长程相关性. 此部分可推断为HC(OCI-I3)一C=C.C=O结构,并与甲 川I型C(C=0)具有长程相关性,由此推断出分子式为 4.取代的5一甲氧基一3.氯一吡咯啉一2一酮结构.在吡咯啉 酮部分的四元CC,4(8145.6)与3一氯一2一硝基苯基中的 质子H.6有着重要的联系,此联系也表明两个部分 的基团有直接相关性.另外,芳氢H一6和甲氧基氢 H一6具有弱的核奥弗豪泽效应,更说明两个基团在 空问排列上向邻近.以上谱图分析表明组分2的结 构为3.氯.4一f3.氯一2一硝基苯基)一5.甲氧基一3.吡咯啉 一 2一酮. 组分3为前褐色油状物旋光度+l1.9(c0.063,甲 醇1,紫外图谱与组分2相似,红外光谱表明其也含 OH或NH,C=O,和C=C结构,质谱分析表明其 分子式与组分2相同.核磁共振图谱表明其空间结 构与组分2相似,也表明了3.氯一2.硝基苯基的存在. HBMC谱峰表明H一5(65.58)分别与甲氧基C(651.8) 和3个四元CC一2f6169.4),C.4(6148.1),C一3(8133.5) 具长程相关性.由于四元CC.3(~133.5)与另外的 C.5,C.4重叠,质子H.6(67.52)~U四元CC.3(~133.5) 的长程相关性并不确定.原推断,受组分2和3中 吡咯基团的?,D不饱和羰基影响,组分2中13-c(c一3) 和组分3中的13-c(c一4)分别在6145.6和6148.1产生 了低场位移.但由于羰基影响,在组分2中紫外谱 峰没有明显的红移,3个芳碳(C..2,C一4,C一6)也没 有发生低场位移;这表明,和硝吡咯菌素一样,组 分2中苯基和吡咯啉酮环并不在同一平面上.组分 2和3中C.5的绝对构型依然不确定. 纸片平板扩散法测定结果表明,分离到的硝吡 咯菌素(5Ogg/片)对立枯丝核菌具有较强的抑制作 用,抑菌圈直径达25mm.但组分2和3抑菌作用 相当弱,在250g/片浓度下抑菌圈直径仅为10mlTl.