Caspase家族与多药耐药发生机理

Caspase家族与多药耐药发生机理 Caspase家族与多药耐药发生机理 {一纠 Caspase家族与多药耐药发生机理 ... 凸 ,,..… 7;李 战强综述杨平地审校' 【摘要】ca印ase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用,近年来又发现ase在传递 多种化疗药物的敏感性中起重要作用,Caspase活性的组成性下调会增强肿瘤细胞的化疗抗药性.对许多 经典的多药耐药机理的研究发现,其中都有casp~的参与.对caspase的深人研究将对我们进一步认识肿 瘤细胞多药耐药的机理及提出更新的耐药逆转方法提供思路. 【关键词】多药耐药.嘲se蛋白酶细胞凋亡喀,=fI九刁才本,一—,I 多药耐药是指肿瘤细胞接触某种天然抗肿瘤药物 的同时,可耐受各种不同结构,功能及杀伤机制的多种 药物的致死量.其发生机理及逆转与临床肿瘤治疗效 果密切相关,是实验医学研究的焦点问.近年来研究 明,凋亡分子caspase蛋白酶家族参与了多药耐药的 发生过程,并可能作为耐药逆转的靶分子.本文即对此 做一简要综述. 1Caspase蛋白酶家族 天冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶(cysteinylaspar tare-specificprotease,easpase)家族也称为ICE/CED一3 家族,是一组与细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白 酶,是美丽线虫死亡基因CED-3的同源物.美丽线虫 是一种结构简单的线虫,构成其胚胎的1090个细胞在 发育过程中有131个发生凋亡,是一个理想的研究细胞 凋亡的模型.目前已经从美丽线虫中克隆到l4个与细 胞凋亡各阶段相关的基因,其中CED一3,CED一4和 CED一9的作用较为重要.CED一3和CED一4基因产 物都可以促进凋亡的发生,这两个基因突变后细胞就失 去了凋亡能力.CED一9与人的BCL一2同源,编码的 产物可以阻断体细胞凋亡_IJ. lCE佗ED一3蛋白酶的活性是由活性中心的半胱 氨酸上的琉基发挥的,所以属于半胱氨酸酶类.这个家 族的蛋白酶具有特异性地在特定的氨基酸序列中将肽 链从天门冬氨酸(Asp)之后切断的活性.经过近几年 的工作,目前已经从人和动物细胞中克隆到十几种这样 作者单位:71fl~32西安,第匹军医大学西京医院{事战强),海军总医 院(杨平地) 的蛋白酶.1996年Alnemri等_2J提出将人源性的ICE/ CED一3蛋白酶统一命名为"caspase",并将已经克隆出 来的人的ICE蛋白酶依次命名为caspase一1,l0,其中 ICE为caspase一1. Caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着 中心的作用.Fas与配体结合而活化后,首先引起 YVAD和zVAD敏感的ICE家族蛋白酶活化,然后再 活化DEvD敏感的蛋白酶(YvAD,zVAD,DEVD:人工 合成的四肽).其中caspase一8是这一凋亡过程中首先 被活化的ICE家族蛋白酶.Caspase一8活化后,一方面 它可以剪切活化caspase一3,caspase一7,caspase一4, caspase一9和caspase,10,通过这些蛋白酶剪切底物使 凋亡得以进行;另一方面,它的活性可以被痘病毒蛋白 CrmA(cytokineresponsemodifierA)所抑制,籍此可作 为细胞凋亡负调控因素作用的环节3J. Casp~e一8的活化可以是Fas与其配体结合引起 的Fas相关的死亡结构域蛋白(Fas—a.~ociateddeath domainprotein,FADD)与caspase一8结合的结果,也可 能是颗粒酶B,ICE等作用的结果.所以其它能够引起 细胞凋亡的因素也可以通过激活颗粒酶B或ICE来激 活凋亡信号转导途径.Caspase一8活化后引起caspase 一 3和caspase一7活化,这两种酶都可以剪切多ADP 核糖聚合酶(poly—ADP—fibese~lymerase,PARP).引 起DNA的降解.另外,caspase一3还可以活化caspase 一 6,后者可以降解层蛋白B.此外,U1核糖体蛋白的 70kD亚基(u1—70K),DNA依赖的蛋白(DNA—PK) 的催化亚基,微丝相关蛋白Gas一2,B—actin,PKCd,视 网膜母细胞瘤蛋白,DNA拓扑异构酶I和?等也都可 能作为caspase一3和caspase一6的作用底物.在哺乳 动物细胞的捅亡过程中,easpase3,6,7是与CED一3最 相似的蛋白酶,它们完成了太部分剪切底物的作用,发 挥了CED-3在美丽线虫中所发挥的作用J. 目前认为,能够将细胞膜事件与细胞浆事件联系起 来的蛋白质除了FADD/caspase一8通路外还有其它形 式,新发现的胞浆蛋白一caspase和RIP的死亡结构域 调节子(caspaseandRIPadaptorwithdeathd?lain, cI可以将受体反应蛋白(receptor—interacting protein,RIP)与caspase一2联系起来.另外,caspase一 1O和caspase一9都已被证明可以在凋亡信号传导过程 中先于其它蛋白酶活化,并通过其酶活性将信号传给其 它caspase蛋白酶.此外,哺乳动物细胞线粒体对多种 凋亡刺激因素都会产生一种反应:将细胞色素C释放 人胞浆中.现已知道这是caspase一3活化所必需的』. 在许多药物如阿糖胞苷,柔红霉素的MTX等引起 的肿瘤细胞凋亡中都需要caspase的活化,这在体外T 白血病细胞中就能见到L6J.用caspase的抑制物CrmA 可以中断该细胞死亡.多肽抑制物甚至在药物处理后 几小时都能发挥效力,表明caspase系统直接参与执行 过程而不是药物作用的起始阶段.CrmA的过表达强 烈地抑制了阿糖胞苷,vP—l6,阿霉素和顺铂介导的 caspase的活化,同时也抑制了这四种药物引起的细胞 死亡.而且在药物处理后几天甚至几周后,表达CrmA 的细胞都进行了传代;而仅转染空白载体的细胞却没 有.用反义核酸技术处理caspase—l和casDase一3也 能极强地抑制药物介导的凋亡,显示该蛋白酶家族的几 个成员都加入了该过程L7J. 将两种人白血病细胞株U937和TUR置于化疗药 中结果导致对凋亡的诱导和抵抗完全相反的作用.将 U937细胞与Ar丑一c或VP—l6共育伴有G0/Gl周期 阻滞和亚G1期细胞数的增多,其中亚G1期的细胞表 现出凋亡途径特征性的表型.相反,人TUR白血病细 胞在用Am—C和VP—l6作相同处理后却没有明显的 作用.所以,在抗肿瘤药物作用下TUR细胞持续增 生,而且与亲本U937细胞相比,凋亡细胞有明显的减 少.在血清饥饿的情况下也出现同样的结果,从而证实 了TUR细胞对凋亡的抵抗.深入的研究表明,U937 细胞在药物作用下通过裂解成20一kDa的活性形式活 化32一kDa的caspase一3.然而在TUR细胞中却没有 可测得的20一kDacaspase一3片断.同时,U937细胞 中caspase一3的酶活性也明显增强,表现为在体外对荧 光底物的代谢增强,在体内裂解caspase一3合适的底 物,也就是PKcdetta.相反在药物作用的TUR细胞中 却只能检测到少许的caspase一3的活化.这些数据提 示,用化疗药物作用后在TUR细胞中caspase一3蛋白 溶解系统的活化过程中有信号缺陷,并与这些人类白血 病细胞对凋亡的抵抗有关L8J. 对泰素耐药的肿瘤细胞一个特征性表现就是:多小 核化(mukimininucelation).而抑制easpase的活化则能 使细胞具有此特性,更直接地了细胞在耐药产生过 程中对caspase的依赖性j. 细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxinTLymphocyte, ETa)对靶细胞的杀伤由诱导凋亡介导,并需要功能性 死亡途径的存在.杀伤由CD95或穿孔素/颗粒酶途径 介导.研究发现,SH—EP成神经瘤细胞主要通过 ?95杀伤,而在T白血病细胞株CEM中c【)95和穿 孔素粒酶途径都参与其中.在两种细胞株中,对 cD95或药物介导的凋亡耐受的细胞对CTL细胞杀伤 也交叉耐受.耐受细胞对caspase底物PAR的裂解减 少,从而显示出凋亡减少和caspase的活化缺陷.用 caspase的抑制物zVAD—fmk预先孵育可明显减少 LAK细胞对敏感细胞的杀伤.虽然亲本CEM细胞可 以通过与阿霉素预先孵育的方法增加对LAK细胞的 杀伤敏感性,但在对阿霉素或对CD95耐受的CEM细 胞中耐受性并不能被逆转L』. 这些研究证实,caspase在传递多种化疗药物的敏 感性中起重要作用,casp~活性的组成性下调会增强 其化疗抗药性.而另一些研究则向我们揭示了caspase 活性下降的原因,并且由于它们将经典的耐药机理与其 联系起来,预示了caspase在耐药机理中特殊的地位和 作用. 以往的多药耐药机理已证实,P一糖蛋白除排出药 物之外,还保护耐药细胞免受多种形式的caspase依赖 性凋亡.表达高水平的P—gP的人CEM和K562细胞 株对多种形式的caspase依赖性细胞死亡不敏感,包括 细胞毒作用和FasL介导的细胞凋亡.由这些刺激引起 的DNA断裂和膜损坏被确认为是caspase依赖.被药 物选择或反转录病毒转导MDR1cDNA而表达P一糖 蛋白的细胞对大量的死亡刺激耐受,如FasL,TNF,uv 等,这些都可激活case凋亡级联反应.通过抗P— gp单抗MRK一16或维拉帕米抑制P—gp活性可逆转 这些细胞的死亡.抑制P—gp功能同时也提高了药物 或Fas介导的caspase一3在耐药的CEM细胞中的活 化_1".另外,在同细胞中非caspase依赖性细胞死亡, 则不受P—gp的表达影响.基因克隆判定法显示,P一 糖蛋白对caspase依赖的凋亡刺激可产生长期的耐受, 而对非caspase依赖的细胞死亡刺激则无此作用,如穿 309 孔素和颗粒酶B所介导的细胞死亡.这些观察结果提 示:P—gP可能在调控某些caspe~e依赖的凋亡途径中 起重要作用. 细胞周期紊依赖激酶抑制因子p27Kipl是球体或 单层肿瘤细胞的一个耐药因子.悬浮生长的白血病细 胞中p27Kipl的过表达也使之耐受药物介导的凋亡和 细胞毒性.p27Kipl的抗凋亡作用不只局限于对破坏 DNA的药物长春花碱.抗Fas抗体的拮抗剂和大分子 合成抑制物.用VP一16作用于转染空白载体的U937 细胞导致原caspase一3和原caspe~e一2的长单体的活 化.介导线粒体功能下降,并使细胞色素C从线粒体释 放到细胞浆中.所有的这些变化都可被p27Kip1的过 表达所阻断.p27Kipl不调节白血病细胞中Bcl一2,Bcl — xL,Mcl一1和Bax蛋白的水平,但却抑制在VP—l6 诱导转染空白载体的U937细胞死亡过程中观察到的 Mcl一1表达减低现象.因此p27Kipl在许多凋亡刺激 引起的细胞死亡途径中的上游发挥阻断作用,包括细胞 色素C从线粒体中的释放和下游的caspases的激 活[. P388)R小鼠白血病耐药细胞Bcl—xL的表达 明显强于亲本P388细胞,而将Bet—xL基因转入P388 细胞后,可以产生与P388/SPR细胞一样的MDR_l. 我们的一项实验结果证实:在人HL6O/,R耐药细胞 中Bcl—xL的表达明显强于亲本HL60细胞.前者是后 者的2.4倍,提示BcI.xL的高表达与人白血病MDR 的形成可能有一定的关系.如用中药川芎嗪逆转 HL6O/VCR细胞MDR的同时,总伴有靶细胞Bcl—xL 表达的下调_1.这些研究表明,Bcl—xL与肿瘤细胞 耐药形成机理之阃的关系 最近的研究证实,对烷化剂顺铂选择性耐药的SCC - 25细胞过表达抗捅亡的Bcl—xL蛋白.与亲本细胞 相比.在c?)P诱导凋亡过程中,s.c一25/CDDP细胞 程度不同地不能表现caspase一3的激活,蛋白激酶C— delta的裂解等凋亡特征.同样的结果在结构和功能都 不同的抗代谢药物Am—C处理后也出现了.其它对 阿霉素或长春新碱选择性耐药的细胞也表现出Bcl— xL的过表达,而且在?DP和Ara—c处理时也没有 caspase一3的激活.更进一步的结果证明,多药耐药细 胞表现出阻断线粒体的细胞色素c进入胞浆,而且此 作用依赖于Bcl—xL的过表达.从耐药细胞中的溶解 物在加入细胞色素C后有caspase一3的激活,更证实了 凋亡的阻断是因为抑制了线粒体的细胞色素C释 放L16].这些发现又更进一步地说明了Bcl—xL与cas. pase之间的必然联系,也为对深入了解Bcl—xL引起耐 3】0 药的机理提供了思路. 同样的结论在以往的许多耐药机理中都可以得出. 如Fas,Bc卜2,DNA拓扑异构酶,PKC等.它们可能都 是通过影响caspase而达到使细胞对化疗药介导的凋亡 耐受的目的.如BcI一2的表达可阻断caspase的活 化[17];在耐药细胞株中不能通过Fas启动caspase途径 诱发凋亡【;合用抗Fas抗体和化疗药后可逆转耐药 等[1. 3应用前景 在一项研究中,耐药的293细胞株在抗肿瘤药物作 用后不能活化caspase.而从未经处理细胞中提取的精 质活化了caspe~e.而且诱导了细胞凋亡,提示耐药缯 胞不但有其凋亡机制而且有其激活物.通过比较细胞 提取物的详细基因差别发现,此激活物是由腺病毒 E1A的原癌基因产生.并从正常细胞中缺失.在初步 特征化了此原癌基因的产生活性(OncogeneGenerated Activity.OGA)后,把此纯化的OGA加入到未转化的细 胞提取物中,结果部分活化了ca~pase.因此可以想象. 在细胞中把OGA连接到caspase上的药物会更有效地 杀伤肿瘤细胞,从而达到逆转耐药的目的一. 综上所述,可以看出,caspase在肿瘤细胞凋亡信号 传导过程中起着举足轻重的作用,并由此在肿瘤细胞耐 药形成机理中扮演同样重要的角色.对casp,~e进一步 的研究必将使人们更深入地了解多药耐药的产生机理. 并提出新的耐药逆转方法. 4参考文献 YuanJ,值hamS,LedS,CelI.1993,75:641 AlnemriES.L11吕姗DJ,NhdsDnDW,etCeU,1996,87:171 2h【lgJ,CarloD,Ch叽A,etNature,1998,392:293 Nur-凹G,BenedictMA,HuY,dOneegene,1998,17:3237 B0蠲We~elE,NewrneyerDD,0啪DR,.EMB0J,1998,17:37 I脯M,HerrI,Fe3?C,.Blood,1997,9(I:3ll8 AntolmK,LjuZ,Jd?1son腿,.Leukemia,1997,I1:16 Mein~rdtG,Ro血J,TotokG,E即ceURes,1999z47;534 Panviel~nR,0nhK.DayML,.Cancer,1998,58:4667 Cl8s啪CF,daS,Fe3廿1C,et山珂血,l999.13:410 MarkJS.Kr~kisE,SuttonVR.atPineNatIAcadSdUsA, 1998.95:7r甜 RidwJ,CremeyE,hMJ,.B4,1999,93:1075 EyrninB,Hau龉M,DmlnN,以.C1.盯,1999,l8:1411 KJs.K商P卿j【iS.PLI瑚GE.口,.&JC跏,1997.75:268 粱蓉,杨平地,等.第四军医大学,1998,19=466 K~imaH,FndDK,Mc~iyemaH,.JBio】Chin,1998,273;1? sl嘧iS,H虬Z,BhK,样on?雷自,1996,12:2251 Ffie~enC,o?d?O,?kJR,at.mke曲,1997,I1:1s33 23456789mn垃n?竹馋 //一j 核定位信号的研究进展 0 曹震宇综述昊克夏审校 -.., 段.z 6 【荷要】棱定位信号(NLS)是由一段富含正电的短肽与其旁侧的调控顺序构成的 信号肽段,介导蛋 白分子进入细胞棱.NLs介导的蛋白入棱是受体依赖的耗能过程.是胞内信号传导 的关键节点.许多疾 病如肿瘤,一些自身免疫病,遗传性血液病,病毒性感染等都与NLS的异常相 关,NLS作为疾病治疗的靶 点日益受刊重视.根据NLS定向运动的特点,还将其作为信号肽用于定向治疗,并 在基因工程中作为目的 基因载体提高基因整合效率. 【关t词】苎塞些笪芝竺些堕昱堕!由赦_-_-_-—一',0 核定位信号(Nuclearlocalizationsignal,NLs)是一 段富含碱性氨基酸的短肽,是介导蛋白入核的一段充分 而必要的信息片段_1J.1982年,DingwaU等首先发现 爪蟾卵(Xenopus)核质蛋白C-端的一段氨基酸顺序对 其入核是必须的,此后在RNA结合蛋白,转录因子,甾 体激素受体,细胞因子及其受体,细胞内激酶和病毒的 毒蛋白中亦发现了NLS.NLS介导的蛋白入核是细胞 内信号传递网络中核质物质信息交流的重要一环,对细 胞的增殖,分化,凋亡及转化起关键性作用,因而对 NLS的研究已成为生命科学研究的一个热点.NLS作 为顺式元件,是外界干预胞内信息的一个靶点,近来在 遗传病,自身免疫性疾病,退行性疾病,特别是病毒感染 中得到了深入研究,有人通过抑制HIV一1的NLS抑 制其增殖取得了喜人的结果.另外,利用NLS片段作 为载体用于基因的高效转化和疾病的导向治疗也初见 端倪. 1NLS的分类 根据NLS的结构和入核机制的不同,分为两大类. 1.1经典NLS 经典的NLS由核心NLS(CoreNLS)及其旁侧的 调控顺序构成L.核心 NLS是一段由四一六氨基酸残基组成的短肽,其氨基 酸组成决定了信号的强弱,通常碱性氨基酸形成强人核 信号,而中性或酸性氨基酸的存在会减弱其信息强度以 作者单位:3蚴天津,中国医学科学院中国协和医科大学血踱学研究所 至成为不完全的NLS.核心NLS旁侧为调控顺序,以 多个丝氨酸或苏氨酸残基为特征.这些羟基氨基酸残 基是胞内多种激酶一磷酸酶系统的靶点,通过其磷酸化 和去磷酸化作用调节NLS信号的强度.经典的NLS 又可分为两类:?简单的核定位信号(simpleNLS/ monopartiteNLS)由一段连续的短肽片段构成,以 SV40的大T抗原的NLS为代表;?分割的核定位信 号(splitNLS/bipartiteNLS)的结构为两段正电顺序为 10个左右的氨基酸顺序问隔子(spacer)隔开,以爪蟾卵 的核质蛋白为代表.经典NLS的结构为:?核心 NLS由含4个赖氨酸或精氨酸的六肽构成;?不含酸 性氨基酸及大分子氨基酸;?核心NLS的旁侧为脯氨 酸或甘氨酸;?旁侧顺序中不存在疏水氨基酸以保证 NLS位于蛋白质分子表面_3J. 1.2非经典NLS 非经典NLS的结构和入核机制与经典NLS均不 相同,且呈异质性,所以至今没有明确的界定,但可举例 如下:?酵母Mata2的NLS正电含量少,但通过经典 的途径入核:?'M9'NLS来源于hnlLNPA1,为一段富 含甘氨酸的氨基酸顺序,可于核质问进行穿梭.其入核 机制与经典NLS不同,受体为karyopherin, importi的类似物而无需importin口和pl0t4;? 'KNS'的NLS来源于hnRNPK,其入核无需可溶性受 体和Ran的介导L5;另外上述两种NLS还具备出核信 号(Nucle~Lreportsingrml,NES)的作用;?非正电NLS 这类NLS仅含一个或不含碱性氨基酸,其入核作用可 能需其他顺序的帮助,如癌蛋白c—Jun的NLS;? 19MroH.YoneharaS,BonavldaB.nat.CancerRes.1993.53:259120FeamheadHO,MeCurr aehME.NeillJ,a/.GenesDev,1997.11 1266 , 311