【doc】 半乳糖基转移酶基因并敲入HLA-G1基因的打靶载体构建

【doc】 半乳糖基转移酶基因并敲入HLA-G1基因的打靶载体构建 半乳糖基转移酶基因并敲入HLA-G1基因 的打靶载体构建 24卷4期 2005年8月 中国生物医学工程 ChineseJournalofBiomedicalEngineering Vo1.24No.4 August2005 敲除猪.)’1,3.半乳糖基转移酶基因 并敲入HLA.G1基因的打靶载体构建 周健林爱星陈永福. (中国农业大学生物技术国家重点实验室,北京1OOO94) (首都医科大学附属天坛医院,北京100050) 摘要:本实验室已克隆到猪al,3一半乳糖基转移酶基因(al,3-GT,第九外显子不全).其中pMD一3arm载体上有 5.0kb的片段,该片段包括了小部分第8外显子,完整的第8内含子和一部分第9外显子.本实验中利用LA.PCR 的方法,从猪的基因组中获得约2.0kb的猪al,3-GT的第9外显子序列的扩增产物,将片段克隆于pGEM.Teasy载 体.将5.0kb和2.0kb片段分别作为打靶载体的5,3同源臂,以neo为 正选择标记基因,以GFP为负选择标记基 因,构建敲除猪al,3一半乳糖基转移酶基因并同时能达人白细胞 抗原HIA.Gl基因的的打靶载体PZJ.经酶切图 谱和测序结果的鉴定成功地构建出敲除猪al,3.半乳糖基转移酶基因 并同时能表达人白细胞抗原HIA.Gl基因的 正负双向选择的打靶载体,为异种器官移植提供了很好的探索. 关键词:al,3-半乳糖基转移酶基因;基因打靶;人白细胞抗原HLA—GI ConstructionofTargetingVecterforHLA?G1GeneKnock?—inand al.3?galactosyltransferaseGeneKnock?out ZHOUJian一LINAi—XingHCHENYong—Fu (NationalKeyLaboratoryforAgro-biotechnology,ChinaAgricultureUniversity&ng,100094) tCapitalUniversityofMedicalScs&itiantanHospital,8ei100050) Abstract:Wehavepreviouslyclonedporcinectl,3一 galactosyltransferasegenomicgene,whichincludespartsofthe exonVi,thewholeintronViandpartoftheexonIX.Inthisexperiment,wehavecIonedthesegmentof2.0kbeXOn IXfromporcinegenomebyLA—PCRmethod,whichwasclonedintopGEM —TeasyvectorandidentifiedbyDNA sequencing.Bytakingthesegmentsof5.0kband2.0kbas5’and3’homologoustargetingarmrespectively,the plasmidpGEM一 5zfasbasicvector,theneogeneaspositiveselectedmark,theGFPgeneasnegati veselectedmark, weconstructedthegenetargetingvectorpZJaccordingtOthestrategyofpositi ve—negativeselection(PNS),inwhich ctl,3一galactosyltransferasegenewasexpectedtobeknockedoutandHIA—G1genewasexpectedtobeexpvessed. Thegenetargetingvectorwasidentifiedbye~ymicdigestionandDNAseque ncing.Theresearchworkprovidedan explorationforXenotransplantation. Keywords:al,3一galactosyhransferasegene;genetargeting:HlA—G1 中图分类号R318文献标识码A文章编号 0258—8021(2005)04.0498—05 引言 基因打靶(genetargeting)也称为基因定点同源 重组(site—specifichomologousrecombination)技术通常 是用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中 序列相同或非常相近的基因发生同源重组,定点整 合至受体细胞基因组中并使该基因表达缺失或表达 一 种外源基因.1985年,首次证实的哺乳动物细胞 收稿日期:2003.1l-25. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30370726)资助,863 (2001AA206311). *通讯作者:E.mail:linaix@cau.edu.cn. 4期周健等:敲除猪a1,3.半乳糖基转移酶基因并敲入HL一Gi基因 的打靶载体构建 中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础. 自1987年,首次利用小鼠胚胎干细胞(ES)技术建立 了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hrpt)基因敲除的动物 模型以来,基因打靶技术在小鼠上得到广泛的应 用.然而大动物由于未能得到ES细胞而无法实现 同样的操作.随着多莉羊的诞生,体细胞克隆技 术结合体细胞基因打靶技术使得大动物外源基因定 点打靶成为现实,可供异种器官移植研究用的al,3一 GT基因敲除猪也已问世,al,3一半乳糖表位(al,3一 Ga1)是一种只存在于人类,猿和旧世界猴体内的糖 缀合物,其末端al,3半乳糖苷是通过al,3一半乳糖 转移酶催化转移来的.它是引起人体天然抗体介导 的超急性排斥的主要因素.本研究在构建al,3一 GT基因敲除载体的同时,引入了可克服NK细胞介 导的延迟排斥反应的HLA—Gl基因,以便获得敲除 dl,3-GT并敲人HLA—Gl基因的猪体细胞.并观察 其抗人血清中异种天然抗体攻击的能力,为今后克 隆出表达HLA.Gl不表达al,3-GT基因的个体猪提 供可以真正用于临床的异种器官打下基础.此外, 猪体细胞基因打靶技术的建立将为其他转基因动物 研究,如乳腺生物反应器的研究中,在细胞阶段的基 因操作提供有益的参考,也将为转基因的表达调控 研究提供必要的积累. 1材料和方法 菌株和载体 大肠杆菌DH.TOPO10菌株购于天为时代公 司,pEGFPIRESneo载体由范保良博士惠赠,pcDNA— HLA.Gl载体由北京大学医学部周春燕教授惠赠, pGEM-Teasy载体购自Promega公司.pGFP.7, pMD.3arm载体,pGEM.5zf载体由本实验室提供. 试剂和酶制剂 PCR引物,T4DNA聚合酶,T4DNA连接酶,内切 酶,dNTP等购自TaKaRa,上海生工,Promega以及华 美生物工程公司. 猪基因组的提取 用常规方法从猪肝脏中提取基因组DNA. 用特异引物扩增猪al,3.半乳糖基转移酶基因片段 根据猪al,3.半乳糖基转移酶基因cDNA的序 列一对引物 弓I物l(5CCTGACGAGTTCACCTACGAGA3) 弓I物2(5TGTAAGCTTAGAATTGAAGAGTAGGAGG CCC3) 用于扩增第9外显子 扩增反应条件参照DNAMAN软件设计的得出的 结果. PCR产物的序列测定及同源性 将克隆产物克隆到pGEM—Teasy载体命名为 p1.9T.并对阳性克隆进行序列测定.通过BLAST 基因比较,同源性达到99%以上. 负筛选标记GFP基因的插入 用内切酶Hind?和sph1分别切p1.9T和 pGFP7,将从pGFP.7的酶切片段中回收1.9kb的 片段(包含启动子CMV的GFP)克隆到p1.9T的多 克隆位点.命名为PPG. 5同源臂的插入 用SalI和NsiI切pGEM一5zf和pMD一3arm载 体,见图3.将从pMD一3arm载体的酶切片段中回收 的5.0kb的片段(包含猪al,3一半乳糖基转移酶基因 的一部分第9外显子和大部分的第8内含子)克隆 到pGEM一5zf载体上,命名为p5zf-5arm. 3同源臂的插入 用SalI和ApaI切p5zf-5arm和PPG两个载体, 将从PPG载体的酶切片段中回收的近4.0kb的片段 (包含猪al,3.半乳糖基转移酶基因的大部分第9外 显子和负筛选基因GFP)克隆到p5zf-5arm载体上, 命名为p5zf-5arm.PPG. HLA.Gl表达载体的构建 用NruI和NotI切pcDNA.HLA.Gl和 pEGFPIRES.neo载体,将从pcDNA.HLA.Gl载体的酶 切片段中回收的1.9kb的片段(包含启动子CMV的 HIJA.G1基因)克隆到pEGFPIRESneo载体上,命名为 pEGFPIRESneoHLA载体. HLA.Gl基因的插入 用EcoRV和SalI切p5zf-5arm.PPG.用NruI和 SalI酶切pEGFPIRESneoHLA载体,将从 pEGFPIRESneoHLA载体上酶切回收的近4kb的片 段(包含CMV,HLA.G1,IVS,IRES,neo,polyA)克隆 到p5zf-5arm.PPG载体上去,得到基因打靶载体,命 名为pZJ. 打靶载体的线性化 用PvuI酶切打靶载体pZJ使之线性化,过柱 纯化. 结果 猪基因组的提取 提取的猪基因组DNA用0.7%的琼脂糖凝胶 电泳检测.其完整性大于20kb,说明DNA的完整性 和纯度都符合PCR的要求. 500 中国生物医学工程 猪a1,3一半乳糖糖基转移酶基因部分片段的扩增和 克隆. 用引物P1,P2扩增得到猪a1,3一半乳糖基转移 酶基因第九外显子的约2.0kb的片段,并将其克隆 到pGEM—Teasy载体上,命名为p1.9T.用Hind?单 切质粒p1.9T,得到一个4.9kb的片段,用EcoRI切 质粒p1.9T获得1.9kb和3kb的两个片段,用pstI 切获得1.7kb和3.2kb的两个片段,酶切分析表明 连接正确(图1)测序结果进一步验证了其正确性: 同源性大于99%(序列图略). bp 2l22— 5148/4973— 353O一 2027?-一 l587— 94l— bp 一 23l3 ?一 6557 — 436’ 一 2322 图1p1.9T重组质粒载体的酶切鉴定 1.kDNA/EcoRI+Hind?;2.p1.9T/psfl;3.p1.9T/EcoRI;4.p1.9/ Hind?:5.kDNA/Hind? PPG重组质粒载体的酶切鉴定 分别用salI,HindUI酶切p1.9T和pGFP.7zf质 粒的重组质粒PPG,均应获得6.9kb的片段,用sph 工和xhoI双酶切得到2kb和4.9kb的两个片段,见 图2. bp 23l30m 6557—— 436l—— 2322..—— 2027—— bp 一 2l22 — 5l4/4973 — 353O ..一 2027 一 l587 —— ‘375 —— 94’ 图2PPG重组质粒载体的酶切鉴定 1.XDNA/Hind?;2.PPG/Hlnd?;3.PPG/SalI;4.PPG/sphI+xho I:5.kDNA/EcoRI+Hind? p5zf-5arm重组质粒的酶切鉴定 用SalI切pGEM一5zf和pMD一3arm质粒(图3) 的重组质粒p5zf-5arm应获得8kb的片段,用sphI 能得到两个片段:lkb和7kb;用EcoRV和SalI双酶 切能得到800bp和7.2kb的两个片段,见图4. p5zf-5arm—PPG重组质粒的酶切鉴定 2l227— 48/4973—— 3530— 2027—— I375— 94l一 图3pMD.3arm质粒图谱 一 23l3 — 9416 — 436l p5ZG5am~重组质粒 图4酶切鉴定 I.kDNA/EcoRI+HindII:2.p5zf-5arm/sphI;3p5zG5arm/EcoRV +SalI;4p5ff-Sann/S~I;5.XDNA/HindI11 用EcoRV可以将p5Zf-5arm和PPG质粒的重组 质粒p5zf-5arm—PPG切成单个l1.7Kb的片段,用Nsi I切应获得3.4kb和8.3kb的两个片段;用sphI切 可获得5.0kb和6.7kb的两个片段,见图5. bp 23l3O一 94l6— 6557—— 4361一 bp 一 2l227 — 5l48/4973 —— 4269 图5p5zf-5arm.PPG重组质粒的酶切鉴定 1XDNA/Hind?;2.p5~-5aml—PPG/sphI;3.p5zf-5amJ-PPG/N~I 4.p5zf-5arm—PPG/EcoRV:5.XDNA/EcoRI+HindII1 HL一G1表达载体pEGFPIRESneoHLA的酶切鉴定 用xhoI单切pEGFPIRESneoHLA载体可获得一 个6kb的片段,用BamHI和EcoRI双切可以把已经 连上的HLGl基因切下来,应获得约1kh及5kb的 两个片段,见图6. 基因打靶载体pZJ的酶切鉴定及序列分析 打靶载体pZJ的构建是将含有HLAGI基因的 4期周健等:敲除猪.l,3一半乳糖基转移酶基因并敲入HLA—GI基因的打靶载体构建 片段插入到已构建好的重组质粒的EcoRV和SalI 的位点,一平一粘定向连接,构建好的重组质粒全长 15.5kh.用salI单切pZJ载体能切出一个15.5kb 的片段,用Pvul单切应获得1.1kh和14.4kb的两 个片段;用NsiI单切应获得三个片段:3.4kb; 5.3kb;6.8kb,见图7.进一步对连接位点附近的序 列进行测序表明:连接完全正确(测序图略). bp !l!17— 5l48/4973— 3530— 1587— 94l一 图6HLA-G1表达载体pEGFPIRESneoHLA的酶切鉴定 1XDNA/EcoRI+Hind?;2.pEGFPIRESne0HLA/xho工 3.pEGFPIRESneoHLMBamH[+EcoRI;4kDNA/Hind?; 5.pEGFPIRESneoHLA质粒 5l48/4973— 4269?—— 2027?—— 1375一 图7基因打靶载体pZJ的酶切鉴定 1.XDNA/EcoRI+HindI11;2.pZJ/Pvul;3pZJ/NsiI;4.pZJ/SalI; 5.kDNA/Hind;6.DZJ质粒对照 打靶载体结构示意图 ==5arillClIIVHLA-G11VSIRESneopolyA3armGFP 基因打靶 exonl×clnvHLA—GIIVSIRESneopolyAcxonlX CMV:启动子;IVS:合成内含子;IRES:内部核糖体进入位点;neo 新霉素磷酸转移酶基因exon:外显子(exon);GFP:绿色荧光蛋白 HLA.G1:人白细胞抗原G1 2分析和讨论 猪脏器目前被认为是异种器官移植的首选动 物.异种器官移植面临的免疫学障碍表现为超急 性排斥反应(HAR),急性血管排斥反应(DXR),细胞 介导的排斥反应和慢性排斥反应.超急性排斥 反应是由于人体血清中有2%IgM和IgG为aGal天 然抗体(XNA),人一猪之问器官移植时,XNA与a— Gal发生特异性结合形成免疫复合物而触发的. DXR则涉及大量炎症反应的细胞和因子及相关的 基因的激活和表达.急性细胞性反应和慢性反应 目前研究表明主要由天然杀伤细胞(NK)所致,其活 化及介导的异种细胞毒作用是异种移植的直接障碍 . 在猪一人异种移植中,NK细胞被认为参与了排斥 反应,以内皮活化,直接的靶细胞裂解为特征”. a—Gal在异种移植排斥反应中发挥重要的作用,在 HAR中猪器官血管内皮细胞上a—Gal与人体内的天 然抗体IgM和IgG结合,通过补体经典途径激活补 体活化血管内皮细胞引起一系列病理改变,通过与 天然抗体的结合进一步介导了DXR,参与了细胞识 别异种内皮细胞的过程. HLA—G属于非经典的HLA—I类抗原,表达于胎 盘母胎界面,在移植耐受中发挥作用.HLA—G可与 NK细胞或细胞毒T细胞(CTL)表面的杀伤细胞抑 制性受体(KIR)结合,继而启动细胞内抑制性信号 传递通路,抑制NK细胞和CTL的细胞毒效应”, 且HLA.G分子的参与有助于提高移植受者生存率. 目前国际上尚未有在敲除a1,3-GT的同时敲入 HLA—G1基因的研究报道.国内未见发表的有关敲 除a1,3-GT的报道.鉴于长远的考虑,本实验在构 建打靶载体中同时考虑到了超急性排斥反应和慢性 排斥反应.在敲除a1,3-GT细胞中,人白细胞抗原 HLA—G1的表达将为抑制慢性排斥反应提供了很好 的探索. 本实验所选用的同源序列全长6.5kb,左臂 4500bp,包括部分第8内含子,小部分第9外显子, 同源右臂2000bp,包括大部分第9外显子,两段同源 序列与靶基因同源性均在98%以上完全满足打靶 载体对同源臂的要求.该打靶载体将敲除a1,3.半 乳糖基转移酶基因的第9外显子(a1,3半乳糖糖基 转移酶基因的酶催化活性中心)从而达到使a1,3.半 乳糖糖基转移酶基因失活的目的.在所构建的基因 打靶载体中,[1eo基因有双重的作用,一方面形成靶 位基因的插入突变,同时又作为正向筛选的标记;采 用GFP为负选择基因,GFP基因可在蓝光激发下发 出绿色荧光.无需其他蛋白或辅助因子参与,在荧 光显微镜下可直接观察到,这就避免了常规筛选中 药物筛选时对细胞的损伤,同时也能有效的起到富 集细胞的作用.尽管也存在随机整合插入DNA时 502中国生物医学工程24卷 只造成GFP基因被破坏的可能,但这种可能性极 低,因为通常外源基因的整合是多拷贝串联的形式 整合;neo基因通过内部核糖体进入位点(IRES)连 于HLA.G1基因下游,这样可确保在使用同一启动 子(CMV)下进行表达,同时只要细胞可在G418筛选 培养基下存活(表达了neo),也可初步表明上游的 HLA.G1基因也得到了表达.线性化的打靶载体用 电转化法分别导入猪的胎儿成纤维细胞和血管内皮 细胞,阳性细胞的筛选和鉴定工作正在进行之中. 参考文献 [2] [3] [4] [5] SimithiesO,GreggRG,BoggsSS,eta1.InsertionofDNAsequencds intothehumanchromosomalbetaglobinlocusbyhomologous recondoinationlJJNature,1985,317(6034):230—234. 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