目的基因在原核细胞中的表达

目的基因在原核细胞中的达 （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳 简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺 凝胶是由单体的丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰氨聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用 的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％ －30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可 用于平板等电聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。 （二）诱导表达原理 IPTG与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使乳阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵 子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。 1.仪器用具：垂直电泳槽、电泳仪、eppendorf管、微量移液器、枪头、微量加样器、25ml烧杯、直径20cm 培养皿、量筒、容量瓶、试剂瓶、单面刀片、蛋白Marker； 2.试剂：含目的基因表达载体的M15菌株，Amp， Kana，LB液体培养基，SDS、丙烯酰胺、N,N-亚 甲基双丙烯酰氨、Tris、甘氨酸、HCl、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、甘油、溴酚蓝、甲醇、乙酸、NaOH。 3.需配试剂 （1）4×Tris.Cl/SDS pH8.8 300mlHO中溶解91gTris碱，用1mol/L HCl调校至pH8.8，补加HO至整体积为500ml，加入2g SDS，22可4?保存一个月。 （2）8×Tris.Cl/SDS pH6.8 40mlHO中加入6.05gTris碱，用1mol/L HCl调校至pH6.8，补加HO至整体积为100ml，加入0.4g SDS， 224?保存。 （3）2×SDS 加样缓冲液 25ml 4×Tris.Cl/SDS pH8.8 20ml 甘油 4g SDS 200mg 溴酚蓝 加HO至100ml，混匀 2 （4）SDS电泳缓冲液 5× 15.1g Tris碱 72.0g 甘氨酸 5.0g SDS 加水至1000ml,用前稀释至1×SDS电泳缓冲液 （5）10%过硫酸铵（AP）(现用现配) 10g过硫酸铵，加水至100ml （6）30%聚丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙稀酰氨 丙烯酰胺 29g 甲双丙稀酰氨 1g O 100ml 2H避光4?保存 （7）考马斯亮蓝染色液 50%（v/v）甲醇 0.05%（v/v）考马斯亮蓝R-250(Biorad 或 Pierce) 10%（v/v）乙酸 40% 水 用去离子水配制 在加乙酸和水之前应将考马斯亮蓝R-250溶于甲醇。溶液可保存6个月。 （8）脱色液 7%（v/v）乙酸 5%（v/v）甲醇 88%水 4.聚丙烯酰胺分离胶与积层胶制备 分离胶 贮液 分离胶中丙烯酰胺的终浓度（%）（ml） 5 6 7 7.5 8 9 10 12 13 15 30%聚丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙稀酰氨 2.50 3.00 3.50 3.75 4.00 4.50 5.00 6.00 6.50 7.50 4×Tris.Cl/SDS pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 HO 8.75 8.25 7.75 7.50 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75 2 10%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 四甲基乙二胺（TEMED） 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 （1）分离胶的制备（15ml） 25ml烧杯中，混匀7.50ml 30%聚丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙稀酰氨，3.75ml pH8.8的4×Tris.Cl/SDS缓冲液 和3.75ml水，加入过硫酸铵50ul和TEMED 10ul，摇匀，立即使用。 （2）积层胶（3.9%丙烯酰胺,5ml） 25ml烧杯中，混匀0.65ml30%聚丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙稀酰氨，1.25mlpH6.8的4×Tris.Cl/SDS缓冲液和水，补足5ml后，加入25ul过硫酸铵和5ul TEMED，摇匀，立即使用。 凝胶不能固化的问题出在过硫酸铵、TEMED或二者兼有。 1. 凝胶的灌制 （1）在洗涤干净的两块玻璃板间夹以垫条，两块玻璃间隔约0.75mm，制成模具，将玻璃板的三个边沿夹缝用胶带密封好，以防灌胶时渗漏。 （2）将配好的分离胶快速充分混匀后迅速灌注，高度占模具高度的70%。 （3）在分离胶上小心加入一层水或水饱和的异丁醇，以隔绝空气和防止形成气泡，在室温下放置45min 等待聚合完全。 （4）小心吸出水或异丁醇（可以倒出），用蒸馏水清洗凝胶顶部。 （5）将配制好的积层胶混匀后小心灌注在已聚合的分离胶上，立即在积层胶溶液中插入梳子，待积层胶聚 合后，小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳缓冲液冲洗加样孔。 2.蛋白质待测样品的制备 （1）将含目的基因表达质粒的M15菌株于含抗生素（Kana50 mg/l和Amp100 mg/l）液体LB培养基中过夜培养； （2）取1ml培养基于20ml含抗生素的LB培养基中至OD600达0.6~0.8时，向培养液中加入IPTG(终浓度为1mM)诱导目的基因的表达。 （3）分别于诱导1h、2h、3h、4h、5h时收集1ml菌体,12000 rpm/min离心2min，弃上清。 （4）加入加样缓冲液40-50ul,混匀。 （5）用时煮沸10 min，离心，取上清使用。 3.加样 用100ul加样器于加样孔中加入蛋白质样品，对照孔中加入蛋白质分子量混合物，如有空置的加样孔， 需加等体积的1×SDS加样缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。 4.电泳 （1）接通电源，先在10mA电流下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电流调至15mA继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。 （2）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液，取出凝胶夹层。 （3）将凝胶定位以识别加样的顺序，取下凝胶，放入表面皿中，除去浓缩胶，在凝胶的一角切去一小块作 为标记。 5.染色 用考马斯亮蓝R-250染色3小时，用水漂洗几次 6.脱色 用配置好的脱色液进行脱色，直至蛋白区带清晰，胶体呈现透明即可 1.分离胶、基层胶的浇灌以及加样时都不能有气泡出现； 2.制备完分离胶后，在上面加上一层水，使胶体表面平滑无气泡； 3. 脱色一夜之后，胶仍呈现红色，推测为染色剂考马斯亮蓝加入过多，染色时间过长，并且用脱色剂进行 脱色时未盖盖子，乙酸分解，导致脱色不彻底；再次进行脱色后，得到透明胶体。 1.从右往左数，依次为样品0h，1h，2h，3h，4h，5h，mark，对照0h，1h，5h。 2.已知目的蛋白分子量为18kb，在样品泳道处可见有颜色浓重的一道，根据mark蛋白区带的排列，可知欲分离的目的蛋白位于mark蛋白分子量14kb和20kb之间，说明目的蛋白被正确的诱导，得到表达。 3.观察样品条带，样品0h无目的蛋白表达，且随着诱导时间的增加，颜色有加深的趋势，但是趋势不是很 明显，可知时间越长，IPTG诱导目的蛋白表达量越多。 4.对照处由于未加IPTG，故在18kb处没有条带，也证明了目的蛋白在没有诱导剂的情况下不能表达。 5.与第一组相比，其对照组随着0h，1h，5h时间的增加，尽管在18kb处无条带，但是其他表达蛋白条带 的颜色有加深趋势，是其他蛋白随培养时间的加长表达量增多，但此现象在本组不明显。