冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基清除作用的实验研究

冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基清除作用的实验研究 冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子 自由基和羟自由基清除作用的实验研究 张小强箜奎虫夏草人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基清除作用的实验研究第 11期 冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和 羟自由基清除作用的实验研究 张小强浦跃朴尹立红仲伟鉴(东南大学公共卫生学院,江苏南京210009) ?773? (摘要]目的研究冬虫夏草及三种人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除作 用.方法采用邻苯三酚自氧化体系产生超 氧阴离子自由基,研究冬虫夏草及三种人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基的清除作用;利 用Fenton反应产生羟自由基,研究冬虫夏草及三种人工 虫草菌丝体对羟自由基的清除作用,同时比较四种样品对超氧阴离子自由基和羟自由基的 清除能力.结果冬虫夏草,蝙蝠蛾拟膏霉,虫草头孢菌和 蝙蝠蛾被孢霉对超氧阴离子自由基和羟自由基均有清除作用(P<O.05);四种虫草样品对 超氧阴离子自由基的清除能力弱于超氧阴离子自由基特异 性清除荆抗坏血酸(P<O.05);对羟自由基的清除能力弱于羟自由基特异性清除荆【)-甘露 醇(P<O.05).结论冬虫夏草及三种人工虫草菌丝体对 超氧阴离子自由基和羟自由基均有清除作用;虫草素和C甘露醇是虫草中对自由基具有清 除作用的有效组分之一,虫草素主要发挥对超氧阴离子自 由基的清除作用,而对羟自由基的清除作用是虫草素和D一甘露醇共同作用的结果. (关t词]冬虫夏草;虫草菌丝体;自由基 [中圈分类号]RI$1.3[文献标识码]A[文章编号]1005—9202(2003)11—0773—03 Studyonthescavengingeffectonsuperoxideanionfreeradicalandhydroxylfreeradicalofcordycepsine nsisandmyceliumof culturedcordycepssinensis ZHANGXiao—qiang,PUYue—pu,YINLi—hong,eta1. (PublicHealthSchool,SoutheastUniversity,Jiangshu,Nanjing210069) [Abstract]ObjectiveToexplorethescavengingeffectsofCordycepssinensisandmyceliumofcultured Cordycepssinensison superoxideanionfreeradical(SAFR)andhydroxylfreeradical(HFR).MethodsSAFRwaspruducedby 1,2,3-benzentriolauto- oxidationsystemsandHFRwaspruducedbyFentonreaction.ThescavengingeffectsofCordycepssine nsisandmyceliunofcultured CordycepssinensisonSAFRandHFRweredeterminedandcomparedbyspectrophotometer.ResultsAl loftheCordycepsinensis, Paecilomycessinensis,CephalosporiumsinensisandMortierellasiensiscouldscavengSAFRandHFR (P<0.05),butthe scavengingeffectsonSAFRofthesefoursampleswereweakerthanthoseofascorbicacidandthecleanin gouteffectsonHFRof thesefoorsampleswerealsoweakerthanthoseofD—mannitol(P<0.05).ConclusionsCordycepsine nsisandthreekindsof myceliumofculturedCordycepsinensisallcouldcleanoutSAFRandHFR.Theeffectivecomponentsof scavengingfreeradicalsin CordydepssinensisandmyceliunofculturedCordydepssinensiswereCordycepinandD—mannito1.S AFRwasscavengedby CordycepinandHFRwascleanedoutbybothCordycepinandD-mannito1. [Keywords]Cordycepssinensis;myceliumofculturedCordycepssinensis;freeradical 许多疾病的发生与活性氧自由基反应有关,特别是与自由 基引发的脂质过氧化反应有关.这些异常的自由基反应可以由 生理条件下产生的自由基引发,也可由外源性化学剂或由物理 性电离辐射所致的自由基引起,适当补充外源性抗氧化剂或给 予能促进机体内源性抗氧化剂恢复到一定水平的药物可使各 种损伤有所改善.由于这些原因,国内外学者积极从事筛选具 有清除氧自由基和抗脂质过氧化功能的有效药物m.目前,临 床证实有效且应用较多的仅有维生素C,维生素E及D一甘露醇 等.本实验探讨了冬虫夏草及3种人工虫草菌丝体对超氧阴离 子自由基(SAFR)和羟自由基(HFR)的清除作用,旨在为人工 虫草菌丝体的广泛应用提供理论依据. 1材料与方法 1.1材料冬虫夏草,蝙蝠蛾拟青霉,虫草头孢菌,蝙蝠蛾被 基金名称:上海市科技发展基金(004319023) 1上海市疾病预防控镧中心 作者简介:张小强(1968-),男,顼士,研究方向:食品毒理与功能食品 孢霉(上海市药材公司提供,冬虫夏草为西藏产),三胺基甲烷 (tris)(分析纯,中国医药集团上海化学试剂公司),邻苯三酚 (分析纯,遵义市第二化工厂),番红花红(safranineT)(华东师 范大学化工厂),腺苷,虫草素,【).甘露醇(SIGMA公司),维生 素C,过氧化氢,盐酸,硫酸亚铁,EDTANa磷酸二氢钾,磷酸 氢二钠(均为国产分析纯). 1.2方法 1.2.1仪器752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器 厂),722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂). 1.2.2样品预处理将冬虫夏草及三种人工虫草菌丝体粉碎 后的样品各5g,分别用滤纸筒包好,置于索氏提取器中,乙醚 抽提2,3h,残渣再用甲醇抽提6,8h,收集甲醇提取液,过滤, 滤液减压浓缩至干,双蒸水溶解,并定容至25ml.样品液经 0.45pm滤膜过滤,备用. 1.2.3冬虫夏草及人工虫草菌丝体对SAFR清除作用的测定 取0.05mol/L,pH8.2的Tris—HCl缓冲液4.5ml于试管中, 置25?水浴中预热20min.分别加入不同浓度的待测品0.1ml ?774? 后均加入2.5mmol/L邻苯三酚(由10mmol/LHCI配制)O.4 ml,混匀后25?水浴中准确反应4rain,立即加入8tool/LHCI 2漓终止反应,蒸馏水调零,在299nlTl处测定吸光度.空白组以 0.1ml蒸馏水代替样品试液.按以下公式计算SAFR清除率 (清除率一(A空白一A样品)/A空白×100%]. 1.2.4冬虫夏草及人工虫草菌丝体对HFR清除作用的测定 取0.15mmol/L,pH7.4磷酸缓冲液1ml,40~g/ml番红花红 1ml,30A过氧化氢1ml(新鲜配制),0.945mmol/LEDTA—Fe (I)lml(新鲜配制),供试样品0.5ml,混合后在37?水浴中反 应30rain后在520nlTl处测吸光度.空白组以0.5ml蒸馏水代 替待测样品,对照组以1.5ml蒸馏水代替EDTA—Fe(1)和供 试样品,蒸馏水调零,测各组吸光度,按以下公式计算HFR清 除率[清除率一(A样品一A空白)/(A对照一A空白)× 100]. 2结果 2.1冬虫夏草及人工虫草菌丝体对SAFR清除作用见图1,表1. 一 静 篮 延 药物浓度(mg/m1) 图1冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基的影响 表1冬虫夏草,蝙蝠蛾拟青霉,虫草头孢菌,蝙蝠蛾被孢霉, 虫草素,抗坏血酸对SAFR清除作用ECso的结果(mg/m1) 图1表明,冬虫夏草,蝙蝠蛾拟青霉,虫草头孢菌,蝙蝠蛾被 孢毒均对SAFR具有清除作用,并且四种虫草样品对SAFR的 清除作用均弱于虫草紊和SAFR的特异性清除剂抗坏血酸.对 SAFR的清除作用以抗坏血酸的半数有效浓度(EC.)最低,比 较4种虫草样品的SAFR清除作用的EC.可以发现,冬虫夏草 的EC.低于3种人工虫草菌丝体.但四种虫草样品EC.的95 CI发生重叠,说明4种虫草样品对SAFR的清除能力无显着性 差异;虫草素和抗坏血酸EC.的95CI发生重叠,说明虫草紊 和抗坏血酸对SAFR的清除能力无显着性差异;但4种虫草样 中国老年学杂志2003年11月第23卷 品与虫草紊和抗坏血酸EC.的95CI未发生重叠,说明4种虫 草样品对SAFR的清除能力弱于虫草紊和抗坏血酸.特别应引 起注意的是,虫草紊对SAFR的清除作用的ECs.为1.94rag/ ml,清除能力很强,可以推测虫草紊是虫草中具有抗氧化作用 的有效组分之一,也说明了冬虫夏草对SAFR的清除能力较 强,可能与其虫草紊的含量较高有关. 2.2冬虫夏草及人工虫草菌丝体对HFR清除作用见图2,表2. 9O 8O 70 — 60 50 祷 篮4o 蜒30 20 lO 0 药物浓度(mg/m1) 图2冬虫夏草及人工虫草菌丝体对羟自由基的影响 图2的结果表明,冬虫夏草,蝙蝠蛾拟青霉,虫草头孢菌,蝙 蝠蛾被孢霉均对HFR具有清除作用,并且4种样品对HFR的 清除作用均弱于HFR的特异性清除剂I)-甘露醇. 表2冬虫夏草,蝙蝠蛾拟青霉,虫草头孢菌,蝙蝠蛾被孢霉, 虫草素,D一甘露醇对HYR清除作用的EC秘结果(mg/m1) 冬虫夏草对HFR清除作用的EC50低于三种人工虫草菌 丝体,但四种虫草样品及虫草紊EC.的95CI发生重叠,说明 四种虫草样品及虫草紊对HFR的清除能力无显着性差异;但 四种虫草样品及虫草紊与I)-甘露醇EC.的95CI未发生重叠, 说明四种虫草样品及虫草紊对HFR的清除能力弱于D一甘露 醇.虫草紊对HFR清除作用的EC.为19.07mg/ml,但对清除 HFR仍发挥了一定作用,可以推测D一甘露醇与虫草紊是虫草 中对HFR具有清除作用的有效组分之一,并且以I)-甘露醇的 作用为主. 3讨论 机体在代谢过程中可以产生SAFR(0),HFR(0H),过 氧化氢(HO.)和单线态氧(O),这四种成分统称为活性氧.在 黄可几等量神液对老年性痴呆大鼠模型脑内神经递质的影响第11期 生理状态下,这些活性氧的产生和清除处于生理低水平的平衡 状态,适量自由基能促进细胞增殖,刺激白细胞和吞噬细胞杀 灭细菌,消除炎症,分解毒物.但在某些病理情况下无论何种原 因使这些活性氧代谢产物过量,即可引起生物膜多不饱和脂肪 酸发生脂质过氧化反应,损伤膜结构及功能,导致疾病的发生 或机体组织的损伤.机体内产生的自由基起主要作用的是 SAFR和HFR.它们可与多种物质发生氧化反应,而且可引起 一 系列连锁反应,产生新的自由基,进一步增强氧化反应,因而 研究对自由基有清除作用的药物具有非常重要的意义. 本实验发现冬虫夏草,煽蝠蛾拟青霉,虫草头孢菌,煽蝠蛾 被孢霉对SAFR和HFR均有清除作用,且四种虫草样品对 sAFR的清除能力均弱于SAFR的特异性清除剂抗坏血酸f对 如PR的清除能力弱于HFR的特异性清除剂【)-甘露醇.发现虫 草素对SAFR和如R均有清除作用,尤对SAFR的清除作用很 强,其EC接近抗坏血酸对SAFR清除作用的EC..,清除能力接 近抗坏血酸I而对如R的清除作用很弱,其对HFR清除作用的 EC..明显高于【)-甘露醇和四种虫草样品的EC;.,清除能力明显 弱于四种虫草样品,而腺苷未见到对SAFR和HFR有清除作 ?775? 用.可见,虫草素和【)-甘露醇可能是虫草样品中对自由基具有 清除作用的有效成分之一,其中虫草素对SAFR具有较强的特 异性清除作用,对HFR的清除作用较弱,而虫草样品中含有的 D一甘露醇本身就是HFR的特异性清除剂,所以可以推测虫草 对SAFR的清除作用来自于虫草素等组分,而对HFR的清除作 用是虫草素和D一甘露醇等组分共同作用的结果.推断虫草对自 由基的清除作用主要是其主要有效成分虫草素和【)-甘露醇共 同作用的结果. 4参考文献 1TodaS,KumuraM,OhnishiM.Effectsofphenolcarboxylicacids onsuperoxideanionandlipidperoxidationinducedbysuperoxide anion(J).PlantaMed,1991f57(1)l8-10. 2林童俊,刘耕冉,李小洁,等.黄皮酰胺抗脂质过氯化及对氯自由基 的清除作用(J).中国药理学与毒理学杂志,1992f6(2):97-102. 3潘世成,罗正瞳.病理生理学进展(三)(M).北京:人民卫生出版 社,1987:23. C2003—03—14收稿2003—05—12修回) 醒神液对老年性痴呆大鼠模型脑内神经递质的影响 黄可儿柯雪红陈为方永奇(广州中医药大学第一附属医院,广东广州510405) 周海坚(广西民族医院) (摘要)目的探讨量神液治疗老年性痴呆(AD)作用的神经生物学机制.方法采用I).半乳糖致亚急性衰老合并Mean基底校损囊建立 AD模塑大曩,定大曩脑皮质和海马区兴奋性氨基酸的含量,胆碱醇酶活力的变化,以及海马齿状回分子层突?病理性结构的影响.螬暴量神液 均显着性降低脑内皮质及海马的胆碱醇酶活力(P<O.05),降低谷氨酸(Glu),天门冬氨酸(Asp)的含量(P<0.05).螬论量神液可调节脑内神经递 质含量,对老年性痴呆有治疗作用. (关?词)量神液f老年痴呆f神经递质 (中?分羹号)R749.1+6(文t标识码)A(文章?号)1005-9202(2003)11.077S-02 兴奋性氨基酸,中枢胆碱能系统功能衰退与老年性痴呆 (又称Alzheimer’Sdisease,AD)的发病关系密切,测定与之相 关的指标在AD的实验研究中占有重要地位.围绕改善胆碱能 系统功能的中药复方研究开展较多,大多数通过补血,补气或 补髓而达到醒神益智目的,而用化痰开窍药较系统观察脑内不 同部位乙酰胆碱醋酶(AchE)的变化尚未见报道.本文采用D一 半乳糖致亚急性衰老作用”形成脑老化,再以鹅膏簟氨酸 (ibo~emcacidm0)损毁Meyert基底核0所致的AD大鼠模 型,观察醒神液对该AD模型大鼠脑皮质和海马区兴奋性氨基 酸的含量,胆碱醋酶活力的改变,旨在研讨醒神液治疗老年性 痴呆作用机制. 基金项目:广东省中医药管理局科研资金资助(101071) 作者简介:黄可)L(1962一),女,硕士.翻研究员,从事中药药理与新药研 究. 1材料与方法 1.1试药与仪器 1.1.1试药氨基酸对照品AminoAcidstadardH,AccQ. Flu0rTM缓冲液,AccQ.FluorW2A试剂粉(衍生剂:6.氨基酸喹 啉一N一羟基琥珀酰亚胺基一氨基甲酸醋),AccQ.Fluor~2倍稀释 液(均Waters公司提供)I乙腈(色谱纯),二次重蒸水,三水醋 酸钠(分析纯),三乙胺(分析纯).D-半乳糖:由Sigma公司提 供HBO:由Sigma公司提供I醒神液:由广州中医药大学第一附 属医院实验中心提供TCHE试剂:由南京建成生物工程研究 所提供. 1.1.2仪器美国惠普公司HP1O5O一高效液相色谱仪;美国 SIGMR公司3K30型离心机I瑞士梅特勒公司AE一200型电子 分析天平;惠普上海分析仪器有限公司6010紫外/可见分光光 度计. I.2动物与分组15月龄雄雌各半SD大鼠6O只,体重300,