生长激素释放激素在垂体生长激素瘤中的作用

生长激素释放激素在垂体生长激素瘤中的作用 生长激素释放激素在垂体生长激素瘤中的 作用 复里学 Un 搪 ivFudanUniv ' J 医 M 学 ed 版 Sc2..6Ju1.,33(4)i…',.463 生长激素释放激素在垂体生长激素瘤中的作用 沈烨胡吉张玉林王宣春陈凤玲刘瑜胡仁明 (复旦大学附属华山医院内分泌科一复旦大学内分泌研究所,附属华山医院病理科上海200040) 【摘要】目的探索Gsa和生长激素释放激素受体(GHRHR)基因突变和生长激素释放激素(GHRH)在生长 激素瘤形成中的作用.方法对26例垂体生长激素瘤标本用ABC免疫组化法观察GHRH及其受体在垂体生 长激素瘤细胞中的表达,提取组织DNA行PCR扩增并进行测序研究Gsa和GHRHR基因突变.结果免疫 组化显示GHRH阳性率为15.4%,GHRHR阳性率为30.8.2例Gsa突变在第201位,1例在第210位,总 突变发生率为11.5%;2例GHRHR基因突变在第225位.结论Gsa突变是生长激 素瘤发生的重要原因, GHRH在垂体瘤中阳性表达提示部分生长激素瘤可能分泌GHRH,并通过自分泌 或旁分泌作用于瘤细胞,导 致肿瘤的发生. 【关键词】生长激素瘤;生长激素释放激素;生长激素释放激素受体;Gsa 【中图分类号】R736.4;Q786【文献标识码】B GrowthhormonereleasinghormoneinhumanGH.secretingadenoma SHENYe,HUJi,ZHANGYu-lin.,WANGXuan-chun, CHENFen—ling,LIUYu,HURen—ming (DepartmentofEndocrinology-Insituteo,Ed0cr,l00量yandDiabetes, DepartmentofPathology,HuashanFlospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China) [Abstract]PurposeToinvestigateGsaandgrowthhormonereleasinghormonereceptor(GHRHR)muta— tionandthepossibleroleofGHRHintheformationofhumanpituitarysomatotrophadenoma.Methods Pituitaryadenomasfrom26patientswerestudiedforGHRHandGHRHRexpressionsbyimmunohis— tochemicalmethod.DNAwereextractedfrompituitaryadenomatissue,andtheproductsofPCR(Gs andGHRHR)weresequenced.ResultsWefoundpositivityexpressionofGHRHin4paraffin-em— beddedtissues(15.4)andGHRHRin8tissues(30.8).Threeofthe26GH— secretingadenomas hadpointmutationsincodon201or210,tWOincodon201andonewasincodon210;tWOmutationsof GHRHRweredetectedincodon225.ConelusionsGeneticabnormalitiessuchasGSamutation mightleadtotheformationofGH— secretingadenoma.ItwaspostulatedthatGHRHproducedbythe somatotrophadenomacellsmightplayaroleinthepathogenesisofGH— secretingadenomabyautocrine orpancrinemechanism. [Keywords]GH, secretingadenoma;growthhormonereleasinghormone;growthhormonerelea— singhormonereceptor;GSGt 生长激素瘤是常见的功能性垂体腺瘤,在临床 上因生长激素(growthhormone,GH)分泌过多,在 骨骺融合之前引起巨人症,在骨骺融合之后导致肢 端肥大症.肢端肥大症的人群患病率约40/百万, 每年新增病例约3,4例/百万[】].其死亡率为正常 人群的2,4倍,主要死亡原因为心脑血管,呼吸系 国家"973"子课项目(2002CB713703)资助 统疾病和恶性肿瘤.生长激素瘤的治疗方法主要为 手术,放疗和药物,但疗效均不够满意,复发率较高, 严重危害患者的身心健康.生长激素瘤的发病机制 尚不完全明确,本课题组已采用cDNA微阵列杂交 的方法,比较了生长激素瘤和正常垂体组织的基因 关系表达谱,发现瘤组织中生长激素释放激素受体 464复旦(医学版)2006年7月,33(4) (growthhormonereleasinghormonereceptor.GH— RHR)的表达显着升高,并经实时定量PCR证实. 本研究旨在探讨生长激素瘤组织生长激素释放激素 (GHRH)及其受体的表达以及Gsa,GHRHR基因 突变与肿瘤形成的关系. 材料和方法 病例来源我院2004年共26例肢端肥大症病 人,经手术证实为垂体腺瘤.标本石蜡切片,常规苏 木精一伊红(HE)染色,镜检. 免疫组化ACTH,GH,PRL,TSH,FSH,LH 多克隆抗体(兔抗人或小鼠抗人)购自AntibodyDi- agnostica公司(USA),GHRH多克隆抗体(山羊抗 人)购自SantaCruz公司,GHRHR多克隆抗体(兔 抗人)购自Abcam公司,二抗购自上海普飞生物公 司.标本经脱蜡,PBS洗脱,5小牛血清封闭后分 别加一抗和二抗,再经DAB显色和苏木精染色后 以中性树胶封片. 标本基因组DNA片段测序石蜡包埋的标本经 二甲苯,乙醇脱腊后采用Qiagen公司的Dneasy~Tis— sueKit提取基因组DNA.巢式PCR扩增GNAS (Gsa基因)第8,10号外显子引物如下:第一对5 ()GCTGTGAACA(?CCACGTGTr-3(sense, 1F)和5一CGCA0曰3GGTGGGCGGTCACT CCA-3(antisense,1R),退火温度为50?;第二对 5一GTGATCAAGCAGGCTGACTATGT(,r3 (sense,2F)和5一GCTGCTGGCCACCACGAA GATGAT一3(antisense,2R),退火温度为57?. GHRHR各外显子引物及反应退火温度见表1. PCR试剂采用Qiagen公司HotStarTaq@试剂盒, PCR仪为PTC一200(MJResearch,美国).PCR产 物经琼脂糖电泳后,采用Qiagen公司QIAquick GelExtractionKit纯化.采用ABI3730自动测序 仪进行测序,AutoassemblerforMac软件进行序列 比对. 表1PCR所需引物和退火温度 Tab1Primersandannealingtemperatures 结果 临床患者男性9例,女性17例,平均年 龄为41.42?13.36(i?s)岁,平均病程3.18?2.57 年,均具有较为典型的肢端肥大症状,其中有高血压 者5例,占19.23,有糖尿病者3例,占11.54. 术中所见肿瘤最大径1.51?1.09(i?s)mm,其中 侵袭性生长者有9例,占34.6.术前平均生长激 素水平为92.21?51.56(?s)ng/mL,平均IGF-1 水平为946.29?131.58(i?s)ng/mL. 免疫组化结果所有肿瘤组织GH染色阳性, 而PRL,FSH,TSH,ACTH等其他激素染色均为 阴性.GHRH染色:阳性4例,阳性率为15.4. GHRHR染色:阳性8例,阳性率为30.8.其中 蓝色为苏木精复染的核,棕褐色为DAB显色的 GHRH或GHRHR阳性结果(图1).图1A可见 在胞质内GHRH阳性显色呈颗粒状分布,提示垂 体生长激素瘤细胞能够自身合成GHRH;图1B可 见GHRHR阳性显色在胞质内弥漫性分布,其中箭 头所指为垂体瘤细胞特征性由双核构成的瘤细胞, 其胞质内充满GHRHR阳性颗粒,提示在部分垂体 生长激素瘤细胞大量合成GHRHR. 基因测序结果26例患者的肿瘤基因组DNA 经PCR扩增后直接测序发现3例Gsa基因突变,发 生率为11.5,其中2例编码Gsa201位氨基酸的 核苷酸顺序在一个等位基因中由CGT突变为 TGT,其编码的氨基酸也由精氨酸突变为半胱氨 酸;而另一等位基因仍为正常的CGT.1例组织基 因组DNA在Gsa210位纯合性突变,其核苷酸顺序 由ACC突变为GCC(图2).另外,发现2例基因组 DNA的GHRHR第7号外显子225位基因存在杂 合性突变,其编码的核苷酸顺序中同时存在正常的 GTC和突变的ATC,其中一个等位基因编码的氨 基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸. 忱蚪.等.}乏融蓑蜂挫融誊垂悼生K激素{卣-li约作? 囤J免疫担化法检测到的人垂体瘤组织中I}AB标记阳性细胞 nll1l1i,cullsrdh11rm~npitUilal'~fidpROfT~Lti,,uwiIh DAB;(jImm]XfilllillRI?li1icells)lX4IM}} ,-"IlIt?x?~…il_-iiit—llI】{-I?i1ll】kI,,lllI lIII【l'lll【i,?I'Ii0I.1.II:I一…lI-=.il:. I…121,eq~*t21lI_ WlIdnl'1J20IMiitatJonlh~lcrozygotc 图2生长激素瘤组织I)N,,Go基因第2lI)位和 第211l怔的测序结果 Fi2Mlitaliol!I】I.(;nincfI_n2llland 20iinGIt-secrt+lir~gadt'//o/Tla c,fcULlc『1cil 图j生长激素瘸组织l'A【:HR}1R基因 第225位的测序结果 Fig3~1ulation?订(I|RIlMinc~don225 in(H—serrt'liJ~adem~ma .寸沦 L公认.c.突变足叫.【乇蹴索瘤的发病 机制之{,蛋白是一组(TI】结台蚩白.参与跨II尊 信号转导史献报道十}乏激素1ts.的基因突 变的发生牢箍计较足.在白种人1发生率为17 , 4..日奉研究ll的报道发脱在乖悼瘤组织c{J c.突变半怄于5,一.认为发生率的l低可能受不 同地理环境和基因背景差昂的影响突变化专多 存第21}lft精氯玻_刊第227位的荇氮酰胺研究丝 示tu第,u外显于足(rTP腑比所必需,浚 域n{】突变可导致tn丧失(-1'P酶活性.使(蛋 白持续澈活,从而澈活腺簸环化酶c^L.引起 c'AMP合成增多.进Ifii通过AM1)PKA速径引起 磷酸化级聪反应.导致细『胞太蜒产生(H并促使 细胞增链水研究经删序发脱协J'H号外显子 f.2例(11E和I例21-)位突变.可能通过持续 活化AMPl'KA通路导致肿癌的形坡. (,HI{H山下丘脑弓状棱抻经元台战并释放^ 垂体门胨系统J舌.与垂体,E激素缃胞衷而的fH ItHR结合后.信号值过rAMrKA逢径放大, 下传.化选择rl:离子通道,细匏膜上概化,促进 钙离子内流和c川行泌'tHJtHR是一个具有了 1,穿撵的B妖(;蛋广l偶联受体.cHRHR的活化 『{突变可能与(;H瘤的发发展仃戈.前在生长 激素渲巾已经发现_r多个核背睦序扪J的政变.但 ======一.从 复旦(医学版)2006年7月.33(4) 是除了两个位点外,大部分不会增加活性.其中一 个是A57T基因多态性[7],在转染细胞株中会增加 cAMP对GHRH的反应性;另外一个是M422T突 变L8],基础cAMP和GHRH刺激后的cAMP水平 均升高,从而促使细胞分泌GH增多及细胞增殖, 但此种突变发生率很低(<1),提示是导致生长激 素瘤的少见原因.我们检测了26个生长激素瘤组 织基因组DNA的GHRHR8个外显子,发现GH— RHR基因在第225位发生基因突变,编码的氨基酸 由缬氨酸突变成异亮氨酸.GHRHR基因的上述 突变是否会导致cAMP/PKA通路的持续活化尚需 进一步研究证实. 本课题组已报道[9采用eDNA微阵列杂交和 定量PCR研究观察到生长激素瘤组织中GHRHR 较正常垂体表达显着升高.本研究组用免疫组化的 方法观察到约1/3生长激素瘤组织中GHRHR有 较高表达(30.8),提示GHRHR表达量的多寡可 能与肿瘤的发生有一定关系.本研究组还观察到4 例垂体瘤组织中GHRH阳性反应,这些GHRH阳 性颗粒位于胞质内,呈颗粒状或弥漫性分布,而在正 常情况下,GHRH是由下丘脑合成,促进垂体生长 激素细胞的增殖[1..,提示在少数情况下,生长激素 瘤细胞自身可能具有合成和分泌GHRH蛋白的功 能.GHRH可能在附着在内质网上的多聚核糖体 中合成,以小泡介导的方式运输,可以?保留在内 质网;?运输到高尔基体后再运输到内体以及溶酶 体;?运输到高尔基体后进入分泌小泡,分泌小泡 与细胞膜融合,将蛋白质分泌到胞外.GH瘤细胞 产生的GHRH分泌可能受外界信号调控,也可能 是不受调控的持续分泌.本研究组4例GHRH阳 性标本均未发现有基因突变,提示这部分垂体生长激 素瘤本质上可能就是GHRH腺瘤,生长激素瘤细胞 局部合成和分泌的GHRH通过其受体促进GH合 成,释放和细胞增殖.血浆GHRH的测定,瘤组织原 位杂交有助于生长激素瘤的分型及病因诊断. 近年来对垂体瘤发病机制的研究主要归结为两 大学说:一为垂体瘤细胞的自身缺陷,采用X染色 体失活技术发现垂体瘤系单克隆性肿瘤,强烈支持 了该种理论.然而有研究发现在58的复发性垂 体瘤中复发的瘤组织和原来的瘤组织来源并非同一 克隆,这种情况提示垂体瘤的发生可能是寡克隆而 不是纯粹的单克隆性的[1妇;另一种认为下丘脑及 垂体局部激素或细胞因子调控失常引起,动物模型 实验也提示过度下丘脑激素刺激可导致垂体瘤的形 成[J.本研究分析了26例肢端肥大症患者的相关 基因,蛋白表达情况,发现3例Gsa基因突变和2例 GHRHR基因突变,GHRHR在垂体瘤中有高表 达,GHRH在部分瘤组织中有表达,提示除了既往 文献报道的基因突变以外,垂体瘤自分泌,旁分泌 GHRH促使细胞增殖也是生长激素瘤的重要发病 机制之一,垂体瘤的发生发展是一个多阶段,多步骤 的过程. 参考文献 ColaoA.FeroneD,MarzulloP,eta1.Systemiccomplica- tionsofacromegaly:Epidemiology,pathogenesisandman— agement[J3.EndocrRev,2004,25(1):102 KimHJ,KimMS,ParkYJ,eta1.PrevalenceofGsalpha mutationsinKoreanpatientswithpituitaryadenomas[J3.J Endocrinology,2001,168:221 WeinsteinLS.YuS,WarnerDR,eta1.Endocrinemanifes— tationsofstimulatoryGproteinalpha-subunitmutationsand theroleofgenomicimprinting[J].EndocrRev,2001,22 (5):675 WeinsteinLS,LiuJ,SakamotoA,eta1.Minireview:GNAS: normalandabnormalfunctions[J3.Endocrinology.2004,145 (12):5459 FrohmanLA,KinemanRD.Growthhormone-releasinghor— mone:discovery,regulation,andactions[M3.InHandbook ofPhysiology:HormonalControlofGrowth(KostyoJ.,ed) OxfordUniversityPress,1999.189 LeeEJ,KotlarTJ,CiricI,a1.Absenceofconstitutively activatingmutationsintheGHRHreceptorinGH—producing pituitarytumors[J3.JClinEndocrinolMetab,2001,86: 3989 AdamsEF,SymowskiH,BuchfelderM.eta1.Apolymor— phisminthegrowthhormone(GH)-releasinghormone(GH— RH)receptorgeneisassociatedwithelevatedresponsetO GHRHbyhumanpituitarysomatotrophinomasinvitro[J3. 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