MiR-126在肾透明细胞癌中的表达及质粒构建的研究（可编辑）

MiR-126在肾透明细胞癌中的达及质粒构建的研究（可编辑） 中图分类号: 学校代码: : 密级: 公开 高盐犬法 硕士学位论文 在肾透明细胞癌中的表达及质粒构 建研究 论文作者 指导教师 显堡耀 毖 坦 塾援 申请学位 培养单位 医堂亟? 医 堂 瞳 南开大学研究生院 二零一三年六月南开大学学位论文使用授权书 根据《南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法》,我 校的博士、硕士学位 获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子 版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理 。南开大学拥有在 《著作权法》规定范围内的学位论文使用权,即:学位获得者必须按规定提交学位论文 包括纸质印刷本及电子版,学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论 文,并编入《南开大学博硕士学位论文全文数据库》;为教学和科研目的,学校可以将 公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读,在校同网上提供论文目录检 索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务;根据教育部有关规定,南开大学向 教育部指定单位提交公开的学位论文;学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所及 其万方数据电子出版社和中国学术期刊光盘电子出版社提交规定范用的学位论文及其电 子版并收入相应学位论文数据库,通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其 他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文,保密期限内不向外提交和提供服务,解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站:://...:】/.。 本人承诺:本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品,并已通过论文答 辩;提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致,如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份,由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字: 壁堡擢 年月日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 一在肾透明细胞癌中的表达及质粒构建研究 姓 名 段瑁耀 学号 答辩日期 年月日 论文类别 博士口 学历硕士团硕士专业学位口 高校教师口 同等学力硕士口 院/系/所 医学院 专业 临床医学 . ...: 通信地址邮编:天滓市卫津路号 备注: 是否批准为非公开论文 否 注:本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写一式两份签字后交校图书 馆,非公开学位论文须附《南开大学研究生申请非公开学位论文审批表》。南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外,本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名:韪疆耀 年月 非公开学位论文标注说明 本页表中填写内容须打印 根据南开大学有关规定,非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文,公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 口限制?年 口秘密?年 口机密?年 保密期限 年 月 日至 年 月 日 审批表编号 批准日期 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章有效 注:限制?年可少于年:秘密?年可少于年:机密?年可少于年中文摘要 中文摘要 目的:评估一在不同‘肾组织和不同肾细胞株之间的表达差异,初步 判断在肾癌的发生和进展中可能扮演的角色,同时,构建.过 表达和敲低质粒为后续的功能研究做准备。 方法:收集中国人民解放军总医院例配对的肾透明细胞癌与癌旁组织标 本,例转移性透明细胞肾细胞癌组织标本,培养正常人肾近曲小管上皮细胞 株以及肾透明细胞癌细胞株.、、.、、.。 逆转录.为模板,荧光定量采用 染料法比较 值。构建.过表达质粒...和一敲 低质粒..一.使用转染试剂转染入细胞内验证 其效能。 结果:在局限性肾癌组织中的表达与癌旁组织没有显著的差异 ., 一在转移性。肾癌组织中较局限性肾癌组织表达上调 .。与相比,.在.和中高表达,与一和 相比,.在一、和.中低表达。与空质粒和只加转染 试剂两个对照组相比,一过表达和敲低质粒依次使得细胞中的 一明显升高和没有显著改变。 结论:可能在肾癌的不同阶段和不同的组织成分中发挥着不同的 作 用,我们构建的.过表达和敲低质粒可以作为强有力的实验手段 用于 .功能学研究。 关键词:一肾癌过表达质粒质粒 :’ ,.,, . : , , ’,. 一,一, .. 一 .一 一? 一 . : , ?, .. 一. ., , 一 一,, . ., ,一, 一?一 , . :一 ? ,.:, , , 目录 目录 第一章引言??.. 第一节肾癌??. ..肾癌的流行病.............. ..肾癌的病因...肾癌的病理??. ..肾癌的临床表现和诊断..肾癌的治疗.第二节肿瘤转移的机 制?.. 第三节与肿瘤转移和一? 第四节研究依据及研究内容. ..研究依据?.?. ..研究内容?..? 第二章一在组织和细胞中的表达差异.. 第一节实验材料.. ..主要材料??.. ..主要试剂和溶剂??.?. ..主要仪器及设备.. 第二节实验方法.. ..细胞培养?.?. .. 提取和逆转录 ..荧光定量??..??.......................... ..统计...?.......?.......... 第三节实验结果.. .. 一和引物验证??..?.?............?.目录 .. 一在组织中的表达??.?.. .. 一在细胞系中的表达...... 第四节讨论第三章一过表达和敲低质粒的构建 第一节实验材料.. ..主要材料??...?..... ..主要试剂和溶剂.. ..主要仪器及设备.. 第二节实验方法??.?. ..构建 过表达质粒??............... ..构建一敲低质粒..?......... .. 过表达和敲低质粒转入??..... ..统计分析?.?...?.?......??...... 第三节实验结果.. .. ? 和 引物验证.. 一过表达和敲低质粒测序.. 转染??. ..转染后一表达..?.. 第四节讨论第四章结论??.. 参考文献??..?. 致谢??. 个人简历在学期间发表的论文与研究成果 符号说明 符号说明 肾细胞癌 透明细胞肾细胞癌转移性肾细胞癌 国际 癌症研究机构 慢性阻塞性肺病 体重指数? 胰岛素样生长因子 三氯乙烯 ?订 世界卫生组织 美国癌症联合会超声 计算机断层扫描磁共振成像静脉尿路造影 ? . 干扰素. . . 白介素. 血管内皮生长因子 血小板衍生生长因子 磷酸 盐缓冲液乙二胺四乙酸 牛血清白蛋白 聚合酶链式反应每分钟转数氨苄青霉素 二甲基亚砜 互补脱氧核糖核酸上皮.间充质转变 第一章引言 第一章 引言 第一节 肾癌 ..肾癌的流行病 在发达国家中癌症是居于首位的死亡原因,而在发展中国家则是居于第二 位。年全世界大约有.亿癌症患者和万死于癌症。乳腺癌和肺癌依 次是女性和男性癌症患者当中发病率和致死率最高的,而在发达国家中前列腺 癌则是男性肿瘤患者致死率最高的?。年中国癌症瓤发病例数占全球的 .%,居于前三位的分别是肺癌、胃癌和肝癌【】。肾癌的发病率在世界范围内 有巨大的差异,发达地区明显高于发展中地区,欧洲和北美是高发地区,男女 发病率依次是.%和.%,亚洲和南美洲是低发地区,男女发病率依次是.% 和.%,男女患者的发病率比例约是:,自世界年代中叶以来,肾癌在 多数国家的发病率呈现一个平台期或有所下降,,。由于影像检查 手段的广泛 使用,被诊断的’肾癌越来越多的处于早期阶段,而且有朝着发现更小癌症的趋 势【’。在美国,小于.肾癌发病率的增长率已超过较大体积的肾癌,紧接 其后的是...的肾癌。虽然肾切除术对于早期肾癌有很高的治愈率,但 仍有%一%的病人表现为局部进展和转移,其中的/是在肾切除术后出现 转移的【】。肾癌主要转移至肺、骨、肝和脑】。 ..肾癌的病因 肾癌确切的病因还不是很清楚,但与肾癌有关的一些危险因素我们已经发 现,其中不仅包括与生活方式有关的吸烟、饮食、肥胖、饮酒和吸毒,而且包 括与环境有关的职业中暴露于各种化学物质、射线和肾透析,这些都有可能参 与了肾癌的发生【。 国际癌症研究机构美国公共卫生署认为吸烟是与肾细胞癌的发生 具有因果关系的危险因素,。与从不吸烟的人相比,吸烟的入患肾癌的风险 在男女中分别增加%和%【 。由于一氧化碳的暴露和吸烟相关的疾病例如第一章引言 慢性阻塞性肺病,推测吸烟是通过慢性组织低氧或缺氧导致肾细胞癌的 。 风险性增加】。另外,吸烟还可通过的损伤介导细胞的恶变, 在美国超过%的肾癌患者体重过重和肥胖】。体重指数每增加 /,患肾癌的风险男女依次增加%和%【】。超重与患肾癌风险的联系 的病理生理机制还不是很清楚,可能与以下有关:胰岛素、胰岛素样生长因子 .和性激素水平的升高,脂肪组织产生的细胞因子和脂肪因子,脂质过氧 化和氧化应激以及肾小球滤过率和血流的增加,圳。 与血压正常的人相比,那些患有高血压舒张压或收缩压 的人发生肾癌的风险是其倍或更高,使用利尿药和其他抗高血压 药也会增加患肾癌的风险【聊】。可能与慢性肾低氧和脂质过氧化产生的氧自由 基有关。 一些队列研究认为富含水果和蔬菜的饮食可以降低患肾癌的风险,但是一 些研究的结果恰与其相反【‘。大量的队列研究认为酒精摄入与 肾癌呈负相 关’’,每天饮酒超过可以显著减低患肾癌风险%酗。适量饮酒降低 患’肾癌风险的潜在机制可能是通过提高了胰岛素的敏感性,这样就降低了患 型糖尿病风险以及减少了胰岛素样生长因子?产生,它们的共同结果是降 低了患。肾癌的风斟”。 尽管通常。肾癌不被认为是一种职业病,但某些职业和暴露于大量的工业试 剂将会明显提高患肾癌的风险,例如三氯乙烯、镉、铀、砷、亚硝酸盐和 氡】。 遗传性肾癌在大量家族性癌症综合征中被发现。大量的遗传性高外显率突 变在肾癌中发现,包括透明细胞癌中的基因 、乳头状癌中的原癌 基因【】、与?.综合征相关基因?、乳头状癌同时伴发平滑肌 瘤病和子宫平滑肌瘤中的基因。此外,多态基因的变异和后天改变在散发 肾癌的发展中的重要性也逐渐被认识到。 ..肾癌的病理 肾细胞癌是源自肾小管细胞的一组异质性癌症引。年首 先对肾细胞癌进行了分类,他认为肾肿瘤是源自于异位的肾上腺残余,于是又 称作肾上腺样瘤【。年以前依据肿瘤的直径是否大于,将肾细胞肿瘤 第一章引言 划分为良性和恶性,恶性肿瘤被分类为肾细胞腺癌或,同时尽管一些报道 认识到某些细胞类型可能有更好的预后,但这些没有被考虑在大多数的分类法 中 。在年、年和年三次共识研讨会上定义了诊断分类 方法,肾实质细胞肿瘤/分类方法的建立将分成了不同 亚型,于是不再被看做是一种肿瘤,而是一组肿瘤,每一个亚型都有其独 特形态和基因特征。分子遗传学影响着肾细胞肿瘤的分类。基因的改变影响着 肿瘤细胞的生物学行为,包括增值、细胞死亡、分化和细胞年付,这些不同的 特性在决定肿瘤的形态和行为上发挥着作用【。 年出版了新的分类方法,其是对年和年肾细胞癌分 类方法广泛的重新审视,包括个主要组织类型,依次是透明细胞癌、乳头状 细胞癌、嫌色细胞癌、集合管癌集合管癌和肾髓样癌和未分类肾 细胞癌, 同时也包括以下几种,依次是多房囊性透明细胞癌、异位性肾癌、神经母 细胞伴发的癌以及粘液管状和梭性细胞癌【 。透明细胞癌是肾细胞癌中最常见 的类型,其发生概率是%.%。通常是单发偶发的,%是多发的,%是 双侧的,切面呈黄色,肿瘤内常有出血,偶有瘢痕或钙化【 。透明细胞癌的基 质富含血管导致其肿瘤内易出血,细胞内脂质以及大量的胆固醇、中性脂肪和 磷脂使其呈现黄色的外观。一些透明细胞癌有囊性表现,这可能与其存在坏死 有关假性囊腔,坏死的存在可能与肿瘤侵袭性增加有关。一些透明细胞癌形 成真性肿瘤性囊肿,完全的囊性表现没有实性肿瘤成分,这种被定义为多房囊 性。肾细胞癌。这一亚型有很好的预后,被认为是低度恶性的透明细胞癌亚型。 肉瘤样变也会发生在透明细胞癌中而且预后很差,】。透明细胞癌通常是通过 血道转移,主要通过腔静脉转移到肺,沿着椎旁静脉、睾丸静脉或肾静脉或沿 着输尿管逆行转移也是其转移路径。透明细胞癌可以转移到不寻常的位置和很 晚才发生转移年甚至更长。所有的透明细胞癌都是恶性肿瘤,不管其大小。 值得一提的是透明细胞癌中并不是所有的亚型都有透明细胞。其免疫表型: / .%、.%、%、%、 %、.%和%。 是透明细胞癌最为 典型的基因异常,发生概率是.%【 。 年,等提出细胞核的特征与生存率有关,随后 等基于细胞核和核仁的大小、形状和内容物发展了级分类系统’”。尽管最 近通过大量的透明细胞癌和乳头状癌再次验证这个分级分类系统显示其存在一 第一章引言 些问题,但是这个分级分类系统仍是使用最广泛的‘。除了分期,核分 级是。肾细胞癌最重要的预后预测因子‘。目前肾细胞癌的分期采用年 的分期表.、表.。 表. 年肾细胞癌的分期 分期 标准 原发肿瘤 原发肿瘤无法评估 无原发肿瘤的证据 肿瘤局限于肾脏,最大径 肿瘤最大径 中瘤最大径 肿瘤局限于肾脏,最大径 中瘤最大径 肿瘤局限于肾脏,最大径 肿瘤侵及肾静脉或除同侧肾上腺外的 肾周围组织,但未超过肾周围筋膜 肿瘤侵及肾静脉或侵及肾静脉分支的 肾段静脉含肌层的静脉或侵犯肾周围 脂肪和或肾窦脂肪肾盂旁脂肪,但 分期 是未超过肾周围筋膜 标准 肿瘤侵及横隔膜下的下腔静脉 肿瘤侵及横隔膜上的下腔静脉或侵及 下腔静脉壁 肿瘤侵透肾周筋膜,包括侵及邻近肿瘤 的同侧肾上腺 区域淋巴结 区域淋巴结无法评估 没有区域淋巴结转移 单个区域淋巴结转移 第一章引言 一个以上的区域淋巴结转移 远处转移岬 远处转移无法评估 无远处转移 有远处转移 表. 年肾细胞癌分期 分期 肿瘤情况期期 或 期 ,期 任何 任何 任何 任何 ..肾癌的临床表现和诊断 大多肾细胞癌的自然病程具有隐匿性,诊断其有一定的挑战。肾 细胞癌典 型的三联征包括侧腹疼痛、血尿和侧腹肿块,并不是很常见%,同 时也预示 着疾病处于进展期。%.%的患者诊断时没有症状,仅是通过放射性检 查偶然发现的。转移病灶损害和副肿瘤综合征渐渐地成为首发症状,包括:高 钙血症、红细胞增多症和非肝转移性肝酶升高。多神经肌病、淀粉样变性、贫 第一章引言 血、发热、恶病质、体重减轻、皮肌炎和高血压也会伴发于】。随着人们 体检意识的增强和影像检查手段的普遍使用,越来越多的发现无症状和小肾细 胞癌,肾细胞癌的确诊也越来越依赖于影像检查。超声、计算机断层扫描 和核磁共振成像被用于那些怀疑患有的患者,最近也越来越多 的被使用,以上这些影像检查逐渐替代了传统的血管成像技术和静脉尿路造影 。是一个安全而价格又比较便宜的检查技术,不需要对比剂,也不会接 触到放射线,但是它受限于病人的体质和操作者的经验。尽管与和相 比其提供有限的综合信息,但仍是一个评估囊性。肾病变的非常好的方法。增 强适合于大多数的病人,除了对碘造影剂过敏和肾功能有损害的病人。 是对碘过敏患者可以选择的一个检查项目。的优势是优越的软组织对比度 和无放射线,尤其适合于那些需要一系列动态监测的具有遗传倾向的患者。 相对比较贵,不是每家医院都有,同时对于那些慢性肾功能不全的患者进 行增强有发展为肾源性系统纤维化的风险】。 ..肾癌的治疗 肾细胞癌依据其临床分期的不同,治疗方法的选择也不同,以手术治疗为 主,同时还包括免疫治疗和靶向治疗。尽管过去十几年对于这样的病变的处理 仍存在着很大的争议,但小于伴强化的肾实质肿块应高度怀疑肾细胞癌的 可能。在过去已经对于这种病变的恶性潜能作了很多推测,对于其自然病程的 理解也是有限的,这是因为大多数的这种病变我们都以手术处理包括根治性或 部分性。肾切除。当遇到绝对适应证或相对适应证时更倾向于部分肾切除,包括: 双侧肾肿瘤;孤独。肾肿瘤或慢性。肾病或其他治疗将会影响肾功能】。与经过恰 当选择的小肾癌行根治性肾切除相比,选择性部分肾切除同其有相同的疗效, 例如对侧肾正常,类似于乳腺癌的乳腺肿瘤切除术,。肾部分切除术需要大 量的专业知识,现在这些专业知识已经被大量使用。肾部分切除术的基本步骤 包括:肾血管的暂时阻断、带有周围正常实质的肿瘤切除、泌尿集合系统的关 闭和肾包囊的重建图.。可控的术后并发症包括出血%和尿漏?%。肾 部分切除术已经可以在腹腔镜下完成,开放手术更适合于复杂的病例,例如肾 门处的肿瘤或者孤独肾【, 。肾部分切除术已成为小肾癌的金标准。最近的研 究认为小肾癌的异质性增加了治疗的复杂性。大约%的肿瘤是良性的,% 第一章引言 可能是惰性亚型的肾细胞癌,只有%的是潜在侵袭性肿瘤’】。包含个 小肾癌病人的分析显示不接受任何干预,肿瘤平均每年只长达., 只 有%的肿瘤发生转移。这一发现为我们提供了小肾癌的自然病史,同时支持 了对于小肾癌尽量采取少侵袭性治疗策略,尤其是老年患者或手术干预有高风 险的患者。另外一种可以选择的治疗方法具有很大的吸引力,那就是以探针为 基础的热消融,它是通过将肿瘤暴露在极端的温度下达到治疗肿瘤的目的而不 依赖传统的手术。这一治疗可以通过冷冻消融或射频消融来完成,两种方法既 可以经皮也可以经腹腔镜’】。腹腔镜下的消融更适合于肿瘤邻近器官需要移 开以确保安全。热消融的局限性包括:与手术切除相比的高复发率【】、没有很 好定义的手术成功的影像表现【 】和因为消融失败后纤维组织反应而无法性挽救 性手术。肿瘤的大小是消融手术的一个主要限制,因为肿瘤大小超过.很难 获得可靠的消融切除。考虑到此,慎重的选择热消融病人很重要,最佳的候选 患者是老年人或有很多伴发病而又想积极治疗但又不能实施传 统手术的病人。 小肾癌治疗最主要的原则是肿瘤控制并最大限度的保留肾功能。根治性。肾切除 可以在腹腔镜下进行,对于患者或医生都有很大的吸引力,但是对于小肾癌则 是过度使用【】。报道显示既使是对侧肾正常和术前肌酐清除率正常,慢性肾病 在根治性肾切除术后也要比在肾部分切除术后更常见,根治性肾切除术后轻中 慢性肾病轻型慢性肾病是指肾小球滤过率小于/,中型慢性肾病是指肾 小球滤过率小于/的发生概率依次是%和%,而肾部分切除术后的 概率却只有%和%【。有一种推论认为?的肾癌应该尽量考虑保留肾单 位的手术,应为与根治性肾切除相比其肿瘤性结果是类似的【碍】。 直径大于伴局部浸润的肿瘤恶性可能性大,大约.%的。肾细胞癌延 伸到静脉系统形成癌栓,而且经常上升到腔静脉甚至到达右心房。根治术是治 疗肾细胞癌的主要手段,尤其适合于局部进展性肿瘤,偶尔需要整体切除邻近 器官,分离和暂时阻断区域血管和静脉癌栓的取出图.。高达%.%的病 人可以被这种积极的手术方法治愈殳】。术后肿瘤复发的危险因素主要是肿瘤 的分期和分级,也包括病人的体力状况和肿瘤相关的症状】。不同辅助治疗 包括免疫治疗、放射治疗和激素治疗在随机试验中均未显示对患者有 益【。对于伴有远处转移病人行根治性肾切除被当作是综合治疗策略的一部分。 这一方法已被个期研究证实,远处转移肾细胞癌病人被随机分为行根治性 肾切除和不行手术两组,随后接受?,结合这两个实验的结果分析显示肾切第一章引言 除术加.的中位生存期是.个月,单用.的中位生存期是.个月 。确切的机制不是很清楚,尽管没有可靠的数据,普遍的假设是减瘤性肾 切除去除了肿瘤促进生长因子或者免疫抑制因子的源头,减轻了疾病负荷,于 是增加了发展到致命性肿瘤负荷的问期。尽管减瘤性肾切除似乎可以让很多转 移性肾细胞癌患者受益,但这不是治愈性的,不应该不加选择的 实施。以下这 些病人可以从减瘤手术中获益包括:巨大的肿瘤负荷%、良好的心肺功能 和没有中枢或肝转秽。尽管只有一少部分病例.%是局限性转移,但可以考 , 虑切除转移灶。良好的预后因子包括:完全切术、诊断到发展为转移的长间期 。具有以上良好预后因子的病人行转移灶切除后年生存期可达%。 转移性肾细胞癌对化疗的反应很差,报道的反应率在%。在靶 向治疗出现前,治疗的主要方法是免疫治疗包括.和.,这一治 疗方法具有明显的毒性而且反应率也是有限的。的治疗策略在过去的 十几年里已经取得的极大的进步,关键是对肿瘤生物学和基因通路 特征的理解。基因编码蛋白,其是一个肿瘤抑制因子,与遗传性和偶 发性均有判。基因自发的突变被认为与%的病例有关【到。 蛋白的缺失导致信号通路的过度活化,进而引起缺氧先关基因的过度 表达包括和,下游的信号通路包括通路也被激活。这些 细胞信号通路的上调促进肿瘤细胞生长、增殖、生存和血生成。 靶向和抑制这 些信号通路中的基本分子变成了治疗的新标准。在中,原发灶切 除可以诱发免疫反应导致巨大的自发缓解,尤其是肺转移,这一现象引起了人 们认为免疫治疗的可能,。基于.介导的持续缓解和完全缓解率 在?%,一仍是那些经过选择病人的一线治疗,不。一有限的 益处与治疗的花费和涉及多器官系统导致一小部分病人死亡的治疗相关毒性相 当【】。基于治疗成功的组织学、分子和临床预测因子的严格病人筛选是获得最 大的生存益处的根本。报道的反应预测因子包括:最多一个转移灶的小肿瘤、 。 没有骨转移、基本情况良好、缓慢进展的疾病和一组认为的分子标志物【。 碳酸肝酶的表达是一个病理标志物,曾经被报道可以预测对于高剂量.是 否有反应】。通过提高与相关促血管生成通路的理解,利用单克隆抗体发 展的靶向治疗已经成为系统性治疗的主要手段。目前,已经有中药物 被批准用于进展期的治疗:舒尼替尼、帕唑帕尼、索拉菲尼、贝 伐单抗联 合.、替西罗莫司和依维莫司。几种新的靶向药物最近也被观察用于治疗 第一章引言 。 的可能包括:、、和 图. 。肾部分切除术治疗局限性肾细胞癌:肾血管的暂时阻断;:肿瘤切除;:肾的重建摘自: , , .【】,,: ?. 图.局部进展性肾细胞癌根治性肾切除和卜腔静脉内癌栓的取出 :游离。肾脏,结扎肾动脉,阻断区域血管;:切开肾静脉与下腔静脉的汇合处,并沿着. 下腔静脉的前壁延伸,取出癌栓摘自: , , 【】.,,: . 第一章引言 第二节肿瘤转移的机制 肿瘤的转移导致了高达%肿瘤患者的死亡,但是我们对其机制的理解仍 是有限的 。年英国外科医生 发表了他那具有创意的“种子” 和“土壤”假说来解释转移的非随机模式。发现血供的多少和转 移的频 数是矛盾的,于是详细检查了多个不同肿瘤病人的活检记录,他的分析表 明转移到内脏和骨是非随机模式,这一发现与当时流行的转移随机学说不一致, 其认为特定的肿瘤细胞对特定的器官周围环境有特殊的亲和力,总结认为 转移的发生只有当种子和土壤相匹配时才可能发生。年 挑战 的“种子和土壤”学说,提出转移扩散仅仅是血管系统解剖结构的结果, 的观点流行了几十年。世纪年代,转移的自然过程被发现,在同源 小鼠上做的转移实验表明肿瘤细胞在远处器官毛细管床的停留实际上会发生, 。和 但是随后的增值和生长成为次级病变可能受特定器官细胞的影响 回顾了不同人类肿瘤产生转移的临床数据,认为同一区域转移归因于 解剖或机械因素,例如流出静脉循环或淋巴引流到区域淋巴结,但是转移到远 处器官实际上是有器官特异性?】。一个肿瘤细胞从原发部位转移 播散需要经过 一下几步:侵入局部周围组织;进入淋巴和血液微循环;生存和通过血流转移 到远处组织的微血管并从血流中游出;在远处组织中生存下来;最后适应这些 组织不同的微环境,促进细胞增殖和形成显微镜下次级肿瘤图.。 和认为这一复杂的转移级联可以简化为两个主要阶段: 肿瘤细胞由原发灶转移至远处组织的微环境;定殖图.。物理播散这一过 程我们已经很了解了,然而第二阶段关于定殖涉及复杂的相互关系我们仍不是 很清楚。从治疗的角度出发,理解物理转移的机制可以阻断早期肿瘤病变的转 移,理解定殖的机制可以帮助我们发展对于已经有转移的病人有效的治疗方法 研究七】。 为了脱离原发灶和开始转移进程,单个或一组肿瘤细胞必须具备迁移和侵 袭能力。这两个特性使得肿瘤细胞降解并通过周围组织的细胞外基质进入血管 和淋巴管,将肿瘤细胞远处的次级器官。转移播散的第一个临床指针可能来源 于引流淋巴结肿中存在肿瘤细胞,那些通过淋巴管直接与原发灶相连的淋巴结 可能代表的是终点而不是向更远处转移过程中的暂时停留剧。事实上,播散 到解剖上的远处器官大多数是通过血液,即血液播散过程,羽。癌症是指上皮 第一章引言 组织来源的。正常情况下,通过粘附、紧密连接、桥粒、半桥粒,上皮组织中 的上皮细胞与邻近的细胞紧密相连并固定在基地膜上。这些紧密的物理连接不 仅限制了正常的上皮细胞而且限制了多种良性癌症。但是,作为一个肿瘤进程, 癌症细胞从这些联系中释放出来,第一步是降解下面的基底膜,然后侵入到邻 近的问质中。这一侵袭力使得癌症细胞既可以穿入又可以穿出【。这里有一个 一个世纪都没有解决的问题,恶性特性的获得是原发肿瘤进展必然的结果还是 一个偶然结果。一种普遍被接受但没有被证实的原发肿瘤形成模式假设肿瘤细 胞获得了一系列遗传或后天改变,这些使得肿瘤细胞以另外一种 方式生存【川。 每一改变都可以引起一个克隆细胞系的产生,至少在形式上,看起来像是符合 达尔文进化论机制。这一模式又提出了一个新问题,癌症细胞侵袭特性的发展 是否反映了原发肿瘤中癌症细胞的局部优势。这一选择更加的微妙,多级克隆 进化选择那些在原发肿瘤中有更强生存和增殖能力的细胞。一旦形成,这些细 胞可以对介导它们表达高度恶性特性的环境因子产生反应。这其中包括肿瘤干 细胞与转移、与转移、固有的与诱导的肿瘤干细胞、循环的肿瘤细胞、归 巢。 定殖是一个极其低效的过程,大多数癌症细胞可以在小时内成功的从原 发灶转移到次级器官【孓。实验和临床数据支持这一观点,存活下来的持续存 在于转移部位,至少以三中形式存在:休眠状态;微转移灶;活化的持 续生长的大体转移病变图.。成功的定殖包括从微环境中自然存在的生长因 子和细胞因子获得促有丝分裂刺激的能力,完成自我更新和增殖; 募集必要的 支持问质包括适当的血液供应,。一些老鼠转移模型发现来源于 原发灶的因 子可以作用于远处器官为转移癌症细胞的到来做好准备皿。第一 章引言 耐 / 图.转移形成的主要步骤 .:’ 摘自: ’ 】 ,,:.:; 二耋。 国黧譬掣 《霉》要鹣?麟鬻一螽翻,渗 第一章引言 图.转移级联反应. 摘自: , 】., , : . :篆恭:蒸篡 ;。 嫱?了鍪囊‰ 黪 ‘ 图.转移细胞适应新的环境. 摘自: , ., , : . 第三节与肿瘤转移和. 从几十年前首次发现被当作一种奇特的蠕虫到被认为是一种在 真核基因组中新颖的转录后调控因子经历了很长一段路【。它们是一个? 个核苷酸长度的家族,广泛表达于各种生物中从植物到蠕虫再到人。许 多在物种间是高度保守的,复合物的许多原件可以在古细菌和 真细菌界中发现,显示其古老的祖先 。认为至少有多 条,占人类所有基因的%以上【”。在蠕虫中,最初被发现是调节发育 时钟】。但是现在我们知道它们不仅涉及发育进程的不同阶段,还可能在细胞 基因表达网络和微调中发挥作用‘,。靶点可能成百上千,所以 很可能形成另一调节通路层面【。 由.经过加工而成,.既可以由独立的 基因转录而来,也可以来源于编码蛋白聚合酶转录产物内含予。 一条.通常包含几种不同的序列。.折叠成发卡结 】第一章引言 构包括非完全碱基配对的茎干,经过两步处理由型核糖核酸酶内切酶 和催化。和都是以蛋白复合物发挥作用包含双链结合 区域。与形成复合物的组件在黑腹果蝇中是蛋白,在哺 乳动物中是迪乔治综合征关键区域基因。.复合物将 。。在秀丽隐 .加工成个碱基左右的发卡结构,即. 杆线虫、黑腹果蝇和哺乳动物中一些剪切下来的内含子与完全一 样, 这些是需要.’。植物的基因组不编码同源物,在阿拉 伯芥中所有的生成步骤均是由/样蛋白完成钔。在动物中, 由输出蛋白转运至胞浆,在胞浆中?被剪切成 个碱基左右双链,一条链然后被选择为成熟的,另一条链则 被降解。偶尔,.发卡的双臂都会生成熟的。脊椎动物和秀丽 隐杆线虫只有一条基因,而一些其他生物如黑腹果蝇和植物可以 表达两种 或以上的蛋白,这些蛋白具有功能异质性,具有不同的?,发 挥特定的功能。随着的加工,组装成核糖核蛋刍复合物, 被称作?或介导的沉默复合物。这一组装 是一动态过程,通常与加工?相伴随,但是这一细节还不是很 清楚。核心的组件式家族蛋白。在植物和多细胞动物 基因组中有很多蛋白旁源同系物,但只有有一些才被称作蛋白作 用 于或和小干扰通路。在哺乳动物中,个蛋 白阻、、和作用于抑制,但只有作用于 。在秀丽隐杆线虫中,有个蛋白,参与, 和作用于通路,。除了外,可以包含更多蛋 白,作为调节因子或效应子调控的抑制功能‘,,刀图.。 与通过碱基互补发挥作用。在植物中,大多数的与 基本上完全互补,从而通过一个样的机制介导的降解,在 ?双链中间被剪切。相反,在脊椎动物中除了几个例外, 与它们的靶点都是非完全配对,科学家们已经通过实验和生物信息分析 证实了一下几个原则【。第一条原则是与的碱基配对是完全, 的到号位碱基配对是连续的,这些碱基代表着“种子”区域图. 中的暗红色和绿色部分。在种子区域的配对或错配和凸起很大程度上影响 了其抑制功能。但是号位如果是,号位如果是或图.中的 第一章引言 黄色部分,将会提高这些位置的效能,尽管它们不需要配对。另外一条原则是 凸起或错配应该在双链结构的中心区域,才能阻止介导的 内切酶剪切。最后一条原则是在’端应该存在合理的互补以稳定 这种相互关系。尽管当种子区域是次优时良好的碱基配对尤其是剩余的 .个碱基变的很重要,但错配和凸起通常在这些区域是可以接受的【,。 其他的一些因素可以提高位点的有效性,包括富集的邻近区域、 对于长 ’距离尾或终止密码子不是很远,这些因素都可以使区域松 散进而识别更容易接近【 ”。事实上,结合位点接近的难易性对于 介导的抑制作用有很大的影响。一些实验定义的位点明显偏离这些原 则,例如在种子区域存在凸起的核酸碱基, 。另外,结合位点需要特殊配置 使得抑制更加有效,例如被特殊序列和长度的核苷酸延伸分隔【。通常,在多 细胞动物中.结合位点位于的’并且存在多拷贝。重要的 是,同一个或不同多拷贝位点是有效抑制所需要的【。。当这些位点 相互很近时个核苷酸相隔,它们趋向于协同作用,其作用超过了单独的 两个位点作用,”吖图.。 多种已经被证实可能或确实与转移相关。而且一些也在 其他肿瘤相关进程中发挥着关键性作用,这样使得它们成为原发肿瘤和转移治 疗干预具有吸引力的靶点或工具,例如.作为研究最深入的,其 转移促进作用已经在大量不同肿瘤中被证实,同时它发挥着抗凋亡、促增殖、 化学保护和与恶性程度和激素受体状态有关。这也同样包括一家族成员含有 个位于个不同的染色体,它们在许多人类癌症中表达异常,抑制转 移,影响化疗和放射敏感性,使得癌症低分化更具有侵袭性。同样,一/ 簇编码的作为肿瘤抑制因子抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡,在不同肿 瘤中包括前列腺癌它们表达下调抑制肿瘤发生【”,对于很多与转移有关的 ,它们的靶基因与肿瘤细胞的侵袭和迁移有关和转移过程中的其他步 骤,例如、受体、、、、和钙蛋白。一些 与转移有关的基因直接或间接受几个调控,例如.家族 .、.、、和.通过沉默蛋白调节细胞的上皮特性, /也被同时被.或.调捌, 。和是间质 表型的调节子和钙蛋白的转录抑制子,?。钙蛋白又被其他一些 调节包括一通过或.,通过其他通路干扰转移,例如激第一章引言 活和. 。另一方面,任何给定的可能调控一组转移相关 基因而不是仅仅一个基因,这可能产生另外的影响通过多通路的干扰,也可能 补偿一个给定基因有时相当微小的调节。这样就有必要阐明转移 不同调节通路 的作用和它们之间的相互作用。一个给定的具有多种功能事实上有时会 产生看似矛盾的作用,例如.在中与肿瘤的侵袭和转移成负相关, 在肺癌细胞中高表达的.抑制了、侵袭和转移,它影响钙蛋白和 钙蛋白的表达也表明其抑制转移的作用,但是其他的研究证实一在转 移性乳腺癌细胞株中表达上调,,。一种方法去调和这种看似矛盾的发现 是集中于转移的不同步骤。事实上,转移形成的限制步骤可能是转移开始的肿 瘤侵袭性,也可能是最后一步的肿瘤细胞定殖,于是上皮细胞特性的获得可能 是抑制或促进转移。这样,一既可以促进或抑制转移的形成当通过相同的 信号通路。相反,.明确的被证实具有抗转移作用,在乳腺癌转移中,它 的个靶点已经被证实依次是整合素、根蛋白和【驯】。 .同时抑制转移进程中的不同步骤,例如侵袭、游出、生存和定殖【‘删。 有趣的是,当. 被预测调节超过个时,这一研究也证实它的 抗转移作用可以被个靶点的调节完全解释州。 在多种癌症中首个表达研究包括,发现通常是表达下 调的【。这一研究被其他的研究推翻,个.亿、..、. 和一在中是表达上调的【。个随后的关于的研究通过 证实了上调和下调的体系。。尽管等观察到在这一 型癌症中主要是过表达,但它们也发现一些下调的。另外 一个个的表达研究鉴定了在透明细胞癌中个表达上调和个表 达下调的】。在这一研究中,.和.是下调最明显的 。和等的研究证实了在透明细胞癌中一的下调和 .的上调【, 。上调的一和下调的一结合可以用于区分恶 性和良性组织样本,准确率高达% 。通常,这三个研究显示了一个 失调很好的重叠至少在其中的个研究中被检测到,例如.、.、 .和一’表达上调,一、.、一和一表达 下调。相对于正常的肾实质,..簇表达上调,一个致癌簇包含 。这一 个成员,发现于不同亚型中,尤其是在肿瘤中表达最高 簇中个上调在随后被证实 『。另一研究关注的是不同亚型间 第一章引言 表达的不同。每一亚型都以典型的体系为特征,与乳头状癌相 比和.在透明细胞癌中过表达,与嫌色细胞癌相比.在 良性嗜酸细胞瘤中过表达,过表达的通常与差的预后相关【。前 面提 到的.?簇过表达和癌症细胞增殖提高是通过转录因子来调节的, 但是不仅影响的表达,而且通过其他作为肿瘤抑制因子 的靶点【, 】。尽管基本上是检测不到的,但被发现在铁络合物 介导的小鼠和人类肾肿瘤细胞中表达增加。通过这种方式,一作为 潜在的肿瘤抑制因子作用于。反过来,在个肾癌细胞株中的个观察到 .表达调节通过它的启动子区域岛沉默来介导】。等在细胞 培养研究中也发现.?簇中的个..和一高表达 与细胞增殖率提高有关。、、和是透明细胞肾细胞癌发展 的关键分子,可能是这些失调的靶点 。在中基因是主要 的肿瘤抑制因子,在含氧量正常的情况下在转录和转录后水平调节表达, 在这些情况下异常的表达可以导致细胞株中.的高表达。 当 水平仍然不变时,.的表达增高抑制了蛋白的 表达,蛋白是已知的调节子。相反,当.表达没有改变时, 的表达在缺氧时是增高的,一的转录后调节在缺氧时是受抑制的。 通过生物信息学预测是.和.的潜在靶点,是 钙蛋白的一个转录抑制因子,随后的发现在癌组织样本中其是增加【 。在细 胞培养实验中,.和.过表达导致下调和钙蛋白的上 调。这样人们认为在透明细胞癌发展过程中.和.通过 作用于钙蛋白。 .是内皮细胞中极其重要的一个,起源于基因。在内 皮细胞和造血干细胞中表达很高, 】。同时,篇文章报道在斑马鱼和老鼠中 因为.缺失使信号通路受限导致血管生成严重缺陷,。 .表达水平的改变已经在不同肿瘤细胞中有报道,包括乳腺癌、肺癌、宫 颈癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠肠癌、肝癌、食管癌、胃癌和白血病。。在 成年老鼠中观察到在富血管的器官中表达,例如肺、心、子宫、卵巢、 肾和神经元。年.等在组织特异性老鼠芯片中鉴定出了 .和.,随后发现他们起源于同一前体,.被重新命名为 .‘】。表达分析显示.在血管丰富组织中含量很多,将一第一章引言 确立为唯一一个已知的在内皮细胞系和造血祖细胞系中特异性表的 ,’。一被报道在人类乳腺癌缺失,在裸鼠中用逆转录病毒恢复 一在原发乳腺癌细胞中的水平可以抑制总的肿瘤生长和转移到骨和肺 【】。与.高表达的乳腺癌患者相比,低水平.患者总的无转移生 存期要短,这一发现认为一缺失和无转移生存之问存在临床联系。与上 述结果一致的是,在肺癌、胃癌、宫颈癌、膀胱癌和前列腺癌中肿瘤与瘤旁比 .是低表达的,,。但是.在这些肿瘤中功能是不同而 且很大程度是不清楚的。等.下调.,肺癌细胞株感染慢病毒 .可以引起.的表达下降,进而导致体内外实验中肺癌细胞细胞周 期停滞和肿瘤细胞生长受抑制【。等证实将致癌基因.转化到老鼠胚胎 脑细胞中可以引起一表达下降。用激酶抑制因子处理 乳腺癌细胞株可以导致.表达下调,进而降低细胞的迁移【。另外, 的’也有报道其是一的靶点,是局部粘附网络的组成因子参与 整合素信号通路,降低的表达可以抑制肿瘤细胞增殖和侵裂,。在人类 结肠癌中,等认为.是一个肿瘤抑制因子,.缺失与通过下调 调节亚单位 使信号通路受损之问有联系。在人类胃癌中一 被认为是肿瘤抑制因子,通过抑制肿瘤生长和转移,这一作用可能是通过下调 来实现的州。 第一章引言 移’,吩”,‖’’??;。 图.的生成和其微核糖核蛋白的组装第一章引言 . , , 摘自: : ,,:】. ?. 『司。.。。.。。。....。.耐囹.。。。..。..。.。。 ? :::::::::: 专 区匿圈渣圈圈圈 八 .兰: ?出撇 嘲? 图. 相互作用原则 . 摘自: , ,:,,:明. ?. 第四节研究依据及研究内容 ..研究依据 肾癌的发病率在世界范围内有巨大的差异,发达地区明显高于发 展中地区, 欧洲和北美是高发地区,男女发病率依次是.%和.%,亚洲和南美 洲是低 发地区,男女发病率依次是.%和.%,男女患者的发病率比例约是:。肾 切除术对于早期肾癌有很高的治愈率,但仍有%一%的病人表现为局部进展 和转移,其中的/是在肾切除术后出现转移的但是我们对其转移机制的了 解还是有限的。转移性肾细胞癌对化疗的反应很差,报道的反应率在 %】。在靶向治疗出现前,治疗的主要方法是免疫治疗包括.和 一,这一治疗方法具有明显的毒性而且反应率也是有限的【。基于.介导 的持续缓解和完全缓解率在.%,.目前仍是那些经过选择病人的 %,但是这一反应 一线治疗,。.对于进展期总的反应率高达 是部分和短暂的阮,,】。同时伴有副反应包括流感样症状、抑郁和口干。目 前,已经有中药物被批准用于进展期的治疗:舒尼替尼、帕唑帕尼、索 第一章引言 拉菲尼、贝伐单抗联合.、替西罗莫司和依维莫司,到目前为止转移性肾癌 仍然是不可治愈的,新的药物仍待开发。 是一个.个核苷酸长度的家族,广泛表达于各种生 物中从植物到蠕虫再到人。它们不仅参与发育过程的各个阶段,还可能在细胞 基因表达网络和微调中发挥作用”,。的靶点成百上千,形成了另一 个调节通路【。越来越多的证据反应既可以作用于致癌基因又可以作 用于肿瘤抑制基因,在肿瘤的发展和预后上发挥着重要作用。表达水平 轻微的改变就可以引起一个链式反应和反馈通路,这其中涉及多个和 影响同一通路或不同通路的多个靶基因。相应地,单个失调足以引起整 个基因表达谱的改变,从而影响细胞增殖、分化、生存和侵袭。然而, 在调节肿瘤转移中的作用才刚刚开始研究,这就会为我们阐明肿瘤转移机制打 开一个窗口。到目前为止,一些已经被证实调节侵袭.转移级联反应。 随着与肿瘤转移相关更多被鉴定出来,它们将会编织成一个更加复杂的 彼此相互作用的转移网络,这一网络越复杂,肿瘤转移的本质显示的也就越透 彻。 .是内皮细胞中极其重要的一个,起源于基因。一 表达水平的改变已经在不同肿瘤细胞中有报道,包括肾癌、乳腺癌、肺癌、宫 颈癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠肠癌、肝癌、食管癌、胃癌和白血病【‘州。 .通过不同信号通路影响肿瘤发展,通过抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭 抑制肿瘤生长或转移,也可以通过下调肿瘤细胞生存的核心信号分子。目前关 于.在肿瘤形成和转移复杂过程中的作用还不是很清楚,仍待解决。 ..研究内容 本研究通过检测局限性透明细胞肾癌、癌旁、转移性透明细胞。肾癌、 正常肾下管上皮细胞与透明细胞肾癌细胞株.、、一、 和一的表达差异,明确一在癌旁肾组织与局限性透明细胞肾癌 之问、局限性与转移性之问以及细胞株之间的表达情况。然后分别构建一 过表达和敲低质粒,研究.对于肿瘤侵袭和迁移的影响,以期发 现. 在肿瘤转移中的作用机制。 第二章.在组织和细胞中的表达差异 第二章在组织和细胞中的表达差异 第一节实验材料 .. 主要材料 ...组织标本 收集中国人民解放军总医院例配对的肾透明细胞癌肿瘤与癌旁组织标 本,例转移透明细胞肾细胞癌组织标本。所有标本均获取患者本人书面同意 并且本研究通过中国人民解放军总医院伦理委员会批准。标本收集严格遵守中 国人民解放军总医院标本管理相关规定,离体后立即放入液氮中保存。全部病 例术日订均未行放射治疗或化学治疗。 表. 例转移病人资料 编号 性别 病理类型 肿瘤大小 分级 转移部位 男 透明双肺 男 透明 .. . 双肺. 男 透明 双肺 透明 . 女 右肩胛骨 . 男 透明 . 腹膜后淋巴结 男 .. ? 透明 双肺 男 透明 . 双肺 . 男 透明 双肺男 透明 是不详 . 男 透明 肾门和主动脉旁淋巴结 . 男 透明 第.腰椎、左侧髂骨 男 透明 .. . 左肾上腺 男 透明双肺 ... 男 透明 肺 第二章一在组织和细胞中的表达差异 男 透明 . 双肺 .男 透明 双肺、胸椎体 透明双肺 男 男 透明 .. . 双肺 . . 男 透明 双肺 . 女 透明 双肺、右髂骨 . 男 透明 右肾上腺 男 透明 无 肺 ...细胞株 人正常肾小管上皮细胞系,购自中国协和医科大学基础医学细胞 中 心: 人肾癌细胞系一、,购白中国协和医科大学基础医学细胞中心; 人肾癌转移细胞系.、,购白中国医科大学基础医学细胞中 心,一由华中科技大学同济医学院赠送。 ...引物 、利用查找成熟.序列; 、 道 利 用 报 的 结 构 ? ’ ’,在其’增加与.序列’端反向互补的个碱基见表.,即为 .的引物。 、根据引物逆转录的序列,利用.一的上 下游引物,但必须保证上下游引物均靠近两端,尤其是下游引物 与. 重复的序列不能超过个碱基。 本文中所有引物均由上海英骏公司合成。引物的核酸序列见 下表。 第二章.在组织和细胞中的表达差异 表.引物核酸序列 产物 基因 引物核苷酸序列 大小 引物: . 上游引物: 下游引物: 上游引物: 下游引物: ..主要试剂和溶剂 ... 主要试剂 培养基 胎牛血清 胰蛋白酶 青链霉素 提取试剂盒 北京艾德莱生物有限公司 北京全式金生物技术有限公司 超纯 天跟生化科技北京有限公司 .反转录酶 天跟生化科技北京有限公司 、 宝生物大连有限公司 无水乙醇 北京化工厂 天跟生化科技京有限公司 北京天恩泽北京天恩泽 全式金 ...主要溶剂和配方 细胞培养基: 第二章一在组织和细胞中的表达差异每 细胞培养基是按以下比 例配置而成: 培养基、 胎牛血清、单位的青霉素和单位的链霉素,其中对于一的培 养基中还需另外加入单位的维生素和单位的非必需氨基酸。 平衡盐溶液: ,溶于 称取 、. 、. 和. 蒸馏水中,用调节溶液的值至.,最后加蒸馏水定容至即可。 ..主要仪器及设备 本文中所涉及的仪器设备见下表。 表.主要仪器设备 设备品名 型号 生产厂家 一 液氮柜 公司 美国 . 低温冰箱 日本三洋公司 超低温冰箱 . 日本三洋公司 / 液氮罐 公司 一 液氮罐 公