高活性蛋白酶乳酸菌的筛选

深圳大学综合性、设计性与探索研究性实验 课程名称：              微生物学实验                    实验项目名称：      高活性蛋白酶乳酸菌的筛选          学院 ：                  生命科学学院                   专业：                    生物科学                     指导教师：                  韩庆国                      人：  魏高斌  学号：   2011300161   班级：   5   实验时间：          2013-12-14~2013-12-31                                            提交时间：        2014-01-03                    高活性蛋白酶乳酸菌的筛选 [摘要]本实验利用添加了碳酸钙的改良乳酸菌的固体培养基通过初筛、复筛，火腿肠中得到一种能分解碳酸钙的菌种，对该菌种进行了形态学鉴定，确定此菌株属乳酸菌的乳酸球菌属。通过单因变量的改变，不断筛选分离得到高蛋白酶活性的乳酸菌种。 [关键词]乳酸菌、筛选、蛋白酶； 乳酸菌具有多种生理功能，乳酸菌具有提高食品营养价值，改善食品风味，延长保存时间，对人体具有多方面的保健作用，如能调节肠道菌群，维持体内微生态平衡，抑制肠道内腐败菌生长繁殖，消除体内有毒物质的产生，改善便秘，降低胆固醇水平，改善肝功能，缓解乳糖不耐症，改善维生素代谢，增强免疫，抗肿瘤，抗突变等，在畜牧业方面，乳酸菌还有增膘作用等，引起了人们广泛的研究兴趣，本文利用简单的培养分离纯化方法，利用单因素变量，将高蛋白酶活性的乳酸菌从肉类制品中分离筛选出来，这类高蛋白酶菌种在食品工业或畜牧业上有一定的意义。 1. 材料与方法 1.1. 材料 菌种来源：市售金锣火腿肠； 试剂：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸二铵、葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、吐温-60、去离子水、琼脂、碳酸钙、结晶紫染液、碘液、番红染液、干酪素； 器材：锥形瓶、烧杯、试管、培养皿、培养皿桶、移液管、洗耳球、接种环、移液器、移液器头、超净工作台、显微镜、电炉、分析天平、高压蒸汽锅、恒温培养箱等。 1.2. 培养基配方 1.2.1. 改良乳酸细菌固体培养基（MRS） 蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母膏4.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温-60 1.0 ml，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g、琼脂20.0 g，碳酸钙3%， pH 6.0~6.8，加蒸馏水至1000 ml。 1.2.2. 乳酸菌蛋白酶活性检测的固体培养基 蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母膏4.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温-60 1.0 ml，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g、琼脂20.0 g， 0.5%干酪素，pH 6.0~6.8，加蒸馏水至1000 ml。 1.3. 方法 1.3.1. 改良乳酸细菌培养基（MRS）配置 在室温的条件下，按照配方用分析天平分别使用称量纸称量：蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、酵母膏4.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，使用量程为1 ml的移液管量取吐温-60 1.0 ml到1000 ml烧杯中，与以上的全部试剂混匀，加去离子水至1000 ml，在电炉上稍微加热搅拌，以助于吐温-60的溶解，以制成pH 6.0~6.8的液体培养基。 分装于500ml锥形瓶中，每瓶200ml。 按配方称取琼脂4 g、碳酸钙6 g于一个锥形瓶中制备成筛选乳酸细菌的固体培养基；按配方称取琼脂4 g、干酪素1 g制备成乳酸菌蛋白酶活性检测的固体培养基；锥形瓶用干净的胶塞和报纸封口。包扎若干洁净试管，准备移液器头，培养皿，2瓶100ml去离子水，于高压蒸汽锅121℃灭菌15min后冷却至50℃待用。 1.3.2. 乳酸菌的分离和纯化 1.3.2.1. 乳酸菌的分离 在超市购买金锣火腿肠，用万分之一的天平称取10 g，在超净工作台中减碎放入装有90 ml 冷却的无菌水的150ml锥形瓶中，并充分混合均匀，即为稀释度为10-1的样品液，另取3根无菌试管，用移液管和洗耳球各加入10ml无菌水，使用无菌的1ml移液器将样品稀释至10-2、10-3、10-4，分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4 样品稀释液1 ml于培养皿中，然后倒入冷却至50℃后碳酸钙MRS固体培养基摇匀，待冷却后取出倒置于恒温培养箱中37 ℃、无氧条件下培养1-2天，并将剩余培养基倒平板，待用。 1.3.2.2. 乳酸菌的纯化 从培养了1-2天的碳酸钙MRS培养基上挑取有透明圈的菌落，进行革兰氏染色，取菌种培养物常规涂片、干燥、固定，滴加结晶紫初染1-2分钟，水洗，再用碘液冲去残余水渍，并用碘液覆盖媒染约1分钟后水洗，并用滤纸吸取载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，最后用番红液复染约2分钟，水洗，待干燥后，高倍镜观察。 在超净工作台中选取革兰氏阳性菌的透明圈菌落，在倒好碳酸钙MRS固体培养基平板上划线分离，于温培养箱中37 ℃、无氧条件下培养1-2天。重复以上操作，直至得到纯菌落。培养获得的乳酸菌，通过形态分析对菌种进行鉴定。 1.3.3. 乳酸菌蛋白酶活性的测定 在超净工作台下，取已纯化的乳酸菌，蛋白酶活性检测的MRS固体培养基上点接种若干个点，在保温箱里37摄氏度培养1-2天，当平板中干酪素分解时, 菌落周围会出现透明圈。 2. 实验结果 2.1. 乳酸菌的分离纯化及革兰氏鉴定 如图1所示，在火腿稀释度10-1浓度的碳酸钙MRS平板在37℃培养分离数日，其中有可以分解碳酸钙的菌落生长，分解碳酸钙产生透明圈，透明圈内有乳白色菌落，可初步认为此菌就是乳酸菌。 挑选透明圈中菌种进行革兰氏染色，结果呈阳性，如图2所示，菌落被染成紫色，在10×40高倍镜下观察，可观察到菌体形态呈球状，单个或链状排列，无芽孢，无荚膜，边缘光滑细腻，本实验认为此乳酸菌是乳杆菌属。 图 1 乳酸菌的筛选                图 2革兰氏染色鉴定乳酸菌 2.2. 乳酸菌的纯化 挑选透明圈内的乳酸菌落在新的碳酸钙MRS平板上划线分离，在37℃培养2day，可分离得到单个菌落的乳酸菌。 图 3 乳酸菌的纯化 2.3. 蛋白酶活的测定 从分离纯化出的菌落中选取单个菌落，接种到含干酪素的MRS培养在37℃培养2day，如图4所示，乳酸菌将含干酪素的MRS培养基的干酪素分解，并在其周围产生透明圈，说明了分离出的乳酸菌有分解蛋白的能力。 图 4 乳酸菌蛋白酶活性检测 3. 实验分析及讨论 3.1. 乳酸菌产酸的能力与应用 通过本实验的研究，验证了乳酸菌能够分解碳酸钙而出现透明圈，但产生的透明圈很小且需要培养数日才长出来，说明从火腿等肉类中提取出来的乳酸菌产酸的能力比较弱，可能是由于火腿肠在加工时经过较严格的灭菌使得乳酸菌的活力下降，或者是火腿中加入防腐剂过多抑制乳酸菌的生长，乳酸菌在分解碳酸钙产生透明圈并使透明圈内酸性增强，从另外一方面来说明，乳酸菌种能够耐酸，在酸性环境下生长，这在食品工业上有一定的意义。 3.2. 乳酸菌的高活性蛋白酶的应用 乳酸菌能够产生蛋白酶，蛋白酶会将此乳酸菌周围的干酪素水解。通过本实验的研究，验证了乳酸菌能够分解蛋白质而出现透明圈，且产生的透明圈较大，说明从火腿等肉类中提取出来的乳酸菌产酸分解蛋白质能力较强，这对在畜牧业中饲料增膘有一定积极意义。