气相色谱_质谱联用法检测新生儿脐带血多溴联苯醚

气相色谱_质谱联用法检测新生儿脐带血多溴联苯醚 作者:吴库生,郭勇勇,刘俊晓,徐锡金 单位:1汕头大学医学院分析细胞学实验室，广东 汕头 515041;2德州大学医学院预防医 学与公共卫生学系，环境毒理学部，加尔维斯敦 77555，美国 【摘要】 目的:建立新生儿脐带血中多溴联苯醚的分析。方法:血液样品采用离心和 分离，提取血清并经正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液萃取，萃取前加入回收率指示物，然后 经干燥得到脂肪质量，脂肪再经正己烷溶解、硫酸酸洗和酸性硅胶柱净化后，加内标，利用 带负化学源的气相色谱_质谱联用仪，采用选择离子检测法和内标法进行定性和定量。结果: 加标回收率78.0%,110.0%;样品回收率82.3%;方法检出限0.01,0.09ng。结论:该法检 测电子垃圾拆解区新生儿脐带血中7种多溴联苯醚的同系物，灵敏度高、重复性好、回收率 良好。 【关键词】 多溴联苯醚;脐带血，新生儿;气相色谱_质谱;负离子化学源 Determination of Polybrominated Diphenyl Ethers in Newborn Umbilical Cord Blood by Gas Chromatography_Mass SpectrometryWU Ku_sheng1，GUO Yong_yong1，LIU Jun_xiao1，XU Xi_jin1，W W Au2，SHAO Guo1，HUO Xia1 (1 Analytical Cytology Laboratory，Shantou University Medical College，Shantou 515041， China，2 Division of Environmental Toxicology，Department of Preventive Medicine and Community Health，The University of Texas Medical Branch，Galveston， Texas 77555，USA) ,Abstract,Objective: To develop a method for determination of polybrominated diphenyl ethers(PBDEs)in newborn umbilical cord blood by gas chromatography_mass spectrometry(GC_MS). Methods: The serum samples from newborn umbilical cord blood were separated by centrifuging operation. The serum samples were extracted with n_hexane/methyl t_butyl ether，and the coefficient of recovery indicator was added before extraction(The organic phases were evaporated to dryness for extracted lipid content( Lipid was dissolved with n_hexane and washed with H2SO4，and then cleaned up with a silica/sulfuric acid column( The internal standard was added prior to GC_MS analysis with negative chemical ionization in selected ion monitoring mode( Results: The average recovery of the internal standard was from 78.0% to 110.0%. The average recovery of the samples was 82.3%. The detection limit of the method was within range of 0.01 to 0.09 ng(Conclusion: The method developed for determination of seven PBDEs congeners in newborn umbilical cord blood from an e_waste recycling area is sensitive， high reproducible with satisfied recoveries. ,Key Words,polybrominated diphenyl ether，umbilical cord blood，newborn,gas chromatography_mass spectrometry，negative chemical ionization 多溴联苯醚(PBDEs)是一系列含溴原子的芳香族化合物，化学通式C12H(0,9)Br(1,10)O， 根据苯环上溴原子的个数和位置的不同，总共有209种同分异构体。由于PBDEs高效的阻 燃性能及廉价性，其作为阻燃剂被广泛添加于各种产品特别是电子电器产品中,1,。由于 PBDEs是物理结合到各种产品中的，易随废弃电子产品进入大气、水源、土壤以及人类的 食物链，最终进入人体，因此对环境和人体可造成巨大的潜伏性危害。由于欧盟RoHS指令 的实施，国内、外已广泛开展了对各种产品中PBDEs的研究，但人体样品特别是新生儿脐 带血中PBDEs的研究还少见报道。由于人体血液样品中PBDEs浓度较低，且PBDEs在实 验过程中易被干扰，样品处理过程极为复杂，故增加了其检测难度。但血液样品又是了解人 体对于此类物质暴露的最直接、重要的途径，因此检测人体血液样品中PBDEs浓度进行健 康评估又是非常必要的。我们在参考美国环保署EPA1614方法的基础上，针对人体血样采 集量少的局限，经过血清分离、脂肪提取、酸性硅胶柱净化、样品浓缩和带负离子化学源(NCI) Http://Www.Yaokuo.Com 的气相色谱_质谱(GC_MS)联用的检测法，建立针对脐带血样品中痕量PBDEs的检测方法。 1 材料与方法 1.1 试剂和仪器 丙酮、正己烷、甲基叔丁基醚、二氯甲烷和异丙醇均为农残级试剂(TEDIA公司，美国);HCl(体积分数37%)和H2SO4(体积分数99.9%)(Sigma_Aldrich公司，德国。分析纯);硅胶(Fluka公司，瑞士。孔径60埃，粒径63,200μm);无水硫酸钠和KCl(广东西陇化工厂，中国。AR级)。混合标样包含2，4，4′_三溴联苯醚(BDE_28)、2，2′，4，4′_四溴联苯醚(BDE_47)、2，2′，4，4′，5_五溴联苯醚(BDE_99)、2，2′，4，4′，6_五溴联苯醚(BDE_100)、2，2′，4，4′，5，5′_六溴联苯醚(BDE_153)、2，2′，4，4′，5，6′_六溴联苯醚(BDE_154)、2，2′，3，4，4′，5′，6_七溴联苯醚(BDE_183)和十溴联苯醚(BDE_209);单标有3，3′，4，4′_四溴联苯醚(BDE_77)、2，3′，4，4′,5_五溴联苯醚(BDE_118)和2，2′，3，4，4′，5′_六溴联苯醚(BDE_138)(Cambridge Isotope Laboratories公司，美国)。气相色谱_质谱联用仪(安捷伦公司，美国。Agilent GC_MS:7890A_5975C，带化学电离源)、Buchi R_210旋转蒸发仪(Buchi公司，瑞士)、QGC_12T干热式氮吹仪(上海泉岛公司，中国)、Milli_Q Academic超纯水机(Millipore公司，法国)、SXT_02索氏抽提仪(上海洪纪公司，中国)、DC_B/10智能箱式高温炉(北京独创公司，中国)、BS224S电子天平(Sartorius公司，德国)、Supelco固相微萃取装置(Supelco公司，美国)、HN1006超声波清洗机(华南超声设备厂，中国)、低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂，中国)、样品萃取用聚四氟乙烯分液漏斗以及其它分析及处理用玻璃仪器等。 1.2 酸性硅胶管柱的制备 把硅胶放在智能箱式高温炉中120?活化12h，冷却后加入浓硫酸(重量比3?2)摇匀，平衡过夜，置于干燥器中备用。玻璃棉在400?焙烧4h后置于干燥器备用。将制备好的酸性硅胶装入玻璃柱，其长度约20cm，下层装1cm玻璃棉和1cm无水硫酸钠，装入约15cm酸性硅胶后，再装入2cm的无水硫酸钠备用。 1.3 无水硫酸钠和KCl的处理 无水硫酸钠和KCl于600?焙烧4h后，密封于干燥器中待用。另配制质量分数1%的KCl溶液备用。 1.4 血液样品的处理 1.4.1 血清分离及脂肪提取 将采集的新生儿脐带血约15mL离心10min，2000,2500r/min，取上清液，即得血清。取5mL血清倒人聚四氟乙烯分液漏斗，添加回收率指示物后，加入6mol/L HCl 2mL，振荡，然后快速加入10mL异丙醇，剧烈振荡，之后再加入10mL已配好的正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液(1?1)，振荡，静止，分层，分离出有机相，再用10mL和5mL上述混合溶液分别萃取分离出的水相，合并3次有机相萃取液，用5mL 1% KCl溶液洗涤，弃KCl溶液，有机相用无水硫酸钠脱水干燥后，在旋转蒸发仪上浓缩到0.5mL左右，转移到样品小瓶中，在氮吹仪上用高纯氮气缓缓吹至溶剂快要干时，放于干燥器恒重后，得到脂肪质量。 1.4.2 PBDEs提取和净化 用5mL正己烷溶解脂肪并转移到玻璃离心管中，加入2mL浓硫酸，振荡后静置过夜，2000r/min离心10min，把上层有机溶液移入另1支离心管中，再加入2mL浓硫酸酸洗，而用正己烷萃取下层浓硫酸，合并有机相，同样方法酸洗3次。收集约30mL有机相在旋转蒸发仪上浓缩至1mL，然后过酸性硅胶柱，用10mL正己烷淋洗，接正己烷组分后，在旋转蒸发仪上旋蒸到约1mL，高纯氮气吹至将干，加入10μL内标化合物BDE_138后，加正已烷定容至40μL，密封于带玻璃内插管的自动进样瓶中待测。 1.5 GC_MS条件优化 Http://Www.Yaokuo.Com 色谱柱为HP_5MS，弱极性毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm;载气He，恒流，柱流量1mL/min，无分流进样，进样量为1μL;进样口温度260?。升温程序:80?(1min)→4?/min→250?(0min)→25?/min→310?(5min)。BDE209使用HP_5MS，12m×0.20mm×0.33μm弱极性毛细管短柱，升温程序:80?(1min)→10?/min→250?(0min)→15?/min→310?(5min)，余条件相同。为提高检测灵敏度，采用NCI，用CH4作为反应气。离子源温度150?，四极杆温度150?，GC_MS接口温度280?，选择离子检测(SIM)方式扫描，扫描离子m/z为79和81。溶剂切除时间10min。BDE_209的扫描离子m/z为79、81、486.7和488.7。 1.6 标准曲线建立 标准溶液浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32和64ng/mL，内标物浓度10ng/mL。用内标法对8个不同浓度的标准溶液中各目标化合物的峰面积和浓度建立校正曲线，并在相同的检测条件下利用此标准曲线对实际样品PBDEs各组分进行定量。 2 结果 2.1 标准曲线 采用内标法定量时，校正曲线中各点由校正表中某一峰的各级浓度比率和响应值比率的计算值构成。浓度比率是指该级化合物浓度除以内标浓度;响应值比率是指该级化合物响应面积或高度除以内标面积或高度。本法中建立的7种化合物校正曲线回归方程及相关系数见表1。表1 PBDEs7种同系物的保留时间、校正曲线和相关系数 2.2 回收率、精密度和检测限 用0.6mL的小牛血清加4.4mL超纯水作为基质空白，不加任何物质，按实验流程分析，目的是为了控制实验过程可能存在的污染，样品中所测值要扣除空白值。在基质(小牛血清)中加入一定浓度的目标化合物，加标浓度2、20和40ng/mL，进行全流程分析，各为3个重复样，最后得出目标化合物的加标回收率为78.0%,110.0%。方法检测限是用小牛血清作基质，加入高、中、低不同浓度的标准样品，每一浓度可有3个重复样，按实验流程处理后，计算各目标化合物的标准偏差(S)，根据公式检测限=3.36×S，得方法检测限为0.01,0.09ng。添加于样品中回收率指示物BDE_77的平均样品回收率为82.3%。 2.3 脐带血实际样品分析 用上述方法对来自中国最大的电子垃圾拆解区——广东省贵屿镇38例新生儿脐带血样品的7种PBDEs同系物进行检测(表2)。表2 脐带血样品中7种PBDEs目标化合物浓度 3 讨论 由于PBDEs广泛的生物毒性，其作为持久性有机污染物(POPs)逐渐引起全球关注。对于PBDEs在各种产品及环境中的检测一般采用GC_MS或液相色谱(LC)_MS联用法。由于PBDEs为物理添加于各种电子电器产品中，且相对浓度较高，因此对电子电器产品中PBDEs的检测无论样品前处理还是仪器分析都相对较简单，且一般使用带电子电离源(EI)的GC_MS。由于血液样品基质的复杂性及血液中PBDEs痕量性，使得对于血液样品中PBDEs的检测变得相对困难。我们在实验中发现使用EI检测脐带血PBDEs时灵敏度偏低。为提高其灵敏度，我们使用了带CI的GC_MS法，且使用SIM扫描方式。结果证实，用这种方法检测PBDEs，可大大提高灵敏度，使方法检测限达到了0.01ng。对于柱箱的升温程序，虽然PBDEs有209种同系物，但由于我们检测的化合物种类较少，因此使用快速升温方式，以求缩短出峰和检测时间。以上带NCI的GC_MS联用法，通过SIM法检测新生儿脐带血样品中的PBDEs，样品量少、灵敏度高、检测限低和回收率较高，能够较好地满足脐带血样品中痕量PBDEs分析，为在电子垃圾拆解区或PBDEs污染区开展人群健康监测及相关的研究提供了有力工具。 Http://Www.Yaokuo.Com 我们用上述方法检测了来自广东省贵屿镇38例新生儿脐带血7种PBDEs同系物的浓度。 初步结果显示该地区新生儿体内PBDEs浓度已处于较高水平，其中BDE_47最高浓度达 849.23ng/g脂质，比目前认为浓度较高的北美地区报道的最高浓度还高出了几倍,2,。且 BDE_47和BDE_153是其体内PBDEs的主要同源物，这和目前其它有关人体研究报道基本 一致,3,。广东省贵屿镇被称为“世界电子垃圾终点站”，有20多年的电子垃 圾原始拆解历史。在电子垃圾的原始拆解过程中，PBDEs极易释放到周围环境中，且PBDEs 具有高生物活性、持久性、脂溶性等特点，可沿食物链逐级放大，可在环境中远距离迁移， 对人类生存繁衍和持续发展构成重大威胁,4,。目前已有多项在贵屿进行的研究证实，贵屿 环境中PBDEs等持久性有机污染物已处于极高水平,5,10,，从而造成人群PBDEs等的持 续高剂量暴露。PBDEs可通过胎盘屏障进入胎儿体内,11,，并可通过母乳进入婴幼儿体内， 室内灰尘也是其暴露的主要来源,12,。由于这些途径的暴露及排泄功能的不完善，婴儿和 初学走路的孩子有最高的PBDEs负荷,13,。因此，监测人群特别是排泄功能不完善的新生 儿体内PBDEs水平具有重要的健康指导意义。 【参考文献】 ,1,WANG Y, JIANG G, LAM P K, et al. 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