马铃薯中消炎成分的提取及其消炎作用的比较研究

马铃薯中消炎成分的提取及其消炎作用的比较研究 21 摘 要 目前马铃薯用于消炎止痛时一般采取现切现用、以马铃薯片敷于患处的，但是片 状马铃薯久放或贴敷后变色，需频繁更换，使用不便。本实验拟提取马铃薯中的主要消炎 成分、进行定性、定量，并将主要消炎成分制成软膏，以小鼠皮肤炎症模型比较马铃 薯软膏、马铃薯片与消炎药物的疗效。 关键词 马铃薯 消炎 生物碱 水溶性维生素 马铃薯提取物软膏 1 前言 马铃薯又名土豆、洋芋、山药蛋、薯仔、茨仔等，富含淀粉、蛋白质、多种维生素 及矿物质等，一直深受百姓喜爱。同时作为中草药的一种，马铃薯也常被中医用作和胃健 中、解毒消肿的天然药物。马铃薯性平味甘，具有抗感染、解毒、消肿镇痛、缓解痉挛、 促进细胞再生和伤口愈合等作用，对人体无刺激，副作用小。 以片状马铃薯贴敷患处的方法来消除红肿及疼痛已经广为人知，并有显著效果。临床 常用马铃薯片来缓解肿瘤病人因化疗而导致的外周静脉输液外渗性损伤，而且效果比50% 硫酸镁更有效，即使长期使用也不会产生消炎止痛膏的毒副作用及依赖性。但是片状马铃 薯在使用上存在一定弊端，如必须现切现用、贴敷时需经常更换、水份容易蒸发等，给病 人的使用带来了很大的不便。因此需要寻找一种更好的利用马铃薯消炎的替代方法。 本实验拟提取马铃薯中消炎的有效成分，并将主要消炎成分以不同配比制成软膏，以 动物模型比较马铃薯软膏、马铃薯片与消炎药膏的消炎效果。 2 实验目的 提取马铃薯中消炎的主要有效成分并制成软膏，鉴定马铃薯软膏的消炎效果，为临床 探索一种利用马铃薯消炎的最佳。 3 实验原理 3.1 马铃薯中消炎成分分析 马铃薯中的龙葵碱(茄碱)具有兴奋平滑肌和加强血液流通作用。维生素B2 参与糖、 蛋白质及脂肪的代谢，可保护皮肤免受炎症的侵害;维生素B1 能激活胆碱乙酰化酶，有维 持神经系统的功能及抗神经炎的作用，从而防止病人皮肤受损，减少医源性损害。 3.2 龙葵碱和水溶性维生素的提取 3.2.1 龙葵碱 22 马铃薯中所含的生物碱主要为龙葵碱，其化学结构见图1。大多数生物碱几乎不溶 于水或难溶于水，易溶于乙醇、甘油等有机溶剂。 图1 龙葵碱的化学结构 3.2.2 维生素B1 维生素B1 的化学结构见图2，在酸性溶液中很稳定，在碱性溶液中对热极不稳定， 易被氧化和受热破坏。 3.2.3 维生素B2 维生素B2(结构见图3)能溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液，在 酸性条件下也有一定的溶解度，对空气、热稳定，且在酸中非常稳定，即使短时间内高 压加热亦不至于破坏。但在碱性溶液中则较易被破坏。游离核黄素对光敏感，特别是紫外 线，可产生不可逆分解。 图2 维生素B1 的结构 图3 维生素B2 的结构 本实验选用制药时常用的提取剂——盐酸一次提取维生素B1 和B2。在酸性条件 下维生素B1 和B2 都有一定的溶解度，且化学性质比较稳定。 3.3 龙葵碱和水溶性维生素的鉴定 3.3.1 龙葵碱的鉴定 龙葵碱的鉴定有沉淀反应和显色反应两种。但由于马铃薯含大量蛋白质及多糖，对沉 淀反应影响较大，所以选用显色反应。在稀硫酸中龙葵碱与甲醛溶液作用生成橙红色化合 23 物。 3.3.2 水溶性维生素的鉴定 利用重氮苯磺酸反应鉴定维生素B1:在碳酸氢钠存在的碱性条件下，硫胺素可与重氮 苯磺酸作用产生红色。 维生素B2 的乙醇中性溶液和水溶液呈黄色，在中性或酸性溶液中经光照射自身可产生 黄绿色荧光，在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比。核黄素能被亚硫酸盐还原成 无色的二氢化物，失去荧光。但此氢化物在空气中易被重新氧化，恢复荧光。 3.4 龙葵碱和水溶性维生素的定量 根据Lambert-Beer 定律A=KCL 计算龙葵碱、维生素B1、B2 的质量浓度C (mg/ml) ， 并转化为50g 马铃薯中的含量。其中A 为吸光度;L 为比色皿厚度单位是cm;K 为吸光系 数，在入射光的波长、溶液种类和温度一定的条件下K 为定值: 530nm 波长处龙葵碱的 吸光系数K 为177;246nm 波长处Vit B1 的吸光系数K 为421;444nm 波长处Vit B2 的吸光系数K 为323; (cm)为比色皿厚度。(上述吸光系数为根据已有文献的L 实验数据 计算而得到[12])。 4 实验设备 实验主要仪器包括离心机、电子天平、台式酸度计、紫外-可见分光光度计、紫光灯。 实验器材主要包括索氏提取器、抽滤装置、研钵、一次性皮试点刺针、计时器、直尺 等。 5 实验材料及试剂 5.1 实验材料 马铃薯(新鲜马铃薯及发芽马铃薯)、小鼠、消炎止痛膏(喜疗妥软膏)。 5.2 试剂及其配制 5.2.1 试剂 95%乙醇、5%稀硫酸、甲醛;0.01mol/L 的盐酸、碳酸氢钠、氢氧化钠、对氨基苯磺酸、 浓盐酸、亚硝酸钠、2.5%亚硫酸氢钠溶液(用2%碳酸钠作溶剂);甘油、明胶;8%硫化钠 酒精溶液、花生四烯酸。 5.2.2 主要试剂的配制 碳酸氢钠碱性溶液:取氢氧化钠1g 溶于30 ml 蒸馏水中，加碳酸氢钠1.5 g，混匀后， 用水稀释至50 ml。 重氮试剂的配制:溶液A:将对氨基苯磺酸1 g 溶解于15 ml 浓盐酸中，然后加水稀释 24 至100 ml。溶液B:将亚硝酸钠0.5 g 溶解于水中，稀释到100 ml。现用现配。需用时，将 3 ml 溶液B 加到100 ml 溶液A 中，混匀即得重氮试剂，在冰浴中保存，至少15 min 后方 可使用。此溶液配好后，存放时间不能超过24 h。 4%花生四烯酸稀释液:取10%食品级花生四烯酸10g 溶于25ml 无水乙醇中。 明胶溶液:称取20g 明胶，放入盛有70 ml 温热(40?)的甘油和10ml 蒸馏水的烧杯 中，并使其充分溶解后备用。 6 实验操作步骤 6.1 龙葵碱的提取、鉴定与定量 6.1.1 提取 称取50g 马铃薯，切成小块，用研钵、研杵稍加研磨后装滤纸筒内。加入3~5ml 95%乙 醇溶液清洗研钵、研杵后洗液转移入索氏提取器(图4)中。在圆底烧瓶中倒入80ml 95%乙 醇溶液，在索氏提取器中抽提1~1.5 h 后，得到龙葵碱提取液，测量提取液的体 1 ，单 积为V 位ml。 图4 龙葵碱的提取 6.1.2 鉴定 将少量提取液进行离心，得到滤液，取滤液2ml，加入5 滴5%稀硫酸，震荡，充分混合 后加入甲醛溶液，如溶液显橙红色，则证明提取液中含龙葵碱。 6.1.3 定量 测定530nm 处的吸光度(A530)，根据A=KCL，计算龙葵碱的质量浓度C(mg/ml)。530nm 波长处龙葵碱的吸光系数K 为为177;(cm)为比色皿厚度。 L 6.2 水溶性维生素的提取、鉴定与定量 6.2.1 提取 25 在锥形瓶中加入0.01mol/L 的盐酸100ml，称取50g 马铃薯磨成碎末放入锥形瓶中，用 力振荡5min 并搅拌5min。放置10 min 后，用抽滤装置抽滤，将滤液离心后取上清液，备 用，标记为维生素提取液，测量提取液的体积为V2，单位ml。注意避光保存。 6.2.2 鉴定 维生素B1 的鉴定:取提取液1 ml，加入碳酸氢钠碱性溶液1.5 ml，再加入重氮苯磺酸， 摇匀后，在10 min 内观察到深红色的出现，则为维生素B1。 维生素B2 的鉴定:分别取提取液2ml 于A、B 两试管中，在紫光灯下观察其黄绿色荧 光。在A 试管中加入5,10 滴亚硫酸氢钠溶液，比较两管的荧光。若A 试管荧光消失，则 为维生素B2。 6.2.3 定量 分别测定246nm、444nm 处吸光度(A246、A444)，根据A=KCL，分别计算维生素 B1、B2 的质量浓度C(mg/ml)。246nm 波长处维生素B1 的吸光系数K 为421;444nm 波 长处维生素B2 的吸光系数K 为323;L(cm)为比色皿厚度。 6.3 马铃薯提取物软膏的制备 按下表分别取生物碱提取液、维生素提取液、明胶溶液若干，混合，在蒸发皿中加热 溶解，再在室温下冷凝为胶状，制备不同配比的马铃薯软膏。 表1 马铃薯提取物软膏主要成分的配比 成分(ml) 1 号软膏 2 号软膏 3 号软膏 4 号软膏 生物碱提 取液 5 10 5 10 95%乙醇 5 - 5 - 维生素提 取液 5 5 10 10 0.01mol/L HCl 5 5 - - 明胶溶液 30 30 30 30 总体积 50 50 50 50 6.4 马铃薯提取物软膏与马铃薯片、消炎药膏的疗效比较 6.4.1 小鼠皮肤炎症模型的制备 选取同种系、同性、年龄、体重等指标相近的小白鼠共10 只，每只小鼠均用8%硫化 26 钠酒精溶液脱毛，再在后腰两侧位置上用4%花生四烯酸稀释液对称点刺共4 处，并作好记 号。30min 后测定红斑的直径。 6.4.2 消炎处理 将10 只皮肤炎症模型小鼠随机分成两组。第一组五只小鼠分别编号为A、B、C、D、 E。该组小白鼠点刺部位标记为1~4 号位置，消炎处理方法为:1 号位置为空白对照，2 号 位置敷马铃薯片(约1cm×1cm，新鲜制备)，3 号位置敷马铃薯提取物1 号软膏，4 号位置 涂抹消炎止痛膏。比较不同处理对伤口消肿的作用。 消炎处理后每隔10min 揭开贴敷处测定红斑的直径。 6.5 不同配比的马铃薯提取物软膏的消炎作用比较 取第二组皮肤炎症模型小鼠共五只，分别编号为甲、乙、丙、丁、戊。该组小白鼠点 刺部位标记为a~d 位，消炎处理方法:a 位敷1 号软膏，b 位敷2 号软膏，c 位敷3 号软膏， d 位敷4 号软膏。敷上马铃薯提取物软膏后用保鲜膜包裹贴敷处。 在6.4.2 确定的消炎处理疗效显著的时间点，测定红斑的直径，比较不同配比的马铃薯 提取物软膏的消肿效果。 7 结果及计算 7.1 龙葵碱、维生素B1、B2 的定性结果 龙葵碱的鉴定结果与原因分析; 维生素B1 的鉴定结果与原因分析; 维生素B2 的鉴定结果与原因分析; 7.2 龙葵碱、维生素B1、B2 的定量结果 龙葵碱的吸光度A530;马铃薯中龙葵碱的含量(mg/50g)= ,A530/(177×L), ×V1。 维生素B1 的A246;马铃薯中维生素B1 的含量(mg/50g)=, A246/(421×L), ×V2。 维生素B2 的A444;马铃薯中维生素B2 的含量(mg/50g)=,A444/(323×L),× V2。 7.3 马铃薯软膏与马铃薯片、消炎药膏的疗效比较 7.3.1 皮肤炎症程度的判断 表2 花生四稀酸点刺30 分钟后红斑直径(单位:mm) A 小鼠 B 小鼠 C 小鼠 D 小鼠 E 小鼠 1 号位 27 2 号位 3 号位 4 号位 结果统计分析:比较红斑直径的均值，分析同一只小鼠四个部位的红斑直径是否 存在 差异;五只小鼠之间是否存在差异。 7.3.2 三种消炎方法的疗效比较 表3 不同消炎方法处理后红斑直径(单位:mm) 时间(min) 10 20 30 40 50 60 A 小鼠1 号位 B 小鼠1 号位 C 小鼠1 号位 D 小鼠1 号位 E 小鼠1 号位 A 小鼠2 号位 B 小鼠2 号位 C 小鼠2 号位 D 小鼠2 号位 E 小鼠2 号位 A 小鼠3 号位 B 小鼠3 号位 C 小鼠3 号位 D 小鼠3 号位 E 小鼠3 号位 A 小鼠4 号位 B 小鼠4 号位 C 小鼠4 号位 D 小鼠4 号位 28 E 小鼠4 号位 注:1,4 号位分别为空白对照、马铃薯片、马铃薯软膏、消炎药膏。 结果统计分析:无任何处理时红斑直径的变化(炎症的自愈情况);每一种消炎 方法 处理疗效最显著的时间点，寻找三种处理疗效均较显著的时间点。 计算疗效最显著的时间点不同消炎方法处理后红斑直径与处理前红斑直径的差值(见 表4)，以F 检验进行统计分析各处理组间是否存在显著差异。 表4 疗效最显著的时间点不同消炎方法处理后红斑直径的变化(单位:mm) 1 号位 (空白对 照) 2 号位 (马铃薯 片) 3 号位 (马铃薯 软膏) 4 号位 (消炎止 痛膏) A 小鼠 B 小鼠 C 小鼠 D 小鼠 E 小鼠 均值 方差 7.4 不同配比的马铃薯软膏消炎作用的比较 7.4.1 皮肤炎症程度的判断 表5 花生四稀酸点刺30 分钟后红斑直径(单位:mm) 甲小鼠 乙小鼠 丙小鼠 丁小鼠 戊小鼠 a 位 b 位 c 位 d 位 结果统计分析:比较红斑直径的均值，分析同一只小鼠四个部位的红斑直径是否 存在 差异;五只小鼠之间是否存在差异。 7.4.2 不同配比的马铃薯软膏处理后的红斑直径 在前一实验确定的疗效最显著的时间点，以四种不同配比的软膏处理红肿部位， 29 处理后五只小鼠各四个部位的红斑直径(表6)。 表6 马铃薯软膏处理后红斑直径(单位:mm) 甲小鼠 乙小鼠 丙小鼠 丁小鼠 戊小鼠 a 位 b 位 c 位 d 位 注:a、b、c、d 号位分别敷1,4 号软膏。 计算马铃薯软膏处理后与处理前红斑直径的差值(见表7)，以F 检验进行统计 分析各 处理组间是否存在显著差异。 表7 不同配比的软膏处理后红斑直径的变化(单位:mm) a 位 (1 号软 膏) b 位 (2 号软 膏) c 位 (3 号软 膏) d 位 (4 号软 膏) 甲小鼠 乙小鼠 丙小鼠 丁小鼠 戊小鼠 均值 方差 8 注意事项 维生素B1 在碱性溶液中容易分解变质。酸碱度在3.5 时可耐100?高温，酸碱大 于5 时易失效。遇光和热效价下降。故应置于遮光，凉处保存，不宜久贮。 在酸性 溶液中很稳 定，在碱性溶液中不稳定，易被氧化和受热破坏。 维生素B2 易溶于稀的氢氧化钠溶液，在强酸溶液中稳定，光照及紫外照射引起 不 可逆的分解，在碱溶液中加热可被破坏。 重氮苯磺酸在干燥时有爆炸性，应密封于0,4?保存。避免干燥。 小白鼠脱毛时要小心，尽量控制小白鼠运动范围，不要伤及自己，也不要给小白 鼠留 下伤口以免影响实验的准确性。__