脐带血CD34^＋细胞免疫磁珠分选及其意义

脐带血CD34^＋细胞免疫磁珠分选及其意义 脐带血CD34^，细胞免疫磁珠分选及其意 义 医学临床研究2008年3月第25卷第3期JClinRes,Mar.2008,Vol25,No3 脐带血CD34+细胞免疫磁珠分选及其意义 刘竞争王前郑磊一熊石龙 (南方医科大学南方医院医学检验中心,广东广州510515) [摘要【目的】探讨免疫磁殊分选]CD34细胞及脐血中CD34细胞含量的意义【方. 法】脐血中分离单 核细胞后,采用EasySep正选人CD34免疫磁珠分选CD34细胞,流式细胞仪检测 分选前后CD34细胞的纯 度.【结果】分选前MNC中CD34细胞纯度为(1.14?0.71),分选后CD34细胞纯 度达到(91.55? 4.11).【结论】脐血作为CD34+造血干/祖细胞的来源以及免疫磁珠方法在获得高 纯度CD34细胞中有重 要的意义 [关键词]磁石;抗原,CD34;胎血 ImmunomagneticSeparationofCD34CellsfromUmbilicalCordBloodandItsLIU jing— zheng,WANGQian,ZHENGLei,etal(Department,NanfangHospital,SouthernMedical University,Cruangzhou510515,Ozina) [Abstract][Objective]ToinvestigatethesignificanceofimmunomagneticseparationofCD34cellsfrom cordblood.[Methods]Aftermononuclearcellswereisolatedfromumbilicalcordblood,CD34+cellswere separatedfrommononuclearcellsbyimmunomagneticcellsortingandtheirpercentagewasassessedbyflow cytometry.[Results]TheCD34percentageofmononuclearcellsbeforeseparationwas(1.14 ?0.71), whiletheCD34percentageafterimmunomagneticcellsortingwas(91.55?4.11).[Conclusion]Bothum— bilicalcordbloodasaresourceofCD34hematopoieticstemcell/progenitorcellandimmuno magneticcellsor— tingplayanimportantroleinprocuringCD34cellswithhighpurity. [Keywords]magnetitum;antigens,CD34;fetalblood [中图分类号]R714.56[文献标识码]A[文章编号]1671—7171(2008)03—0399—03 CD34细胞作为早期干/祖细胞的一种特征性 标志,在体外扩增培养,造血干细胞移植等有广泛的 应用.CD34细胞主要存在于骨髓,外周血和脐血 中,但是均含量低,需经过分选富集达到高纯度来应 用.CD34细胞分选技术成为研究造血干细胞及其 临床应用的关键的制约技术.所以,CD34的来源 以及如何获得高活性,高纯度的CD34细胞成为研 究的热点.本实验选用脐血作为研究对象,采用免 疫磁珠正性分选法探讨高纯度的CD34的分选方 法和细胞来源. 1材料与方法 l-l实验对象孕妇年龄20~35岁,足月妊娠,无 并发症,病毒检测HbsAg,HCV,anti—HIV1/2抗 体,梅毒抗体阴性.孕妇及丈夫均无血液系统疾病 及遗传性疾病家族史.每次采血量80,1lOmL. 标本来自于广州南方医科大学南方医院产科,所采 ? 论着? 脐血均征得产妇同意. 1.2试剂与设备无菌脐带血采血袋(PCD-A抗 凝);流式细胞仪,SW-CJ一2FD超净工作台(江苏,苏 州),离心机;淋巴细胞分离液(相对密度1.077)购自 AXIS-SHIELD公司,胎牛血清购自Hyclone;流式检 测单克隆抗体CD34一PE,CD34一FITC,CD34同型对照 抗体均为自BY)公司产品;EasySep(r)正选人CD34 试剂盒和D-PBS缓冲液购自StemCells公司. 1.3分离单核细胞先将脐血和PBS缓冲液(含 2的胎牛血清)按1:1稀释,再将稀释后血按2: 1的比例沿管壁缓慢加于淋巴分离液上,静置,分 层,离心,800×g,20rain,室温. 1.4洗涤单核细胞并计数吸取中间自膜层于另一 无菌试管中,加入5倍体积PBS缓冲液,混匀,离心, 250×g,10min,室温,弃去上清液.收集下层细胞沉 淀,加5倍体积的PBS缓冲液再次洗涤,250×g,10 min,室温,弃去上清.收集细胞沉淀,定量液体体积 *[基金项目]广东省自然科学基金(7300312);**通讯作者,Email:nflab@163?corn 医学临床研究2008年3月第25卷第3期JClinRes,Mar.2008,Vol25,No3 于5mL,采用改良牛鲍计数板计数单核细胞. 1.5免疫磁珠方法分选CD34细胞 1.5.1标记抗体,磁珠在一无菌试管内将单核细 胞浓度调整约为2×10./mL,体积为1mL,加入 100L的EasySep(r)CD34抗体混合物,用移液器 轻轻上下吹打混匀,室温静置孵育15min.用移液 器用力上下吹打EasySep(r)纳米磁珠5次,混匀磁 珠后,加入50L磁珠于细胞悬液中,充分吹打混 匀,室温孵育10min. 1.5.2分选CD34细胞,计数用D-PBS缓冲液 调整细胞悬液体积到2.5mL,混匀,将试管放人磁 极中,静置5min,将磁极连试管一起拿起,以连续缓 慢的动作倾倒磁极至倒置状态,倒出上清部分.磁 性标记的细胞由于EasySep(r)磁极磁场的吸引,仍 然留在试管内.保持磁极及试管倒置2,3S,然后 使试管口恢复向上的位置.重复此过程4,5次. 最后一次倾倒后将细胞悬液体积调整为300vL,计 数所选得CD34细胞数. 1.6检测 1.6.1细胞活力检测将提取的单核细胞和分选 后细胞制成细胞悬液,用0.4台盼蓝和细胞悬液1 :1混合,计数死亡细胞及总细胞数.死亡的细胞 可被染成蓝色,活细胞不着色.活细胞百分率一活 细胞数/总细胞数×100. 1.6.2流式细胞仪检测提取的单核细胞和分选 后细胞分为两管,调节细胞浓度为1×10,1×10 个/mL,分别加入CD34,PE抗体和PE阴性对照抗 体,避光孵育25,30min后,加2mLPBS离心洗涤 后,上机检测CD34纯度. 2结果 2.1细胞计数本次试验共收集脐血15份,单核 细胞平均密度为(1.96?0.34)×10个/mL,CD34 细胞平均密度为(1.28?0.15)×10个/mL. 2.2细胞活性单核细胞和免疫磁珠方法分选后 细胞活性均达97以上. 2.3流式检测免疫磁珠方法分选后流式结果见 图(1,2).CD34细胞的纯度鉴定:免疫磁珠分选前 CD34细胞的纯度为:(1.14?0.71)9/i;免疫磁珠分 选后CD34细胞的纯度为:(91.55--4-4.11)%; CD34细胞的回收率:(52.45?0.37)%. _' 星 i j R F啊t1种0.'F*~1-11扎?2 p呻_10:PlI州DC G咖G1C-at*G' 一 ?2 闺1免疫磁珠分选前{闺2免疫磁珠分选后 3讨论 人的造血干细胞具有多系分化潜能,主要存在于 CD34细胞群中,CD34只占骨髓单核细胞的0.5, 1.5,外周血的0.001,0.01oA及脐血的0.5, 3.5.因此,高效率获得CD34细胞对科研及临床 应用具有重要的意义.造血干细胞的经典来源是骨 髓,已经沿用了40多年,其提供足量的干细胞用于临 床移植治疗已经是有目共睹的口].供体在注射细胞 因子后,外周血通过分选系统也可以分选出CD34细 胞.近3年来,大多数的自体或异体骨髓抑制事实就 是来自外周血而非骨髓的白细胞.20世纪80年代末 90年代初,多数学者开始认识到,脐血是造血干细胞 的丰富来源.本实验结果证实脐血中CD34细胞含 量平均为(1.14?0.71)oA,与骨髓中含量相近.脐血 中CD34细胞较骨髓和外周血更为原始,增殖能力 强L2],对造血生长因子的刺激反应更敏感,且引起移 植物抗宿主反应低].另外,脐血干细胞具有来源 广,采集方便等优点.因此,脐血在将来的干细胞研 究和临床应用中会发挥重要的作用. 本实验采用的是右旋糖酐包被的磁珠,通过具 有双向特异性的四聚体抗体复合物(TAC),与靶细 胞特异性结合,该复合物同时识别目的细胞表面抗 原与右旋糖酐.磁性右旋糖酐铁颗粒很小,可以与 TAC标记的细胞有效的结合,而且不会影响随后的 FACS(流式细胞分选)分析.这种特异性结合的抗 原抗体复合物通过磁场时会被吸附滞留在磁场中, 而非CD34细胞不与磁珠结合,在分选过程就会被 医学临床研究2008年3月第25卷第3期JClinRes,Mar.2008,Vol25,?3 家庭环境与对立违抗性障碍儿童行为的相关性分析?论着? 刘小琴杨伟孙艳韦臻.管冰清. (1.湖南省娄底市康复医院,湖南娄底417000;2.中南大学湘雅二院精研所研究生,湖南长沙 410011;3.中南大学湘雅三院医学心理学研究生,湖南长沙410013) [摘要]【目的】探讨对立违抗性障碍(ODD)儿童的家庭环境特点及其与儿童行为的相关性.【方法】选用 Achenbach儿童行为量表(cBCL),家庭环境量表中文版(FES-CV)分别对75例0DD及75例正常儿童进行评 定.【结果]ODD儿童的社会能力各分量表分及总分均显着低于对照组(P<0.01), 行为问题各分董表分及总 分高于时照组(P<0.01);ODD儿童的家庭在FES-CV量表中亲密度,情感表达,组织性的评分低于时照组(P <O.05),矛盾性则显着高于对照组(P<O.01).FEcV的某些维度与ODD儿童的行为特点存在不同程度的 相关性【结论.]ODD儿童处在相对不良的家庭环境中,家庭环境对ODD儿童行为产生不良影响. [关键词]儿童行为;注意缺陷和分裂性行为障碍? RelationshipBetweenFamilyEnvironmentandDevelopmentofBehaviorinChildrenwith Oppo. sitionalDeftantDisorderLIUXino_qin,YANGWei,WEIZhe,nz(Rehabilitation HospitalofLoud[City,Hunan417000,China) [AbstraetJ[Objective]Tostudytherelationshipbetweenfamilyenvironmentandthebehaviorofchildren withoppositionaldefiantdisorder(0DD).[Methods]SeventyfivechildrenwithODDand75normalchildren wereassessedwithAchenbachehildbehaviorchecklist(CBCL)andFES— CV(familyenvironmentscale-chinese version).[Results]ChildrenwkhODDhadlowersocialcompetenceandmorebehaviorproblemsinCBCL, andtheyhadlowerscoresofcohesion,expressiveness,organizationandmoreconflictsthanthecontrolin FES-CV.Familyenvironmentfactorswereassociatedwithbehaviorproblems.[Conclusion]Childrenwith ODDhavemorebehaviorproblems,whichareassociatedwiththeirpoorerfamilyenvironment. [Keywords]childbehavior;attentiondeficitanddisruptivebehaviordisorders [中围分类号]R749.055[文献标识鹤]A[文章编号]1671—7171(2008)03—0401—03 倾倒出.在去处磁场后,收集复合物,从而达到分选 CD34细胞的目的.其他不与磁珠结合的细胞,如 T细胞会被分选出,从而可以部分的去除T细胞, 可以减轻或减少异体移植GVHD的发生].本试 验结果证实分选后可以得到高纯度(91.554-_ 4.11)造血于细胞,高纯度的造血于细胞的获得对 本实验的后续研究具有重要的意义.而且,高纯度 的造血干细胞的获得对于癌症的移植治疗,自身免 疫系统性疾病的白体移植,基因治疗和其他症状的 组织修复都具有重要的意义. 目前,以CD34McAb为基础的阳性分选 CD34细胞的方法有多种,常用的FACS, IsolexTM系统,CellPro系统,"Panning"AIS系统 以及免疫磁珠分选系统.FACS分选的CD34细 胞及其亚群细胞的纯度可高达95,99,是目前 分选CD34细胞纯度最高的方法,但是费用昂贵, 产率不高,未得到广泛应用,一般仅适合于基础研究 之用.其他的分选系统在富集纯度,回收产率,富集 时间,细胞活力及费用上各有利弊.免疫磁珠分选 方法在具有较高的获得纯度和回收率的同时,还有 操作简单的特点,相信以后在科学研究及临床应用 中的分选富集CD34细胞中会有广泛的应用. , [参考文献] E1]MartinPA,CoveneyC,KraftA,BrownN,da1.Commercial developmentofstemcelltechnologyflessonsfromthepast, strategiesforthefuture[j3.RegenMed,2006,1(6):801—807. [23SmeetsMEP,RaymakersRAP.Rhoclaminedullprogenitors aremorefrequentlyfoundincordbloodandhaveahighercolo— nogeniccapacitycomparedtobonemarrowandperipheral blood,withoutimmunophenotypicaldifferencesin-cludingad— hesionmolecules[J3.Blood,1996,88(Supp11)l108,109. [3]LansdorpMJ.Umbilicalcordbloodforallogeneictransplanta— tioninchildrenandadults[J].BoneMarrowTransplant, 2001.27:1-6. [4]ButtNM.CD34positiveselectionasprophylaxisagainstgraft verSushostdiseaseinallogeneicperipheralbloodstemcell transplantati0n[J].LeukLymphoma,2003,44(9):1509. (本文编辑:雷军)[收稿日期]2007—12一O1