电刺激小脑顶核对局灶脑缺血再灌注大鼠bcl-xl、bax蛋白表达的影响

电刺激小脑顶核对局灶脑缺血再灌注大鼠bcl-xl、bax蛋白表达的影响 DOC格式,方便您的复制修改删减 电刺激小脑顶核对局灶脑缺血再灌注大 鼠bcl-xl、bax蛋白表达的影响 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【摘要】 目的观察电刺激小脑顶核对局灶性缺血再灌注大鼠bcl-xl、bax蛋白表达的影响,探讨电刺激小脑顶核中枢神经元保护的作用机制。方法大鼠大脑中动脉线栓法制作脑缺血再灌注动物模型,随机分为假手术组(SC组),缺血再灌注组(I/R组),缺血再灌注+电刺激齿状核组(DN组),缺血再灌注组+电刺激小脑顶核组(FNS组)。 RT-PCR和免疫组织化学法检测凋亡抑制蛋白bcl-xl与促凋亡蛋白bax的表达,用图像分析仪测定光密度值。结果I/R组与SC组比较,bcl-xl与bax的表达增高(P0.05),与DN组比较,无显著差异(P0.05),予以电刺激小脑顶核干预后,上调了bcl-xl的表达,bax的表达明显减少,与I/R组和DN组有显著差异(P0.05)。结论电刺激小脑顶核增强局灶性缺血再灌注大鼠凋亡抑制蛋白bcl-xl的表达,下调促凋亡蛋白bax的表达,抑制局灶性缺血再灌注后神经细胞凋亡,可能是其中枢神经源保护作用机制之一。 【关键词】 电刺激小脑顶核;脑局灶性缺血再灌注;凋亡 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 研究发现,电刺激小脑顶核对脑局灶性缺血再灌注后神经损伤有保护作用,缩小梗死体积,减轻脑水肿的发生,其中枢神经源保护机制尚未完全阐明,可能与抗炎、抗凋亡有关〔1,2〕。细胞凋亡是缺血性脑血管病损伤级联反应病理过程中的重要环节,为缺血半暗带神经元死亡的主要形式。脑缺血再灌注后神经元凋亡受一系列基因调控,调控过程涉及许多 基因的表达及相互影响。本实验通过观察电刺激小脑顶核对脑局灶性缺血再灌注后大鼠bcl-xl、bax蛋白表达的影响,探讨电刺激对小脑顶核的中枢神经元保护作用机制。 1材料与方法 1.1实验动物和分组健康雄性Wistar大鼠40只,体重250,300 g,由重庆医科大学实验动中心提供。实验动物随机分为假手术组(SC组),缺血再灌注组(I/R),缺血再灌注+电刺激齿状核组(DN组),缺血再灌注组+电刺激小脑顶核组(FNS组)。SC组,大脑中动脉栓塞、小脑顶核电刺激手术过程及时间同其他组,但不阻断血管、不通电;I/R组为缺血2 h后再灌注24 h;DN组,再灌注同时电刺激齿状核1 h;FNS组,再灌注同时电刺激小脑顶核1 h。 1.2动物模型制备 1.2.1缺血/再灌注模型制作大鼠脑缺血再灌注模型〔3〕。术中出血较多、出现呼吸困难、取脑时发现蛛网膜下腔出血及提前死亡者剔除,并补足相应例数。动物苏醒后参考Longa等的5分评分法评分,2分或2分以上者入选本实验。 1.2.2电刺激水合氯醛(3.5%,1 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 固定于脑立体定向仪上,沿颅骨中线剪开头皮,暴露前囟,根据大鼠脑立体定位图谱进行核团定位,DN定位,前囟后11.6 mm,左旁开3.0 mm,深度6.5 mm;FNS定位,前囟后11.6 mm,左旁开1.1 mm,深度5.6 mm。钻开颅骨后,插入双极同心圆电极(100 μm,重庆医科大学生理学教研室),予强度50 μA,频率70 Hz,时程0.5 ms的电刺激,在刺激过程中动物始终处于浅麻醉状态。 1.3免疫组织化学染色法检测bcl-xl和bax表达灌注固定后,断头取脑。冠状切取视交叉后部脑组织,常规梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片脱蜡、水化,30 g/L H2O2室温10 min灭活内源性酶,蒸馏水洗涤3次;滴加正常血清封闭液,室温20 min,甩去余液;不同的切片分别适量加入羊抗大鼠bcl-xl和bax抗体(均购于北京中杉生物公司),4?湿盒内过夜。滴加生物素化二抗,37? 20 min;然后滴加链霉亲合素-生物素-过氧化氢酶复合物37? 20 min。用DAB显色,常规脱水、透明、封片。应用Image- pro plus5.0图像分析软件计算平均光密度值(OD),每只大鼠取三张切片采集免疫组化染色图像,在400倍下,每张切片随机取5个视野进行图像分析,并行平均光密度值测定分析。 1.4逆转录聚合酶链反应法检测bcl-xl和bax表达提取各组大鼠脑组织总RNA并定量,用DNAase I处理总RNA 以去除DNA污染,各实验组取同等量的RNA反转录后进行PCR。bcl-xl引物正义链,5′-GTGCGT GGA AAG CGT AGA CA-3′,反义链,5′- CAG CCA AGG TGA CCC ATT AC 3′,产物长度465 bp。内参β-actin引物正 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 义链,5′- GAC CCA GAT CAT GTT TGA GAC C -3′,反义链,5′- GCC AGGATAGAGCCACCAAT -3′,产物长度648 bp。bax引物正义链,5′-TTCATC CAG GAT CGA GCA GA-3′;反义链,5′-TGA GGA CTC CAG CCA CAA AGA -3′;产物长度457 bp。内参β-actin引物正义链,5′-CTG GTG GAC AAC ATC GCT CT-3′;反义链,5′-GGT CTG CTGACCTCACTTGTG-3′,产物长度349 bp。PCR 反应条件,9 5?变性5 min;95? 30 s,58? 30 s,72? 1 min,循环35次;72?延伸7 min。将PCR扩增的产物5 μl在20 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳,电压一般为70,80 V。电泳完毕后,取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果用Quantity One-4.4.0软件行定量分析,以目的基因与β-actin条带平均光密度比值表示目的基因mRNA的相对表达量。 1.5统计学处理数据以x?s表示,采用SPSS 12.0统计软件,根据方差齐性与否分别采用参数检验和非参数检验,齐性资料的多组间及组内之间比较均采用单因素方差分析,非齐性资料用秩和检验。 2结果 2.1免疫组织化学检测结果与分析免疫组织化学bcl-xl阳性细胞胞浆黄染,SC组可见少量的bcl-xl阳性细胞。I/R组和DN组阳性细胞较SC组多(P0.05),FNS组bcl-xl表达较I/R组和DN组增强(P0.05)。bax阳性细胞胞浆黄染色,SC组bax阳性细胞少,I/R组和DN组bax阳性细胞表达增多,呈强阳性表达(P0.05),FNS组与I/R组比较bax阳性细胞明显减少(P0.05),见图1、图2,表1。表1 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 各组大鼠的bcl-xl、bax蛋白表达图1免疫组织化学法检测bcl-xl(SABC,×400)图2免疫组织化学法检测bax(SABC,×400)表2各组大鼠的bcl-xl 及bax mRNA表 2.2RT-PCR检测结果与分析见表2,RT-PCR结果显示与SC组比较,I/R和DN组bcl-xl mRNA相对含量增高,FNS组bcl-xl mRNA相对含量与I/R和DN组比较升高(均P0.05)。与SC组相比,I/R组、DN组和FNS组bax mRNA表达相对强度均增高,差异具有统计学意义(P0.05),FNS组与I/R组比较mRNA表达相对强度明显降低(P0.05),DN组与I/R组比较baxmRNA表达相对强度无差异(P0.05),见图3、图4。图3RT-PCR检测大鼠bax mRNA表达图4RT-PCR检测大鼠bcl-xl mRNA的表达 3讨论 神经元凋亡是缺血性损伤过程中神经元死亡的重要形式,缺血半暗带神经元死亡主要是神经元的凋亡〔4〕。神经元凋亡是一种由基因控制的细胞主动死亡过程,涉及多个基因表达及相互影响的复杂过程。bcl-2家族是重要的凋亡调控基因,包括凋亡抑制基因bcl-2、bcl-xl、bcl-w等和促凋亡基因如bak、bad、bax、bcl-xs等〔5〕。bcl-xl是bcl-2家族的重要成员,脑缺血再灌注后,bcl-xl参与了对神经细胞凋亡的调节,通过 基因敲除、基因转染、转基因动物等实验发现其有效地抑制细胞凋亡和神经保护作用。bax是bcl-2家族与bcl-xl功能相拮抗的一个基因,通过与bcl-xl形成二聚体,拮抗bcl-xl的功能,促进细胞凋亡。bcl-xl/bax比值是决定细胞生存或死亡的重要因 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 素〔6~8〕。本研究发现,与正常组比较,缺血再灌注24 h后,大鼠 脑组织bax蛋白表达明显增高,而bcl-xl蛋白增高不明显,证实了 bax和bcl-xl参与了脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的调 节。近年 来对FNS启动预防性及治疗性中枢神经源性神经保护机制的研究提 示, FNS治疗可增加局部脑血流,减轻兴奋性神经毒性作用,保护 神经组织结构,促进神经功能恢复。本实验结果显示,脑缺血再灌注 后,促凋亡基因bax和抑制凋亡基因bcl-xl均表达增加,电刺激小脑 顶核干预后,下调了促凋亡基因bax的表达,而凋亡抑制基因bcl-xl 的表达进一步增强,电 刺激小脑齿状核对bax、bcl-xl的表达水平 无明显作用,提示电刺激小脑顶核通过促进抗凋亡基因bcl-xl的表达, 下调bax的表达,抑制了脑缺血再灌注后神经元的凋亡,可能是其发 挥中枢神经源性神经的机制之一,为缺血性卒中的实验研究和临床治 疗提供理论依据。 【参考文献】 1Glickstein SB,Iich CP,Reis DJ,et al.Stimulation of the subthalamic vasodilator area and fastigial nucleus independently protects the brain against focal ischemia〔J〕.Brain Res, 2001;92(7):47-59. 2Jin Y,Xie YP,Zhu XF.Neuronal differentiation of neural stem cells in co-transplanted rats with middle cerebral artery occlusion under electric stimulation ofcerebellar fastigial nucleus DOC格式论文,方便您的复制修改删减 〔J〕.J Clin Rehabil Tissu Enginee Res,2007;11(34):4752-5. 3罗勇,董为伟.Wistar大鼠插线法局灶脑缺血/再灌注模型 的实验研究〔J〕.重庆医科大学学报,2002;27(1):1-4. 4杨彦玲,陈雅慧.缺血性脑损伤与细胞凋亡〔J〕.军医进 修学院学报,2008;29(2):144-7. 5Tsujimoto Y,Shimizu S.Bcl-2 family:life-or-death 〔J〕.FEBS Lett,2000;466(1):6-10. 6Wang X,Zhang J,Kim HP,et al.Bcl-XL disrupts death-inducing signal complex formation in plasma membrane induced by hypoxia/reoxygenation 〔J〕.FASEB, 2004;18(3):1826-33. 7Klein D,Ribeiro MM,Mendoza V,et al.Delivery of Bcl-xl or its BH4 domainby protein transduction inhibits apoptosis in human islets〔J〕. Biochem Biophys Res Commun, 2004;323(2):473-8. 8王芙蓉,姜永生,刘艳,等.Bcl-xl基因过度表达在脑梗死中 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 的保护作用及细胞色素C与Caspase-3的表达研究〔J〕.中华急诊 医学杂志,2007;16(9):917-20.