高含量DHAEPA甘油三酯调节脂质代谢和改善胰岛素抵抗作用研究（可编辑）

高含量DHAEPA甘油三酯调节脂质代谢和改善胰岛素抵抗作用研究（可编辑） 高含量DHAEPA甘油三酯调节脂质代谢和改善胰岛素抵 抗作用研究 谨以此论文献给我敬爱的导师和父母 ------------ 朱昱哲附 英文缩 略词 DHA Docosahexaenoic acid 二十二碳六烯酸 EPA Eicosapntemacnioc acid 二十碳五烯酸 DHA/EPA-TG高含量 DHA /EPA 甘油三酯型鱼油 TC Total cholesterol 总胆固醇 TG Triglyceride 甘油三酯 A Poly-unsaturated fatty acid 多不饱和脂肪酸 PUF MUFA Mono-unsaturated fatty acid 单不饱和脂肪酸 SFA Saturated fatty acid 饱和脂肪酸 Sterol regulatory element binding SREBPs 固醇调节元件结合蛋白 proteins Peroxisome proliferator responsive PPAR 过氧化物酶体增殖物激活受体 element FAS Fatty acid synthase 脂肪酸合成酶 ME Malic enzyme 苹果酸酶 G6PDH Glucose-6-phosphate dehydrogenase 葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 CPT-1 Carnitine palmitoyl transferase-1 肉碱棕榈酰转移酶-1 POE Peroxisomal β-oxidation enzymes 过氧化物酶体 β- 氧化酶系 NAFLD Non-alcoholic faty liver disease 非酒精性脂肪肝 IR Insulin receptor 胰岛素受体 InsR-1/2 Insulin receptor substrate-1/2 胰岛素受体底物-1/2 磷脂酰肌醇 3 激酶 PI3K Phosphoinositide 3-kinase PKB Protein kinase B 蛋白激酶 B -3β Glycogen synthase kinase-3β GSK 糖原合成激酶 3β GLUT4 Glucose transporter 4 葡萄糖转运蛋白 4 I 高含量DHA/EPA 甘油三 酯调节 脂质 代谢和改 善胰岛 素抵抗 作 用的研究 摘 要 鱼油富含 DHA 和 EPA 等多不饱和脂肪酸, 具 有调节 血脂、 改善糖代谢、提 高免疫力、 补脑健脑 等功能。 目前, 市场上的 DHA/EPA 产品主要有甘油酯 型和 乙酯 型两种。 乙酯型鱼油 EPA 和 DHA 含量 较 高, 但 消化吸收困难, 还可能存在 安全隐患。甘油酯型是鱼油的天然存在形式, 但 DHA/EPA 相对含量较低 多在 30% 以下 。 高含量 DHA /EPA 甘油三酯型鱼油DHA/EPA-TG 已成为国际 功 能食 品 市场的主流产品, 但我国该类产品的生产技术落后。 本实验室采用 酶法催化 转 化 技术制备了高含量 DHA/EPA 甘油三酯型鱼 油,其中 DHA 和 EPA 总含量为 55% , 甘油三酯含量为 70% 。 本论文以 该高含 量 DHA/EPA 甘油三酯型鱼油为研 究对象, 利用 模型动物 探究了其 对脂质代谢的 调节作用,并探讨其分子 机制。 通过饲喂添加 1% 乳清酸的 饲料建立脂肪肝大鼠模型, 研究了其 对脂肪肝大 鼠脂质代谢的 调节作用 。 结果表明, 高含量 DHA/EPA 甘油三酯能显著降低 脂肪 肝 大鼠血脂 和肝脂水平, 增加粪便脂质排泄。 以 高含量 DHA/EPA 甘油三酯干预 20 d 后,脂肪肝大鼠血清 TC 含量显著降低; 肝脏 TC 和 TG 含量显著下降 ,肝 脏脂肪酸组成 有效改善 ; 粪便总脂质和 TC 含量 明显增加 。 提示, 高含量 DHA/EPA 甘油三酯对脂肪肝大鼠的脂质代谢具有较 好的调控作用 。 进一步 从脂肪酸合成 和 β- 氧化 两方面研 究了高含量 DHA/EPA 甘油三酯改善 脂质代谢的分子作用机制 。RT- PCR 结果显示, 摄食高含量 DHA/EPA 甘油 三酯后,SREBP-1c 及 FSA 、ME 、G6PDH 等脂 质合成相关基因的 mRNA 的 表达 量显著下调; PPAR-α 和 CPT-1 等脂质分解相关基因 的 mRNA 的表达量显著上调。 酶活力检测结果显示, 高含量 DHA/EPA 甘油三 酯可显著抑制 FAS 和 ME 等脂肪 酸从头合成过程中的关键限速酶活力 ;促进 CPT-1 和 POE 等脂肪酸分解过程的 关键限速酶活力。 以上结果表明 , 高含量 DHA/EPA 甘油三酯通过抑制脂肪合成, 促进脂肪氧化分解,有效调节 脂肪肝大鼠 的 脂质代谢 。 采 用 饲 喂 高 脂 高 糖 饲 料 法 建 立 ? 型 糖 尿 病 小 鼠 模 型 , 研究了 高含量 DHA/EPA 甘油三酯对胰岛素抵抗的改善作用 。结果表明,高含量 DHA/EPA 甘 II 油三酯 能显著降低 模型 小鼠的空腹血糖 值, 提高葡萄糖耐量水平, 降低空腹 血清 胰岛素 和胰岛素抵抗指数 , 增加肌糖原和肝糖原的合成 , 有良好的降低血糖和改 善胰岛素抵抗的作用。 高含量 DHA/EPA 甘油 三酯 能明显减少糖尿病小鼠血清和 肝脏脂质积累, 显著改善肝脏的脂肪酸组成, 提高 DHA 和 EPA 在肝脏 总脂肪酸 中的比例 。 采用 RT- PCR 法 研究了高含量 DHA/EPA 甘油三酯 改善小鼠胰岛素抵抗的作 用 机制。 结果表明, 高含量 DHA/EPA 甘油三酯 能显著提高肝脏和肌肉组 织中 IR 、 IRS 、PI3K 、PKB mRNA 的表达, 明显抑 制 GSK-3βmRNA 表达 , 显著上 调肌肉 和脂肪组织中 GLUT-4 mRNA 的表达。 提示 高 含量 DHA/EPA 甘油三酯能 明显上 调 胰岛素介导的 PI3K/PKB 信号转 导通路, 促进葡萄糖转运, 提高胰岛 素敏感性, 改善胰岛素抵抗。 综上所述,高含量 DHA/EPA 甘油三酯能有效 调节脂肪肝大鼠的脂质代谢, 显 著改善模型小鼠的胰岛素抵抗, 且较普通甘油三酯型 鱼油和乙酯型鱼 油呈现更 好的生理活性。 研究结果为 打破国 外高端鱼油产品 的技术垄断和产品垄 断, 极大 提高我国 鱼油产品 的国际竞争力 提供了理论依据。 关键 词:高含量 DHA/EPA 甘油三酯 ;脂质代谢 ;SREBP-1c ;FAS ;PPAR-α ; CPT-1; 胰 岛素抵抗; 胰岛素信号通 路 ;GSK-3β; GLUT4III The effect on lipid metabolism and insulin resistance of high-content DHA/EPA triglyceride Abstract Sea fish oil which is rich in DHADocosahexaenoic acid and EPAEicosapentaenoic acid has the regulation of adjusting blood lipids, improving blood sugar, enhancing immunity and increasing intelligence. At present, there are two kinds of DHA/EPA products in the market,which is glyceride and ethyl esterEthyl ester fish oil is rich in DHA and EPA, but is difficult in digestive absorptionGlyceride is the natural form of fish oil, while is less in DHA and EPA. High-content DHA/EPA triglyceride has become a mainstream product in international market,but our country has backward production technology of such products.Our lab use the enzymatic catalytic conversion technology to preparate high-content DHA/EPA triglyceride which has 55% DHA/EPA and 70% triglyceride. Thses paper which choose high-content DHA/EPA as the research product and study the effect on the improvement of the fatty liver lipid metabolism of ratsHigh-content DHA/EPA triglyceride could improve the disturbance of lipid metabolism on fatty liver rats which induced by 1% orotic acid. The result shows that this high-content DHA/EPA triglyceride can significantly decrease serum and hepatic lipids concentrations and increase the lipids of fecal. This high-content DHA/EPA triglyceride can significantly decrease serum TC; reduce hepatic TC, TG concentrations and improve the compose of fatty ccid; increase the contents of total lipids and TC of fecal after given this fish oil for 20 days.This prompts that this fish oil could improve the disturbance of lipid metabolism on fatty liver ratsTo clarify the molecule mechanism by which high-content DHA/EPA triglyceride laters hepatic lipid metobolism, we examined two pathways related in oxidation. The data shows that mRNA fatty acid biosynthesis and β- expression of hepatic lipogenic related genes like SREBP-1c, FAS, ME and G6PDH were significantly inhibited, while mRNA expression of β-oxidation related genes like PPAR-α and CPT-1 were upregulated by Realtime-PCR detection. This high-contentIV DHA/EPA triglyceride could inhibite the activity of FAS and ME and enhance the activity of CPT-1 and POE. It could improve the disturbance of lipid metabolism on fatty liver rats through the way of enhancing the catabolism and inhibiting the synthesis of lipidsThen we induced diabetic mouse model by feeding high fat food and explore the improved effcct on insulin resistance of high-content DHA/EPA triglycerideHigh-content DHA/EPA triglyceride significantly decreased in the level of fasting plasma glucose, reduced serum insulinemia, improved oral glucose toleranceHigh-content DHA/EPA triglyceride could not only decrease serum and hepatic lipids concentrations, but also improve liver fatty acid composition.Then we induced diabetic mouse model by feeding high fat food and explored the improved effcct on insulin resistance of high-content DHA/EPA triglyceride. High-content DHA/EPA triglyceride significantly decreased in the level of fasting plasma glucose, improved oral glucose tolerance, reduced serum insulinemia, HOMA-IR and increased the quantity of muscle glycogen, hepatic glycogen. High-content DHA/EPA triglyceride could not only decrease serum and hepatic lipids concentrations, but also improve liver fatty acid compositionWe studied the mechanism of improving insulin resistance of high-content DHA/EPA triglyceride. The result showed that it significantly enhanced mRNA expressions of InsR, IRS-2, PI3K and PKB, and decreased GSK-3β expression in liver and muscle. And it could promote GLUT 4 mRNA expression in adiose and muscle tissue of mouse. The high-content DHA/EPA triglyceride could regulate insulin resistance by activating the pivotal genes of PI3K/PKB/GSK-3β insulin signal transduction pathwayAll in all, high-content DHA/EPA triglyceride can effectively improve the disturbance of lipid metabolism on fatty liver rats and regulate inselin resisitance.And its effect is better than ethyl ester fish oil and low-content DHA/EPA triglyceride fish oil. It breaks technical monopoly and monopoly of products on DHA/EPA products in the word and improves international competitiveness of functional food of ourV countryKey word: high-content DHA/EPA triglyceride; lipid metabolism; SREBP-1c; FAS; PPAR-α; CPT-1; insulin resistance; insulin signal pathway; GSK-3β; GLUT4 VI 目录 前言1 1 鱼油 的研 究进 展 1 1.1 鱼油中 EPA 和 DHA 的存在形式. 1 1.2 鱼油的生理活性. 2 2. 脂 质代 谢 与非 酒精 性脂 肪肝 2 2.1 脂肪的消化和吸收2 2.2 脂质代谢过程中的调控因子3 2.2.1 固醇调节元件结合蛋白 3 2.2.2 过氧化物酶体增殖物激活受体4 2.3 脂质代谢过程中的关键酶 4 2.3.1 脂肪酸合成酶. 5 2.3.2 肉碱棕榈酰转移酶 5 2.3.3 过氧化物酶体 β- 氧化酶系6 2.4 非酒精性脂肪肝 6 胰岛 素抵 抗与 ?型 糖 尿病7 3. 3.1 ?型糖尿病胰岛素抵抗概述7 胰岛素抵抗的分子水平机制8 3.2 3.3 脂肪细胞因子9 3.3.1 脂联素10 3.3.2 瘦素 10 3.3.3 抵抗素10 3.3.4 肿瘤坏死因子11 4. 立题 依据 及研 究意 义 11 第一章 高 含量 DHA/EPA 甘 油三 酯调 节大 鼠 脂质 代谢 作用 的 研 究13 第一节 高 含量 DHA/EPA 甘 油三 酯对 脂肪 肝 大鼠 脂质 代谢 的 调 节 作用. 14 1 材 料和 方法 14 1.1 实验材料. 14 1.1.1 鱼油14 1.1.2 实验动物 14 1.2 试剂14 1.3 实验仪器. 14 1.4 实验方法. 15 1.4.1 饲料配制 15VII 1.4.2 动物分组和 实验. 15 1.4.3 血清脂质浓度测定 16 1.4.4 肝脏脂质浓度的测定16 1.4.5 肝脏脂肪酸组成分析16 1.4.6 粪便中脂质浓度的测定. 17 统计 学方法分析. 17 1.5 2 结 果与 分析 17 对大鼠体重、摄食量和肝脏组织重量的影 响 17 2.1 2.2 对大鼠血清脂质含量的影响 18 2.3 对大鼠肝脏脂质含量的影响 18 2.4 对大鼠肝脏脂肪酸组成的影响19 2.5 对大鼠粪便脂质含量的影响 22 第二节 高 含量 DHA/EPA 甘 油三 酯对 大鼠 脂 质代 谢相 关基 因 表 达 的影 响. 23 1 材 料和 方法 23 1.1 实验材料23 1.2 试剂23 1.3 实验仪器. 23 1.4 实验方法. 24 1.4.1 动物分组和实验. 24 1.4.2 RT-PCR 法检 测 肝脏 组织 中 的 SREBP-1c 、FAS 、ME 、G6PDH 、 PPAR-α 、 CPT-1mRNA 的表达 24 1.5 统计学方法分析. 25 2 结果. 25 2.1 对大鼠肝脏脂质合成相关基因 mRNA 表达 量的影响 25 2.2 对大鼠肝脏脂质分解相关基因 mRNA 表达 量的影响 26 3 讨论. 27 第三节 高 含量 DHA/EPA 甘 油三 酯改 善脂 肪 肝大 鼠脂 质代 谢 作 用 机制 . 29 的研究 1 材 料和 方法 29 实验材料29 1.1 1.2 试剂29 1.3 实验仪器. 29 1.4 实验方法. 29 1.4.1 动物分组和实验29VIII 1.4.2 肝脏脂肪代谢酶活力的测定29 1.5 统计学方法分析. 31 2 结 果与 分析 31 2.1 对大鼠肝脏脂肪酸合成相关酶活力的影响. 31 2.2 对大鼠肝脏 β- 氧化相关酶活力的影响 32 3. 本 章小 结. 33 第二章 高 含量 DHA/EPA 甘 油三 酯改 善小 鼠 胰岛 素抵 抗作 用 的 研 究 34 第一节 高 含量 DHA/EPA 甘 油三 酯对 ?型 糖 尿病 胰岛 素抵 抗 的 影 响 35 1 材 料和 方法 35 1.1 实验材料35 1.1.1 鱼油35 1.1.2 实验动物 35 1.2 试剂35 1.3 实验仪器. 35 1.4 实验方法. 35 1.4.1 饲料配制 35 1.4.2 动物分组和实验. 38 空腹血糖的测定. 38 1.4.3 1.4.4 葡糖糖耐量测定. 38 空腹血清胰岛素含量测定 38 1.4.5 1.4.6 小鼠血清脂联素的测定. 38 1.4.7 小鼠血清抵抗素的测定. 38 1.4.8 小鼠血清瘦素的测定39 1.4.9 小鼠血清 TNF-α 的测定 39 1.5 统计学方法分析. 39 2. 结果 与分 析 39 2.1 对小鼠摄食量、体重以及白色脂肪组织重 量的影响. 39 2.2 对小鼠空腹血糖的影响40 2.3 对小鼠葡萄糖耐量的影响. 40 2.4 对小鼠空腹血清胰岛素含量的影响 41 2.5 对小鼠血 清脂联素的影响. 41 2.6 对小鼠血清抵抗素的影响. 42 2.7 对小鼠血清瘦素的影响42 2.8 对小鼠血清 TNF-α 的影 响 42 第二节 高 含量 DHA/EPA 甘 油三 酯对 胰岛 素 抵抗 小鼠 糖原 合 成机 制的 研究 44IX 1 材 料和 方法 44 1.1 实验材料44 1.2 试剂44 1.3 实验仪器. 44 1.4 实验方法. 45 1.4.1 动物分组和实验. 45 肝糖原和肌糖原的测定. 45 1.4.2 1.4.3 肝脏和肌肉组织中 的 IR 、IRS 、PI3K 、PKB 、GSK-3β mRNA 表达 的检测45 1.5 统计学方法分析. 46 2 结果. 46 2.1 对小鼠肝糖原含量的影响. 46 2.2 对小鼠肌糖原含量的影响. 46 2.3 对小鼠肝脏组织中 IR 、IRS-2、PI3K 、PKB 、GSK-3βmRNA 表达的影响 47 2.4 对小鼠肌肉组织中 IR 、IRS-1、PI3K 、PKB 、GSK-3βmRNA 表达的影响 49 3 讨论. 50 第三节 高 含量 DHA/EPA 甘 油三 酯对 胰岛 素 抵抗 小鼠 葡萄 糖 转运 机制 的研究. 52 1 材 料和 方法 52 1.1 实验材料52 1.2 试剂 52 1.3 仪器 52 1.4 实验方法. 52 1.4.1 动物分组和实验. 52 1.4.2 肌肉组织和脂肪组织中的 IR 、IRS-1、PI3K 、PKB 、GLUT4 mRNA 表达的检测 53 1.5 统计学方法分析. 54 结果. 54 2 2.1 对小鼠骨骼肌组织中 IR 、IRS-1、PI3K 、PKB 和 GLUT4 mRNA 表达的 54 影响 2.2 对小鼠脂肪组织中 IR 、IRS-1、PI3K 、PKB 和 GLUT4 mRNA 表达的影 56 3.讨论. 57 第四节 高 含量 DHA/EPA 甘 油三 酯对 胰岛 素 抵抗 小鼠 的脂 质 调 节 作用 X. 59 1 材 料和 方法 59 1.1 实验材料59 1.2 试剂59 1.3 实验仪器. 59 1.4 实验方法. 59 1.4.1 动物分组和实验. 59 1.4.2 血清脂质浓度的测定60 1.4.3 肝脏脂质浓度的测定60 1.4.4 肝脏脂肪酸组成分析60 1.5 统计学方法分析. 60 2 结 果和 分析 60 2.1 对小鼠血清脂质含量的影响 60 2.2 对小鼠肝脏脂质含量的影响 61 2.3 对小鼠肝脏脂肪酸组成的影响62 3 本 章小 结. 64 参 考 文献 65 74 本 论 文的 特色 及创 新 之处. 75 76 致谢 个 人 简历 77 硕 士 在读 期间 发表 的 论文 和研 究成 果 78 XI 高含量DHA/EPA 甘 油三 酯调 节脂 质代 谢和 改善 胰岛 素抵 抗作用 的研 究 前言 1 鱼油的 研究进 展 目前, 鱼油制品已经 广泛应用于 医药和营养保健领域。 上世纪 50 年代 ,鱼 [1] 油的 降血脂功效 就已被发现, 但一直未受 重视 。1970 年以后, 国外关于格陵兰 岛爱斯基摩人主食的研究表明, 爱斯基摩人 心血管疾病发病率较低的主要原 因是由于其膳食组成中含有丰富的 二 十 碳 五 烯 酸 (EPA )和二十二碳 六烯酸 [2] (DHA ) 。 于 是,鱼油 的生理作用 才真正引 起 人们的普遍关 注 ,医学界也 为鱼 油戴上 了“生命之油 ”的桂冠。 1.1 鱼油中 EPA 和 DHA 的存在 形式 按鱼油中 EPA 和 DHA 的存在形式, 市场上的 鱼油制品主要分为两类: 一类 是 EPA 和 DHA 的总含量 在 14%~30% 左右的甘油酯形式, 另一类是 EPA 和 DHA 50% ~70% 左右的乙酯形式。 乙酯型鱼油 EPA 和 DHA 含量较的总含量在 高, 但 是其消化吸收困难, 还可能存在安全隐患。 甘油酯型是 EPA 与 DHA 的天然存在 形式, 因此食用安全,易被人体消化吸收,是被人们普遍接受的一种产品形式, 但 在甘油三酯型鱼油中,EPA 和 DHA 的含量 却普遍较低。 组织内 EPA 和 DHA 含量以及体内代谢 过程是由鱼油中 EPA 和 DHA 的存在 [3] 形式 决定的 。 长链脂肪酸甘油三酯进入小肠上段后, 经胰脂肪酶及胆酸盐的作 [4] 用, 水解为甘油、 甘油一酯和 脂肪酸等 。 经小 肠上皮细胞吸收 再 重新合成为甘 油三酯, 与载脂蛋白和 胆固醇结合成乳糜微粒后, 经淋巴进入血液循环。 但乙酯 缺 少甘油骨架, 且脂肪酸- 乙醇之间的酯键对胰脂肪酶的抵抗力远远大于脂肪酸- [5] 甘油酯键 。 乙酯进入小肠后被分解为乙醇和脂肪酸, 脂肪酸被小肠上皮细胞吸 收后只有转化为甘油三酯才可以进入血液, 甘油三酯型鱼油存在属于自己的甘油 一酯底物, 乙酯型鱼油正是因为缺少这种甘油一酯底物, 甘油三酯的合成被推迟 [6] 而造成了脂肪酸的分解,因此,甘油三酯型鱼油才呈现出更好的生理活性 。 乙酯型 DHA/EPA 的在体内的代谢存在安全隐患。首先, 乙酯型 DHA/EPA 要通过肠上皮细胞转化成甘油三酯型 DHA/EPA 才能被人体吸收, 此过程的 代谢 产物是 乙醇, 虽然产生乙醇的量比较低, 但是对酒精过敏或对酒精耐受性差的人 群, 尤其是儿童都是不宜的 ; 其次, 鱼油 DHA/EPA 在乙酯化的过程中 , 由于 有 1高含量DHA/EPA 甘 油三 酯调 节脂 质代 谢和 改善 胰岛 素抵 抗作用 的研 究 有机溶剂 、 化学药品和酶参加反应, 容易存在化学品残留和有毒副产品生成的问 题 ; 最后, 乙酯型 DHA/EPA 的稳定性差, 容 易被氧化, 其氧化产生的氧 化产物 对人体是有害的。研究表明,经过 10 w 的氧 化作用,乙酯型 DHA/EPA 的氧化 [7] 速率高出甘油三酯型 33% 。 1.2 鱼油的生理活 性 [8] 鱼油中与人体健康密切相关的重要成份是多不饱和脂肪酸 , 其具有调节血 降低血中的低密度脂蛋白胆 固醇等治疗和防治心脑血管病的功能, 还脂、 可以调 [9-10] 节体内葡萄糖代谢, 具有改善血糖平衡的功效 。 近年来研究证明, 在 多不饱 和脂肪酸 中,n-3 系多不饱和脂肪酸 具有更明显的降血脂效果和生理活性,尤其 [11] 是 EPA 和 DHA 。 EPA 和 DHA 能抑制内源性胆固醇和甘油三酯 的合成, 增加脂蛋白脂酶的活 性, 促进周围组织对极低密度脂蛋白的清除, 降低血清中甘油三酯和胆固醇, 降 低低密度脂蛋白的水平, 增加高密度脂蛋白的含量, 从而改善血液循环, 降低血 液粘度;EPA 和 DHA 通过调节血小板和血管 壁前列腺素PGs 的产生而发挥抗 血栓 作用, 或通过控 制花生 四烯酸代 谢途径中 的去饱和酶deaturase 和环加 氧酶 Cytooxygenase ,减少 花生四烯酸 和凝血黄素TXA2 的合成,抑制血小板凝集, [12-13] 降低血栓和动脉硬化形成的机率。这些作用均能降低心血管疾病的发病率 。 [14] Holness 等 实验证明, 摄食 DHA 和 EPA 会促 进 β 细胞对胰岛素的分泌功 [15] , 从而降低血液中葡萄糖水平。 Louheranta 等 研究 显示, 细胞膜磷脂能 中 DHA 和 EPA 比例升高 能改善 糖尿病患者空腹血糖水平。 DHA 和 EPA 是主要的 n -3 系 多不饱和脂肪酸, 最近有 研究发现,膳食中 的 n -6 /n -3 系多不饱和脂肪酸 比例 失调会 导致 正常生理功能 的紊乱 。饮食中 n -3 系多不饱和脂肪酸 DHA 和 EPA 比例升 高, 可降低患胰岛素抵抗 和高胰岛素血症 的风险, 同时抑制 自由基产生 和 [16] 脂质过氧化,降低 胰岛素抵抗和肥胖等疾病的发病率 。 2. 脂质代 谢与非 酒精 性脂肪 肝 2.1 脂肪的消化和吸 收 长链脂肪酸的甘油三酯 是膳食脂肪 的主要存在形式, 它们在小肠内经胆 盐作 用被乳化成微滴, 后经 胰脂肪酶水解 为甘油一酯 和脂肪酸 。微胶粒 具有积极小 、 2高含量DHA/EPA 甘 油三 酯调 节脂 质代 谢和 改善 胰岛 素抵 抗作用 的研 究 富极性和易与 胆盐结合形成混合微胶粒 等特点, 都使其 更容易通过覆盖在小肠绒 毛表面的水层。 在细胞膜上, 脂肪酸和甘油一 酯以分子状态进入粘膜细 胞。 在粘 膜细胞内 ,甘油 一酯和 脂肪酸 利用 ATP ,在 滑面内质 网上重 新合成 甘油三 酯, 同时与 粗面内质网合成的脱辅基蛋白 B 结合成 富含脂肪的颗粒 , 最后与胆固醇 、 [17] 磷脂等形成 乳 糜 微粒 , 释放 进 淋 巴 后 经 胸导 管进 入 血 液 循环 。 短链及中链脂 肪酸甘油三酯 的水溶性较强, 其 经胆盐的乳化 后可被胰脂肪酶完全水解成甘油和 脂肪酸。 他们 被吸收后大部分直接经门静脉系统入肝, 仅 存小部分与长链脂肪酸 一起再合成 甘油三酯 。 2.2 脂质代谢过程中 的调控 因子 2.2.1 固 醇调节元件结合蛋白 近年来 实验证实 , 脂肪酸及胆固醇代谢都可由一共同转录因子家族?? 固醇 调节元件结合蛋白SREBPs 来调控。SREBPs 于 1993 年首次从体外培养 的 Hela 细胞核抽提物中纯化出来,该蛋白属于 螺旋 ? 环 ? 螺旋 ? 亮氨酸锌指 bHLH-Zip 转录因子家族, 有 SREBP-1a 、SREBP-1c 和 SREBP-2 等 3 种同型异 构体 。机体内 90% 的 SREBP-1 均由 SREBP-1c 构成,因此 SREBP-1c 是脂肪合 [18] 。 成基因转录中的决定性因子 SREBP-1c 主要在肝脏和脂肪细胞中表达,是 动物脂肪代 谢中重要的核转录 因子, 它直接参与调控有关脂肪酸、 甘油三酯合成和葡萄糖代谢相关酶基因的表 达。SREBP-1c 的过度表达会 引起脂肪生成量 成倍上升,从而引发肝脏等非脂 组 [19] 织的脂质聚积 。受控于 SREBP-1c 的靶基因 有 :脂肪酸合成酶FAS 、苹果酸 酶ME 、 低密 度脂蛋白受体LDLR 、S14 、 乙 酰辅酶 A 羧化酶ACC 、 磷酸烯醇 式丙酮酸激酶PEPCK 和 葡 萄 糖 激 酶GK 等与 参与体内糖 代谢 和 脂 质 合 成 的基 [20] 因 。 当有 信号刺激 细胞时,SREBP-1c 基因在 瘦素、 胰岛素、 含氧固醇和肝 X 活化受体LXR 等因子的作用下被激活转录成 SREBP-lc mRNA ,随后被翻译成 无活性 的 蛋白前体 , 前体经过酶解系统裂解释放出有活性的氨基端片段 nSREBP-lc 进入细胞核, 与生脂基因启动子调 节区的 SRE BOX ATCACCCCAC [21] 或 E BOXCAXXTG 结合, 并与其他辅助因子 共同作用 激活转录过程 , SREBPs 通过此途径 调控目的基因转录 。 SREBP-1c 转录, 从而抑制脂肪酸 的前期研究表明, 不饱和脂肪酸能抑制 合 3高含量DHA/EPA 甘 油三 酯调 节脂 质代 谢和 改善 胰岛 素抵 抗作用 的研 究 [22] 成 。DHA 和 EPA 能降低由 SREBP-1c 调控的 脂质 合成相关酶 mRNA 的表达, [23] [24] 还可减少 SREBP-1c 成熟蛋白的量 。Xu 等 用富含 DHA 和 EPA 的食物喂食 实验鼠 , 发现 SREBP-1c mRNA 表达减少, 同 时肝脏中脂肪生成速率降低。 饲喂 [25] 鱼油能减少 SREBP-1c 的 mRNA 量,抑 制 SREBP-1c 的蛋白质裂解 。 2.2.2 过氧化物酶体增殖物激活受体 过氧化物酶体增殖物激活受体PPARs 是一类 由配体激活的核转录因子, 属 于类固醇/ 甲状腺/ 维甲酸受体超家族, 可调控许多参与脂类代谢的 目的基因表达, [26] 尤其是 调控参 与 β- 氧化过 程 的一些 关键酶,此 外, 也参与脂 肪细胞的分 化 。 由 其结构及功能 的不同 ,可分为 PPAR-α 、 PPAR-β 及 PPAR-γ 三种亚型。PPAR 基因通过与位于某些基因上游特异的 DNA 反 应元件相互作用而调控基因 表达。 活化的 PPAR 与视黄 醇 X 受体RXR 结合形成异二聚体,然后与 DNA 反应元 件结合, 激活某些与脂肪代谢有关的蛋白或酶基因, 如编码解偶联蛋白 、 肝脏脂 肪酸结合蛋白、脂蛋白脂酶等基因。 PPAR-α 基 因 定 位于22q12-13.1 ,由468 个 氨基酸 残 基组成, 主要 分布 在脂 肪 酸分解代谢旺盛的组织, 如肝脏、 脂肪组织、 骨骼肌、 肾脏和心脏, 其能 促进酮 [27] 体合成 、 脂肪酸 氧化 和 降低血 糖,调 节脂 质的 摄取和贮 存 。PPAR-α 是调 节脂 [28] 肪酸氧化 分解代 谢最重 要的一 种核转 录因 子 ,PPAR-α 基 因敲除 小鼠出 现严重 的脂质代谢紊乱, 在空腹状态时, 脂质代谢紊 乱 则更加明显, 无法 利用 脂肪酸作 为能 量来源 提供能量, 脂肪酸β- 氧化异常, 引发血脂升高和肝脏脂肪病变, 最后 [29] 表现 出类似 人类 糖尿病 的一系 列症状 。PPAR-α 还能 调控线 粒体 脂 肪酸氧 化酶 的 表 达 , 通 过 诱 导 肝 脏 和 肌 肉 特 异 性 的CPT 表达 从 而 调 控 脂 肪 酸 向 线 粒 体 的 转 [30] 运, 刺激β 氧化过程, 减少甘油三酯 和脂肪酸积 累 。 此外,PPAR-α 还可以调节 过氧化物酶体β 氧化途径中的一些 关键酶, 烯酰 辅酶A 水合酶/ 脱氢酶 (ECH)、 脂 [31] 酰CoA 氧化酶 (ACO )、酮乙酰辅酶A 硫解酶 等 。另外,被激活的PPAR-α 还 能 介 导 载 脂蛋 白apoA ? 表达, 促进 脂 蛋 白脂 肪酶 合 成 , 催化 脂 蛋白 中 的甘 油 三 [32-33] 酯分解成脂肪酸 。 2.3 脂质代谢过程中 的关键 酶 脂质代谢 分为脂肪的合成代谢和分解代谢途径。 脂肪合成 过程 主要在细胞质 中进行, 脂肪酸链 从 乙酰-CoA 获得两个碳原子 单元 (丙二酰-CoA ) 而使碳链延 4高含量DHA/EPA 甘 油三 酯调 节脂 质代 谢和 改善 胰岛 素抵 抗作用 的研 究 长 。脂 肪酸分 解代 谢 途径 又称 脂肪酸 β- 氧 化 ,长链 脂肪酸 经水 解作用 ,将 乙酰 -CoA 分解下并进入 三羧酸 循环或酮体生成途径 ,同时分解产生 ATP 。两过程均 需要 众多酶的参与, 通过酶活 力和 酶数量的调节 , 即可 调控脂肪酸合成 和 β- 氧 化, 而影响脂质 代谢的平衡。 近 2.3.1 脂肪酸合成酶 脂肪酸合成酶fatty acid synthase, FAS 是动物体内长链脂肪酸从头合成过程 中最后一步的关键酶, 它是由许多酶组成的一个复合体系 ,催化 乙酰-CoA 和丙 二酸单 酰-CoA 简称丙二 酰-CoA 生 成 长 链 饱和脂 肪 酸 , 其 活 性 的高 低 、 蛋 白 质 的多寡直接控制体内脂肪酸合成能力的强弱,从而影响整个机体脂肪代谢过程。 日粮 成分和体内激素水平均 会对 FAS 的表达 产生重要影响,食物中 碳水化合物 [34] 会 刺激 FAS 的表达, 诱导脂肪生成 。FAS 的 表达 会在 胰岛素刺激下增加,用 10 ng/ml 的胰岛素培养 3T3-F442A 脂肪细胞 48 h 后, 会使 FAS mRNA 表达量增 [35] 加 7 倍 。FAS 受脂肪酸的 调控,其中,脂肪酸 饱和程度、 双键位置、 链的长 短 以及日粮脂肪酸的含量 等因素都与这种调节作用有着密切的关系。 近年研究显 [36] 示,DHA 和 EPA 可以抑 制 FAS 的表达,Deng 等 用橄榄油 (n-6) 和鱼油 (n-3) , Western blot 检测肝脏中 SREBP-1c 和 FAS 的表达分别喂养大鼠 6 周 都会下调。 [37] Elodie 等 发现,饲喂鱼油后大鼠肝脏中 FAS 活力明显下降,而脂肪组织中却 [38-39] 没有观察到这种现 象。 此外, 微量元素, 如铜 、 铬等也可以调节 FAS 的表达 。 另 外 , 有研 究 发现 如 苹果 酸 酶ME , 葡 萄糖-6- 磷 酸脱 氢 酶G6PDH 等 脂 肪生 成 [40] 酶也与 FAS 活性变化保持一致 。 2.3.2 肉碱棕榈酰转移酶 肝脏脂肪酸分解代谢的主要途径是脂肪 酸 β 氧化 , 线粒体是 β 氧化反应进行 的主要场所。 在细胞质 内活化的 长链脂酰 CoA 不能直接 转运至线粒体进行 β- 氧 化 , 需 要 通过 特 殊 穿 梭 运 输 机 制 才 可 进 入 线 粒 体 中 , 肉 碱 棕 榈 酰 转 移 酶 系统 [41] carnitine palmitoyl transferase, CPT 作为脂肪 酸 β- 氧化的关键酶催化该过程 。 该酶由位 于线粒体外膜的 CPT-1 和位于中间的 肉碱脂酰- 肉碱转移酶,以及 存在 于膜内侧的 CPT-2 三 部分共同组成。CPT-1 和 CPT-2 分别位于线粒体内膜的内 外两侧, 通过脂酰 CoA 和脂酰肉碱的互换, 使 脂酰 CoA 进入线粒体基质 进 中 。 入线粒体基质后的脂酰 CoA 在一系列酶的催化下,依次经过脱氢、水合、再脱 5高含量DHA/EPA 甘 油三 酯调 节脂 质代 谢和 改善 胰岛 素抵 抗作用 的研 究 氢、 硫解四步骤, 生成一个乙酰 CoA 和少两个 碳单位的脂酰 CoA ,释放出能量 前者可进入三羧酸循环和酮体生成途径进一步分解, 后者则继续前面的 β- 氧化过 [42] 程直至彻底氧化分解 。 CPT-1 活力越高, 说明机体肝脏中脂肪分解代谢越旺盛, 脂肪酸在肝内积累的可能性就越小。 2.3.3 过氧化物酶体 β- 氧化酶系 两种不 同的 脂肪酸 β-氧化系 统分别 存在 于动 物细胞 线粒 体和过 氧化 物酶体 中, 极长链 的脂肪酸不可以直接进入到线粒体中进行 氧化 分解, 对长链脂肪酸进 [43] 行降解就需要 通过过氧化物酶体(peroxisome ) 。虽然在这两套系统中反应生 成了相同的中间产物, 但是由不同的酶催化各自反应。 位于过氧化物 酶体中 的脂 辅酶 A 氧化酶能够催化脂酰辅酶 A 进行脱 氢反应,是过氧化物酶体脂酰 肪酸 β- [44] 氧化 的限速酶 。 据统计, 过氧化物酶体的脂肪酸氧化能力占脂肪酸 β- 氧化总量 [45] 的 5%-30% 。因此, 氧化物酶 体 β- 氧化酶系peroxisomal β-oxidation enzymes, POE 的活力亦是影响脂肪酸 β- 氧化 反应的重要因素。 2.4 非酒精性脂肪肝 肝脏作为 机体合成 脂质的主要场所 本身并没有大量存储脂肪的能力 , 脂肪于 肝脏中合成后以 极低密度脂蛋白的形式分泌到血液中。 在正常机体中 , 肝脏中脂 肪的合成和分解在是动态 平衡的, 因此不会在肝脏中积累的。 但这种动态平衡一 旦 被 打 乱 , 脂 质 代 谢 发 生 紊 乱 , 脂 肪 就 会 在 肝 脏 中 积 累 。 非 酒 精 性 脂 肪 肝 NAFLD 与脂质代谢密切相关, 是一种无过量 饮酒史, 排除病毒性肝炎、 自身免 疫性肝病、 遗传性肝病等原因, 以肝细胞脂肪 性病变和脂质贮积为 主要特征的临 床病理综合征 。 其疾病谱随病程的进展而表现 为, 单纯性脂肪肝、 非酒精性脂肪 [46-47] 4 个过程 。 变性肝炎、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化 NAFLD 在全球范围内影 响 10%-39% 的人口, 平均患病率高达 20% , 是一种 [48] 近年来逐渐被广泛认识的慢性肝病 。 研究显示 ,15% 的患者随着病程发展会引 起肝纤 维化和 肝硬 化;3% 的患者 会进 一步发 展为肝 功能衰 竭 或 建议 要 进行 肝脏 [49-50] 移植治疗 。NAFLD 在 肥 胖 者 中 更 为 常 见 , 随 着 体 质 指 数 和 腰 围 的 增 加 , NAFLD 的患病率及其程度增加。NAFLD 影响包括儿童在内的所有年龄层次的 个体, 最常见于 40~50 岁, 且无明显的性别差异。 由于肥胖和糖尿病的发病率在 我国逐年增加 ,脂肪 肝患病率 在 我 国发达城市 已近 15 %,现正严重 危害 着 人民 6高含量DHA/EPA 甘 油三 酯调 节脂 质代 谢和 改善 胰岛 素抵 抗作用 的研 究 [51-52] 的身体 健康 ,已成为临床常见的慢性肝病。 NAFLD 的发病机制目前尚未以单一的