层黏连蛋白促进人晶状体上皮细胞蛋白激酶B的活性

层黏连蛋白促进人晶状体上皮细胞蛋白激酶B的活性 层黏连蛋白促进人晶状体上皮细胞蛋白激 酶B的活性 国际眼科杂志2006年1O月第6卷第5期 电话:029—82245172电子信箱:IJO.2000@163.com ? 实验研究? 层黏连蛋白促进人晶状体上皮细胞蛋白激酶B的活性 王欣玲,阎启昌,张国刚2,于韬,张劲松 LamininincreaseproteinkinaseBactivity ofhumanlensepithelialcells Xin—LingWang,Qi-ChangYan,Guo-Gang Zhang,TaoYu,Jin-SongZhang Foundationitem:Thethirty—threesciencefun(1projectionforpost— doctoroftheStateCounci1fNo.2003033282).SeniorSchoo1Science ResearchProieetionofEducationOffiPofLiaoningProvinceofChi— nafNo.2004C0411ant1(No.05L576) DepartmentofOphthalmology,theFourthAffiliatedHospital,China MedicalUniversih.Shenyang110005LiaoningProvince.China; 2SchoolofTradilionalChineseMediea1.ShenyangPharmaeeuticalU— niversibr,Shenyang110016.LiaoningProvince,China;Department ofRadiology. , LiaoningCancerHospital,Shenyang110042,Liaoning Province.China Correspondenceto:Xin-LingWang.DepartmentofOphthalmolo— gy,theFourthAffiliatedHospita1.ChinaMedicalUniversity. Shenyang110005.LiaoningProvince,China.wxinling@126.corn Received:2006-07—31Accepted:2006-09-14 Abstract .AIM:ToinvestigatetheeffectsofLaminin(Ln,onprotein kinaseB(PKB)ofthehumanlensepithelialcells(hLECs)sub— culturedinvitroandthelaminin-activatedP}}signalingpath. way. .M日-HODS:ThefifthpassagehLECswereseededinculture bottlesbelongtocontrolortreatedgroup.Lamininwasadded intothenutrientmediumofthetreatedgroupwiththeend concentrationof5pg/mL.Thecellswerecollectedfor0,10, 20,40and60minutesafterLaminintreatment,respectively. PKinaseAssay[Y-32P]一ATPincorporationassaywasused todetectthePKBkinaseactivity.WOrtmannin.thespecificin. hibitorofphosphatidylinosital一3一kinase(PI3K),wasappliedto pretreatthehLECsfor1hourattheconcentrationof 100nmol/L.ThenLamininwasaddedandPKBactivitywas detected. .RESULTS:P}activityofthemembraneandcytosol 基金项目:中闰同务院第33批博士后科学基金资助项目(No. 20030033282);中辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(Nn. 2004C041);中同辽宁省教育厅高等学校科学技术研究项目(No. 05L576) 作者单位:(110005)中闰辽宁省沈阳市,中同医科大学附属第 四医院眼科;!(110016)中国辽宁省沈阳市,沈阳药科大学中药 学院;(110042)中国辽宁省沈阳市,辽宁省肿瘤医院医学影像科 作者简介:王欣玲,女,眼科学博士,导师张劲松教授,主要从事 品状体皮细胞生物学特性的研究. 通讯作者:于欣玲.wxinling@126m 收稿日期:2006—07—31修回日期:2006—09—14 1018 reachedthepeakvalueat40minutesafterLaminintreat— ment.as2.72and2.00timesasmuchasthatofthecontrol group.TherewassignificantdifferenceinPKBactivitybe- tweentheLaminintreatedgroupandthecontrolgroup.Both membraneandcytosolactivityofPKBdecreasedsignificantly afterWortmanninpretreatment. .CONCLUSlON:Lamininactivatebothmembraneandcy. tosolP}activitythroughthePI3KpathwayandtheP}ac- tivityvariedaccordingtothetime. .KEYvv0RDS:Lamininlens;crystalline;epithelialcells;pro— teinkinaseB WangXL,YanQc,ZhangGG,YuT.ZhangJS.Lamininincrease proteinkinaseBactivityofhumanlensepithelialcells.fJOphthal- ,nd(GujYankeZazhi),2006:6(5):1018—1020 摘要 目的:探讨层黏连蛋白(Ln)对传代培养的人晶状体上皮细 耻(hLECs)的蛋白激酶B(PKB)活性的影响,以及Ln激活 PKB的信号分子途径. 方法:选取第5代hLECs,分为对照组和处理组,在处理组 的培养液中加入层黏连蛋白,终浓度为5mg/L.分别在处 理后0,10,20,40,60min取出细胞,『一P卜ATP掺入法 测定胞膜和胞质PKB比活性.以PI3K的特异性抑制剂 Wonmannin(终浓度100nmol/L)预处理lh,再加入层黏连 蚩白,0,10,20,40,60min测定胞膜和1胞质PKB比活性. 结果:hLECs胞膜和胞质PKB比活性在层黏连蛋白作用 40min时达到最高值,分别为空白对照的272和2.00倍. 层黏连蛋白处理的各组胞膜和胞质PKB比活性显着高于 对照组(0.05).经Wortmannin预处理后,再加入层黏连 蛋白,胞膜和胞质PKB比活性与未经预处理的各时间组 相比均显着下降(尸<0.05). 结论:层黏连蛋白通过PI3K途径激活人晶状体上皮细胞 的PKB活性,比活性随时问变化而发牛改变. 关键词:层黏连蛋白;晶状体;上皮细胞;蛋白激酶B 王欣玲,阎启昌'j长国刚,于韬,张劲松.层黏连蛋白促进人品状体上 皮细胞蛋白激酶B的活件.同际眼科杂志.2006;6(5):1018—1020 0引言 ?型胶原和层黏连蛋白(1aminin,Ln)是构成晶状体囊 膜的主要成分,在晶状体上皮细胞的生长,增殖及分化过 程中起着重要的调节作用.晶状体囊膜成分的改变可引 起前囊膜下上皮细胞的转化和增殖,导致前囊膜下白内 障发生_】?.以往研究表明.在白内障患者晶状体前囊膜 中,Ln和?型胶原含量较多.因此,研究Ln对晶状体上 InternationalJournalofOphthalmology,Vo1.6,No.5,Oct.2006 Teh029—82245172EmaihIJO.2000@163.cornWWW.U0.cn 皮细胞生长特性的影响,对进一步了解和认识白内障发 生的病理生理过程具有重要的意义:晶状体后囊混浊形 成(p0steri0rcapSUk0pacification,PCO)主要与残留于眼内 的晶状体上皮细胞黏附,增殖和移行于后囊膜,继而发生 纤维化及合成细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)有关】. 细胞与ECM之间相互识别所引起的黏附依赖性的信号 转导途径在其中起着重要的作用:ECM成分中的层黏连 蛋白可以结合细胞表面的黏附受体一整合素分子(inte— grin),介导细胞与基质的黏附:整合素下游的信号途径主 要有PI3K—PKB/Akt,Ras—Raf-MEK—MAPK和SHC—ERK 1/2等[41.Wortmannin是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyli— nositol一3-kinase,PI3K)的特异性阻滞剂: 1材料和方法 1.1材料DMEM/F一12(Dulbecco'sModifiedEagleMedi— urn/NutrientF一12Ham's)和胎牛血清(talbovineserum, FBS)购自Hyclone公司,层黏连蛋白(1aminin)购自Gibco 公司,Wortmannin和cAMP蛋白激酶抑制剂购自Sigma 公司,组蛋白2B购自Roche公一J,【一P卜ATP购自北京 福瑞生物工程公司.SorvallST一70高速离心机,超声粉碎 机,Beckman一1801液闪仪完整地撕取晶状体前囊膜,剪 碎成直径lmm的组织块,以3mL含100mldL胎牛血清的 DMEM—F12培养基,37oC,50mULCO2培养.取第5代细 胞5×107L接种于培养瓶.待达到70%融合时,换成含 10mIJL胎牛血清的DMEM/F一12,37oC孵育过夜,使细胞 同步化. 1-2方法在培养液中加入层黏连蛋白,终浓度为 5mg/L,37~C孵育.分别在孵育后0,10,20,40,60min取出 细胞,进行3次重复测定,对结果进行统计学处理.在孵 育结束后0,10,20,40,60min收集细胞,冷PBS洗涤3 次,加入粉碎缓冲液(含lmmol/LEDTA,1mm01/LEGTA, lOmmol/LTris—HC1fpH7.51,100mmol/LNaC1,50mmol/L NaF,lmmol/LNa3VO4,1mmol/LPMSF,10mg/L亮肽素, lOmg/L抑肽酶,lOmg/L胃酶抑素,50mmol/LB一磷酸甘 油,1mmol/L二硫苏糖醇,0.9g/L的Brij35)300L,移人 EP管,一70?保存待测.【一P卜ATP掺人法测定蛋白激 酶B(proteinkinaseB,PKB)~性:将一70?保存的样品取出 融化,断续超声波处理30s,35000g离心60min,上清液用 于胞液PKB测定,沉淀用150L匀浆缓冲液溶解后,做 膜性PKB测定.每份样品上清分3个平行管,每管取 15L,l司15L加有【一P卜ATP(74kBq)的反应液(50 m01/LTris.10mmol/LMgC1,,75mmol/L二巯基乙醇, 50mmol/LATP,67×10mol/L组蛋白2B,5mol/LcAMP 蛋白酶抑制剂)混合,30准确保温30min,反应完成后取 25L点在WhatmanP81强阳离子交换滤纸上,放人 75mmol/L磷酸溶液终止反应,并用此磷酸溶液反复洗3 次,每次2min,取出晾干,放人预装有9mL蒸馏水的液闪 瓶中,液闪仪测定cpm数.PKB比活性=(cpm数一对照组 cpm数)/总放射性×ATP浓度/时间/蛋白量.另取 Wortmannin溶于二甲基亚砜,终浓度为100mol/L; 一 70?保存使用时加于培养液中,终浓度为lOOnmol/L.对 照组加入等量二甲基亚砜,37?孵育1h,再加入层黏连蛋 白,终浓度为5mg/L,37?孵育,分别在0,10,20,40,60min 取出细胞,进行3次重复测定. 统计学处理:数据采用SPSS10.0软件包中进行方 差分析,Student'S,一检验来判断差异的统计学意义,尸< 0.05差异具有显着性. 2结果 2.1层黏连蛋白对人晶状体上皮细胞PKB比活性的影晌 我们用【一P卜ATP作为磷酸基供体,分析人晶状体上皮 细胞经5mg/L的层黏连蛋白处理不同时间后胞膜和胞质 PKB比活性的变化.在层黏连蛋白作用的0,40min内,随 时间延长,胞膜和胞质PKB比活性逐渐升高,且胞膜PKB 比活性高于胞质.在40min时胞膜和胞质PKB比活性达 到最高值,分别为空白对照的2.72和2.00倍.在60min时 胞膜和胞质PKB比活性有所下降,但仍明显高于空白对 照.对上述结果进行统计学处理,单因素方差分析的方法 证明层黏连蛋白处理的各组胞膜和胞质PKB比活性与对 照组之间均存在显着差异(P<0.05,表1). 2-2Wortmannin预处理的人晶状体上皮细胞PKB的比 活性经PI3K的特异性抑制剂Wortmannin预处理后.再 加入层黏连蛋白,人晶状体上皮细胞胞膜和胞质PKB比 活性与未经预处理的各时间组相比均下降,且差异显着 (尸<0.05,表1). 3讨论 PI3K/PKB是近年来发现的一个新的生长因子信号 转导途径,主要通过生长因子与受体结合而激活.PKB是 PI3K的一个重要的下游调节激酶,与细胞代谢,生长,凋 亡,恶变等密切相关,是机体维持正常生命活动的一个重 要调节因子[6,71.在细胞外基质成分结合整合素分子后,黏 着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)被激活,继而启动级 表1层黏连蛋白对人晶状体上皮细胞PKB比活性的影响(nkat/g,?1 国际眼科杂志2006年10月第6卷第5期 电话:029—82245172电子信箱:IJO.2000@163.tom 联反应,促进细胞黏附和存活.PI3K和MAPK是两条重要 的促进细胞存活和增殖的信号途径我们用【^y一P卜ATP 作为磷酸基供体,分析第5代的人晶状体上皮细胞经层 黏连蛋白处理不同时间后胞膜和胞质PKB比活性的变 化.在40min时胞膜和胞质PKB比活性达到最高值,分别 为空白对照的2.72和2.00倍.选择层黏连蛋白作为细胞 外基质的代表,来观察其对整合素下游信号分子的作用, 是因为它可以配制成溶液直接加在培养液中,可以精确 地计算作用时间;而纤维连接蛋白一般需要在使用前涂 在培养瓶皿表面上 在某些情况下,PKB的活化不依赖于PI3K的活化I. 为明确层黏连蛋白对细胞中PKB的活化是否依赖于 PI3K途径,我们采用PI3K的特异性抑制剂Wo~mannin 预处理1h后,再给予层黏连蛋白.结果发现,经wort— mannin预处理后,胞膜和胞质PKB比活性与未经预处理 的各时间组相比均下降,且差异显着.表明层黏连蛋白对 细胞PKB的活化是通过PI3K途径实现的:层黏连蛋白作 为细胞外基质成分,其促进细胞黏附的作用早已被公认. 在本实验中,层黏连蛋白亦可通过PI3K途径活化PKB, 而PI3K/PKB是主要的促进细胞存活的信号途径,即层黏 连蛋白亦可促进人晶状体上皮细胞存活.这与我们以前 发表的关于层黏连蛋白促进原代和传代的人晶状体上皮 细胞存活的结论是一致的,揭示了层黏连蛋白促进体外 . 一一一一一一,一一,一一,,一一, 一一一,一一一,,,一一一,一.一一一一,一一,一一一一一一一,一一一 一,一,,