增殖细胞核抗原蛋白表达与食管癌术前放疗预后的关系

增殖细胞核抗原蛋白表达与食管癌术前放疗预后的关系 中华放射肿瘤学杂志 CHINESE JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY 1998年9月 第7卷 第3期 科技期刊 增殖细胞核抗原蛋白表达与食管癌 术前放疗预后的关系 祝淑钗 殷蔚伯 万钧 周道安 摘要 目的 探讨食管癌增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白 表达对预后的影响，指导临床选择有效治疗，提高局部控制率和长期生存率。材料与方 法 1979年11月至1996年12月，164例食管癌患者接受术前放疗及根治性食管癌切除术。 均为鳞状细胞癌。放疗采用前后两野垂直照射，肿瘤剂量30,40Gy，照射15,20次/3,4 周。常规免疫组化链霉素亲和素蛋白过氧化物酶连接法(SP方法)检测PCNA蛋白表达。结 果 PCNA蛋白表达呈胞核内弥散分布的棕黄色颗粒，食管鳞癌呈100%表达，阳性细胞数 ?25%为低表达，,25%为高表达。放疗后高表达率高于放疗前高表达率，P,0.03;放疗前、 后PCNA蛋白表达对生存均有明显影响P,0.02、P,0.03，并且放疗前、后PCNA蛋白高、 低表达的预测性不一致。结论 (1)食管癌放疗后PCNA蛋白表达升高，可能存在加速再增 殖;(2)疗前、疗后PCNA蛋白表达的预测性不同，可指导临床选择最有效治疗方案，可作为 评价预后指标。 关键词 增殖细胞核抗原 食管肿瘤/放射疗法 预后 Relationship between PCNA protein expression and the prognosis of esophageal carcinoma treated by preoperative radiotherapy * Zhu Shucai, Yin Weibo, Wan Jun,et al. Department of Radiotherapy ,Fourth Hospital of HeBei Medical University,Shijiazhuang 050011 Abstract Purpose To study the validity of PCNA protein expression on prognosis for patients with esophageal carcinoma treated by preoperative radiotherapy in order to improve the local control and survival rates. Materials and Methods From Nov.1979 to Dec.1996,164 patients were treated by preoperative radiotherapy plus radical esophagectomy. There are 104 males and 60 females with the mean age of 51 years old.All were confirmed by pathology as squamous cell carcinoma. Anterior and posterior radiation fields were used to deliver a tumor dose of 30,40Gy/15,20F/3,4W.Immunohistochemical PCNA staining was performed using a streptavidin-biotin staining technique. Results Positive nuclei were stained diffusely or granularly brown in various intensities and all positive nuclei were counted regardless of intensity.All the esophageal squamous cell carcinoma showed positive staining PCNA.It was defined that the number of positive cells ?25% be PCNA protein low-expression(PLE ),and , 25% being PCNA protein high-expression (PHE).The PHE rates were 69.3%(106/153) and 55.8%(58/104) for the post-and pre-radiation specimens, (P,0.03). PHE showed different prognosis in pre- or post-radiation, (P,0.02 and P,0.03),respectively.The correlation signified between PCNA protein expression and the pT,pN and radiopathological changes. Conclusion (1)raising of PCNA protein expression after pre-operative radiotherapy of esophageal carcinoma may signify the repopulation of tumor cells.(2) The prognosis differed from different PCNA expression before or after radiation, it may be beneficial to select the best treatment plan and as the evaluating criteria. Key words Esophageal neoplasms/radiotherapy Proliferating cell nuclear antigen prognosis 食管癌系我省高发肿瘤，目前手术切除和放射治疗的5年生存率分别为23%,33%和10%,20%,1，2,。近30年随着癌基因、抑癌基因研究的深入，使我们能够从分子水平、蛋白水平重新认识食管癌的发生、发展和预后。作者旨在研究食管癌放疗前及放疗后手术标本的PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)蛋白即增殖细胞核抗原的表达，探讨PCNA蛋白表达对预后的影响，以指导临床选择最佳治疗方案，提高局部控制率和长期生存率。 1 材料与方法 1 1979年11月至1984年12月(114例)，1996年8月至1996年12月(50例)，前后共164例食管癌患者在我院接受术前放疗及根治性食管癌切除术，平均年龄51岁(31,72岁)。放疗前活检标本104块，放疗后手术标本153块(11例术后标本病理检查未见癌组织)，均病理证实为鳞状细胞癌。 1.2 术前照射方法:均采用前后两野垂直照射，肿瘤剂量30,40Gy，照射15,20次/3,4周(114例)，96年后病人接受加速超分割放疗，剂量25Gy，照射10次/5d，大约放疗后20天行根治性食管癌切除术。 1.3 抗体及免疫组化试剂盒:(1)PCNA抗体即鼠抗人的PC10单克隆抗体;(2)IgG二抗系生物素标记的羊抗鼠血清免疫球蛋白单克隆抗体;(3)SP试剂盒即过氧化物酶标记的链霉素?亲和素试剂盒，为美国ZYMED公司产品。 1.4 实验方法:常规免疫组化SP方法，(1)福尔马林固定、石蜡包埋的病理组织块切成5μm厚;(2)二甲苯脱蜡15分钟，梯度乙醇水化3分钟;(3)3%H2O2甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶活性，室温15分钟;(4)将切片放入已预热至96,98?的0.01M枸橼酸钠抗原修复液内，维持10,13分钟，自然放凉;(5)PBS洗2×5分钟，1%BSA封闭非特异性抗原抗体反应，微波5档5分钟;(6)加PCNA抗体于玻片;(7)PBS洗3×5分钟，加1:100稀释的生物素标记的IgG单克隆抗体，微波5档12,13分钟;(8)PBS洗3×5分钟，加1:100稀释的标记过氧化物酶的链酶素?亲和素复合物，微波5档11,12分钟;PBS洗3×5分钟;(9)DAB显色;(10)苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。用缓冲液或羊血清代替PCNA抗体作阴性对照。 1.5 计数方法:光镜下观察阅片，双盲法计数阳性细胞。随机选择5个高倍视野(×400)，计数300个肿瘤细胞，根据着色细胞核的数目将PCNA蛋白阳性细胞分为4级:阳性细胞数?25%为(+)，26%,50%为(++)，51%,75%为(+++)，,75%为(++++)。放疗引起病理改变分3级,3，4,。 1.6 统计方法:不同组间比较用卡方检验，累积生存率用Kaplan-Meier方法统计并用Log-rank进行显著性检验。 2 结果 2.1 PCNA蛋白阳性呈胞核内弥漫分布的棕黄色颗粒。食管鳞状细胞癌PCNA蛋白呈100%表达，我们划分阳性细胞数?25%(+)者为低表达，,25%(++,++++)者为高表达，放疗前、后PCNA蛋白表达情况见表1。 表1 放疗前、放疗后PCNA蛋白表达的分布 临床资料 例数 低表达 例数 % 高表达 例数 % 放疗前 104 46 44.2 58 55.8 放疗后 153 47 30.7 106 69.3 P值 0.03 0.03 2.2 PCNA蛋白表达与手术标本参数间的关系有显著性相关，但与患者性别、年龄、病变 部位、病变长度之间无明显相关性。同一病人放疗后手术标本的病理改变、T分期、N分期 所对应的其放疗前活检标本的PCNA蛋白表达情况见表2。 2.3 PCNA蛋白表达对预后的影响:本组病例中，1996年的50例病人随访期太短，术前放 疗方法和前后相距10余年的手术方式也有差别，故暂未统计在内。下面讨论生存时只对有 长期随访结果病例分布比较集中(1979年至1984年)的114例进行分析，其中位生存期57个 月，直接计算的5、10年生存率分别为49.1%(56/114)和38.5%(44/114)。放疗前(1996年病 人 表2 PCNA蛋白表达与临床病理参数间关系 临床资料 放疗前活检标本低表达率% 高表达率% 放疗后 活检标本低表达率% 高表达率% 病理改变:? 54.9(17/31) 45.1(14/31) 21.3(10/47) 78.7(37/47) ? 30.3(10/33) 69.7(23/33) 29.2(14/48) 70.8(34/48) ? 47.5(19/40) 52.5(21/40) 39.7(23/58) 60.3(35/58) N分期:N0 37.8(31/82) 62.2(51/82) 32.5(38/117) 67.5(79/117) N1 68.2(15/22) 31.8(7/22) 25.0(9/36) 75.0(27/36) T1 16.7(1/6) 83.3(5/6) 60.0(6/10) 40.0(4/10) T分期:T2 33.3(15/45) 66.7(30/45) 34.4(21/61) 65.6(40/61) T3 56.6(30/53) 43.4(23/53) 24.4(20/82) 75.6(62/82) 的36块活检标本被剔除，故仅剩68例)、放疗后(11例术后标本病理检查未见癌组织者被剔 除，故仅剩103例)PCNA蛋白表达对生存均有明显影响，放疗前高表达者(42例)预后好于 低表达者(26例)P,0.02，见图1;而放疗后高表达者(67例)较低表达者(36例)预后明显差P ,0.03，见图2。 图1 放疗前PCNA蛋白表达与生存的关系 2.4 影响食管癌患者术前放疗、术后生存的临床病理参数有:(1)放疗后手术标本的病理改变对生存有明显影响，P,0.02;(2)术后肿瘤T分期、N分期均影响患者生存， P,0.04、P,0.005;(3)放疗前食管病变长度对生存也有明显影响，P值,0.04。 3 讨论 3.1 PCNA最早在1984年由Micheal,5,报道，目前已知其分子量为36KD的酸性核蛋白，系DNA聚合酶δ的辅助成份，其表达随细胞周期变化，G1期逐渐增多，S期达高峰，G2/M期减少，是DNA复制过程中必须的，参与细胞增殖和修复，代表着细胞增殖状态,6,。 图2 放疗后PCNA蛋白表达与生存的关系 3.2 单因素分析影响病人生存的因素，从图1可见，放疗前PCNA高表达者较低表达者预后好P,0.02，有统计学意义。这与目前大多数文献报道不一致，如1995年Kuwano报道182例食管癌手术标本PCNA表达，阳性率?25%者较低于此值者预后明显差，P,0.05,7,;同年Moriszki也报道一组病人，PCNA?44%者预后比低于此值者明显差，P,0.05,8,，这两组病例均为单纯手术，而我们这组病人为术前放疗。多年来研究已经表明，放疗后病理改变、术后标本肿瘤大小、淋巴结转移状态、病变长度是重要的预后因素对生存的影响均有统计学意义。表2显示放疗前活检标本的PCNA蛋白高、低表达在放疗病理改变中差别不明显，但在N0期及T1+T2期患者中其高表达率较N1期及T3期患者明显高且有统计学差别P,0.01。这与Wang,9,报道的食管癌术前放疗可使病变缩小，淋巴结转移机会也将减少的结果相符合，故放疗前PCNA蛋白高表达者较低表达者生存好的结果是可信的。这个结果与Willett,10,报道的直肠癌术前放疗结果相似，他认为PCNA蛋白高表达即肿瘤有较高增殖活性者，因对射线敏感，疗后肿瘤分期下降明显，复发可能性较小，生存率得以提高。 3.3 从图2可见，放疗后手术标本PCNA蛋白高表达者生存率明显低于低表达者P,0.03，此结果与放疗前PCNA蛋白表达的预测性相反，进一步分析表2显示术后标本PCNA蛋白高表达在病理改变?级者78.7%(37/47)明显高于?级者60.3%(35/58)，P,0.04;在T3期肿瘤中高表达率75.6%(62/82)明显高于T1期40%(4/10)，P,0.04;尽管N1期中高表达率75.0%(27/36)与N0期的67.5%(79/117)相比未见统计学差别，但其百分比是较高的;结合放疗后病理改变、术后T分期和N分期均能高度地预示生存，放疗后手术标本PCNA蛋白高表达者通常有不好预后的结果是可信的并与传统预后因素相符合。另文发表的结果显示放疗后手术标本与放疗前活检标本的PCNA蛋白表达相比，疗后下降者生存最好，升高者生存最差，且有非常显著的差别(P,0.0001)，并发现疗后PCNA蛋白表达不同程度的下降其生存期也不相同，下降程度越大(75%)，生存期越长(171个月)，这进一步说明上述结果的可靠性。同时也说明放疗确实改变了肿瘤细胞的增殖状态，影响了PCNA蛋白的表达，因此它有可能作为观察疗效的指标并指导治疗方案的选择。从上面分析，初步认为放疗前PCNA检测能够指导临床选择不同治疗方案，如对PCNA蛋白高表达者，可行术前放疗，肿瘤缩小明显，T分期下降，疗后生存较好;对PCNA蛋白低表达者，应尽量争取早日手术。另外对术后放疗也有一定的指导意义，即单纯手术后病人如PCNA高表达选择术后预防性照射，控制亚临床病灶及区域淋巴结，以提高术后生存。 参 考 文 献 1 韩企夏，施学辉，范可成，等.食管癌.见:汤钊猷主编.现代肿瘤学.上海:上海医科大 学出版社.1993，455-484. 2 殷蔚伯.食管癌.见:谷铣之，殷蔚伯，刘泰福主编.肿瘤放射治疗 学.北京:北京医科大 学中国协和医科大学联合出版社。 1993，493-509. 3 刘复生.食管癌858例病理形态观察.肿瘤防治研究，1977;4(1):13-15. 4 王小玲，吴国祥，郭明，等. 食管癌60 Co照射后病理形态改变与预后. 肿瘤防治研 究，1993;20:108-109. 5 Micheal BN,Robert MB,Rogert BF, et al. 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