【doc】用HPLC法同时测定六味安消胶囊中土木香内酯、异土木香内酯、大黄素和大黄酚的含量

【doc】用HPLC法同时测定六味安消胶囊中土木香内酯、异土木香内酯、大黄素和大黄酚的含量 用HPLC法同时测定六味安消胶囊中土木香内酯、异土木香内酯、大黄素和大黄酚的 含量 ? 446? 药学服务与研究PharmCare8LRes2008Dee;8(6) 纪松岗,等.用HPIC法同时测定六味安消胶囊中土木香内酯,异土木香内酯,大黄素和大黄酚的含量 ? 论着? 用HPLC法同时测定六味安消胶囊中土木香内酯,异土木香内酯,大黄 素和大黄酚的含量 纪松岗,金柔男.,赵亮,张国庆 (1.中国人民解放军海军401医院药剂科,青岛266071;2.第二军医大学东方肝胆外科医院药材科,上海200438) [摘要]目的:建立HPLC法同时测定六昧安消胶囊中土木香内酯,异土木香内酯,大黄素和大黄酚含量的方法.方法: 采用HPIC一二极管阵列检测器法(HPLC—DAD),色谱柱:AgilentEclipsePlusCI8 柱(250mm×4.6mm,5m),流动相:乙腈一 0.04甲酸(60:40),流速:1.0mL/min,检测波长:220nm,柱温:25?,进样量:1O"L.结果:土木香内酯,异土木香内酯, 大黄素和大黄酚的线性范围分别是:2.46,98.4,2.48--99.2,2.56,102.4和2.58,103.2t*g/mL,色谱响应线性关系良好. 日内和日间RSD均<2;最低检测限分别为1.75,1.31,0.50和0.49/~g/mL.稳定性结果为峰面积的RSD分别为1.29%, 1.40V0,1.30和0.45,在48h内稳定.加样回收率结果分别为99.0,100.6,98.7%和 99.7(n一6),RSD分别为 1.03V0,0.62,1.36和0.26.结论:本法快速,简便,重现性好,精密度高,测定结果准确可 靠,可作为该制剂的定量测 定方法. [关键词]土木香内酯;异土木香内酯;大黄素;大黄酚;六味安消胶囊;含量测定;色谱 法,高压液相 [中图分类号]R927.2[文献标识码]A[文章编号]1671—2838(2008)06—0446—04 Simultaneousdeterminationofalantolactone,isoalantolactone,emodinandchrysophanolinLiuweianxiao capsulesbyHPLCmethod JISong-gang,JINRou—nan.,ZHAOLiang,ZHANGGuo— qing.(1.DepartmentofPharmacy,NavyNo.401Hospitalof PLA,Qingdao266071,China;2.DepartmentofPharmacy,EasternHepatobiliarySurgeryHospital,SecondMilitaryMedical University,Shanghai200438,China) [ABSTRACT']Objective:Toestablishamethodforsimultaneousdeterminationofalantolactone,isoalantolactone,emodinand chrysophanolinLiuweianxiaocapsulesbyhighperformanceliquidchromatography— photodiodearraydetector(HPLC—DAD) method.Methods:AnAgilentEclipsePlusC18column(250mm× 4.6mm,5m)wasusedwiththemobilephaseofacetoni— trile一 0.04V00formicacid(60:40)ataflowrateof1.0mI/min.Thedetectingwavelengthwas220nm,thecolumntemperature was25C,andtheinjectionvolumewas10/,L.Results:Thelinearrangesofalantolactone,isoalantolactone,emodinandchry— sophanolwere2.46—98.4,2.48—99.2,2.56—102.4and2.58— 103.2ptg/mL,respectively,withagreatlinearrelationship.For the4constituents.theresultsofintra— andinter-dayprecision(RSD)atlow,middleandhighconcentrationswerealllessthan 2;thelimitsofquantificationwere1.75,1.31,0.50and0.49ptg/mL,respectively.Thestability resultsin48hshowedthat theRSDswere1.29,1.4O,1.3Oand0.45,respectively.Themeanrecoveryrateswere99.0,10 0.6,98.7and 99.7(一 6),RSDwere1.03,0.62,1.36Vooand0.26V00,respectively.Conclusion:Thismethodissim ple,rapid,repro— ducible,precise,reliableandaccurate.ItcanbeusedforthequantificationofLiuweianxiaoca psules. [KEYWORDS]alantolactone;isoalantolactone;emodin;chrysophanol;Liuwei'anxiaoca psules;contentdetermination;chroma— tography,highpressureliquid [Pharmcare&Res,2008,8(6):446—449] 六味安消散系蒙古族,藏族民间验方,由土木 香,大黄,山奈,诃子,寒水石,碱花六味中药组成,具 有和胃健脾,消积导滞,活血止痛之功效,用于脾胃 不和,积滞内停所致的胃痛胀满,消化不良,便秘,痛 经等症_1].土木香为方中君药,具有健脾和胃,调气 解郁,止痛安胎之功效?J].土木香内酯和异土木香 内酯为一对同分异构体,是土木香中主要活性成分, 具有显着的抗炎,保肝活性…1].大黄为方中臣药,具 泻热通肠,凉血解毒,逐瘀通经之功效口].大黄素, 大黄酚为大黄中主要抗菌成分,含量较高E. 六味安消胶囊为其剂型改革产品,《中华人民共 和国药典}2005年版对六味安消散采用HPLC法测 定,但样品前处理工艺复杂,需经多次回流和萃取, 操作繁琐耗时,结果不易重现?.有文献报道利用 ),博士,主任药师 [作者简介]纪松岗(1964一),男(汉族 E—mail:jisonggang@126.corn 通讯作者,E—mail:guoqing_zhang91@126.corn 药学服务与研究PharmCare&Res2008Dec;8(6) 纪松岗,等.用HP1C法同时测定六味安消胶囊中土木香内酯,异土木香内酯,大黄 素和大黄酚的含量?447? HPLC法测定六味安消胶囊中大黄素,大黄酚的含 量,但仅对其中的臣药进行控制,不能完全反映 该制剂的质量.本研究采用HPIC二极管阵列检 测器法(HPIC—DAD法),样品经甲醇超声提取,可 同时测定君药土木香中土木香内酯和异土木香内 酯,以及臣药大黄中大黄素和大黄酚的含量,方法简 便,快速,准确,可用于六昧安消胶囊的质量控制. 1材料 1.1仪器Agilentl100HPIC仪(在线脱气机,四 元泵,自动进样器,二极管阵列检测器),Agi— lentl100IC/MSD联用仪,ChemStation色谱工作 站;AE240型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒公 司);超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司). 1.2试剂和药品对照品土木香内酯(批号0760— 9501),异土木香内酯(批号761-9601),大黄素(批 号0756—200110)和大黄酚(批号0796—200005)均购 白中国药品生物制品检定所;六味安消胶囊(贵州信 邦制药股份有限公司,0.5g/粒,批号20070503, 20070601,20070801);甲醇(国药集团化学试剂有 限公司)为分析纯;乙腈(Fisher公司)和96甲酸 (Tedia公司)为色谱纯;水为娃哈哈纯净水. 2方法和结果 2.1色谱条件色谱柱:AgilentEclipsePlusC18 柱(250mm×4.6mm,5m);流动相:乙腈一0.04 甲酸(60:40);流速:1.0mI/rain;检测波长: 220nm;柱温:25?;进样量:lOI. 2.2溶液的制备 2.2.1对照品溶液的制备精密称取对照品土木 ::::::::::::::::一 0510152O25 香内酯4.92mg,异土木香内酯4.96mg,大黄素 ,取对照品 5.12mg,分别置于3个5mI容量瓶中 大黄酚1o.32mg置于100mL容量瓶中,分别加甲 醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度分别为土木香内 酯0.984mg/mL,异土木香内酯0.992mg/mL,大 黄素1.024mg/mI,大黄酚103.2/~g/mL的对照品 储备溶液.置于4?冰箱内保存. 分别精密吸取土木香内酯,异土木香内酯和大 黄素对照品储备液0.50mI,大黄酚对照品储备液 5.00mL置于同一10mI容量瓶中,用甲醇稀释至 刻度,摇匀,即得4种成分的混合对照品溶液1,4种 成分浓度分别为49.2,49.6,51.2,51.6ptg/mL.置 于4?冰箱内保存. 2.2.2供试品溶液的制备取干燥至恒重的六味 安消胶囊内容物约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇25mL,密塞,称定重量.超声处理 30min,放冷.用甲醇补足减失的重量,摇匀,用 0.22扯m微孔滤膜过滤,取续滤液,即得. 2.2.3空白溶液的制备色谱进样瓶中仅加入溶 剂甲醇,用于检测试剂对待测物峰形的影响. 2.3结果 2.3.1系统适应性实验按2.2项下方法分别制 备混合对照品溶液1,供试品溶液及空白溶液,在上 述色谱条件下分别进样10I,得相应的色谱图,见 图l.土木香内酯,异土木香内酯,大黄素和大黄酚 均与其他组分分离完全,分离度>1.5,分别在约 9.2,t4,l5,l7.6min处出现大黄素,异土木香内 酯,土木香内酯和大黄酚的色谱峰.理论塔板数以 大黄素峰计不低于1.5×10,以土木香内酯峰计不 低于2×10. B 4 6 c 4 05101520250510l52O25 时fHJ(t/mjn) 图1六昧安消胶囊的HPLC谱图 Fig1HPLCphotogramsofLiuwei'anxiaocapsules A:空白溶液;B:对照品溶液;C:供试品溶液;1:大黄素;2:异土木香内酯;3:土木香内 酯;4:大黄酚 2.3.2线性关系考察精密吸取1.()()mI按 2.2.1项下方法配制的混合对照品溶液1,置于 10mI容量瓶中,加甲醇稀释定容至刻度,摇匀,即 得混合对照品溶液2.取两种浓度的混合对照品溶 液l,2,在2.1项色谱条件下分别进样2O,10,5L, 以对照品溶液的浓度(X,ptg/mI)对峰面积(y)进行 ? 448? ISSN1671—2838PharmCare&Res药学服务与研究2008Dec;8(6) www.pcarjourna1.net.cnE-mailPharmCR@yahoo.com.cnPhn/Fax86—21—65519829 线性回归处理.土木香内酯,异土木香内酯,大黄素 和大黄酚的回归方程分别是Y一12.70X+9.190 (r一1),Y一16.26X+5.707(r一0.9998),Y一 52.14X一4.861(r一0.9996),Y一57.12X+ 3.749(,.一0.9998);线性范围分别是2.46,98.4, 2.48,99.2,2.56,1O2.4和2.58,103.2"g/mI. 2.3.3精密度实验按2.2.1项下方法分别配制 低,中,高3种浓度混合对照品溶液,在2.1项色谱 条件下分别在1d内重复测定3次,以及连续3d每 天分别进样,根据所得峰面积分别考察日内和日间 精密度,结果明本方法的精密度良好(见表1). 表1精密度实验结果 Table1Theresultsofprecisionexperiment (n一3) 对照品徘!/)日?日I(NR)? 土木香内酯 异土木香内酯 大黄素 大黄酚 2.3.4检测限考察以甲醇分别稀释各对照品溶 液,按信噪比S/N一3:1计,确定其最低检测限分 别为土木香内酯1.75/,g/mI,异土木香内酯 1.3lg/mL,大黄素0.50/_tg/mL和大黄酚 0.49p.g/mL. 2.3.5稳定性实验按2.2.2项下方法制备六味 安消胶囊的供试品溶液,在0,2,4,8,16,24,36, 48h分别测定4种成分的峰面积,考察其含量的变 化.结果4种成分峰面积的RSD分别为土木香内 酯1.29,异土木香内酯1.40,大黄素1.30和 大黄酚0.45(一8),表明供试品溶液在48h内稳 定. 2.3.6重复性实验精密称取六味安消胶囊(批号 20070503)6份,按2.2.2项下方法操作,以各成分 峰面积的平均值代人相应线性方程计算4种成分的 含量,结果六味安消胶囊中土木香内酯,异土木香内 酯,大黄素和大黄酚的含量平均值分别为0.42, 0.40,0.65和0.48mg/粒,其峰面积的RSD分别为 1.63,0.77,0.42和0.53(n一6). 2.3.7加样回收率实验取已测含量的六味安消 ,每份1g,精密称 胶囊内容物(批号20070503)6份 定,分别精密加入与样品含量约1:1比例的4种对 照品储备液适量,按2.2.2项下方法操作,测定并计 算回收率,结果见表2. 表2加样回收率实验结果 Table2Theresultsofrecoveryexperiment 2.3.8样品测定取3个批号干燥至恒重的六味 安消胶囊内容物各3份,每份1g,精密称定,按 2.2.2项下方法操作制备供试品溶液,在2.1项色 谱条件下进行测定,每批平行测定3份,计算样品中 4种成分的含量,结果见表3. 表3样品含量测定结果 Table3Theresultsofdeterminationofcontentsinsamples ("一3) 土木香内酯异土木香内酯 批号声量,RSD声量,RSD粒mg)/()【粒mg)/()粒 )"粒)" 大黄素 含量RSD '粒mg ) /() 大黄酚 声RSD【 粒mg ) /() 3讨论 3.1前处理条件考察 3.1.1提取方法考察本研究参考《中华人民共和 国药典}2005年版一部中六味安消散样品前处理方 法和相关文献_2.],分别考察了3种提取方式:加热 回流,超声水解后溶剂萃取和直接超声法.结果表 明,加热回流和直接超声法提取的大黄素和大黄酚 含量接近,而采用超声水解后溶剂萃取法测得的大 黄素和大黄酚含量较低,并且加热回流和超声水解 后溶剂萃取法提取出的土木香内酯和异土木香内酯 含量很少.苏子仁等_8报道大黄素在提取时,因多 药学服务与研究PharmCare&Res2008Dec;8(6) 纪松岗,等.用HPIC法同时测定六味安消胶囊中土木香内酯,异土木香内酯,大黄素 和大黄酚的含量?449? 次回流,萃取转移,在蒸发,干燥过程中,含量会逐步 降低.直接超声提取法能够达到较高的提取效率, 且操作简便,耗时短,故采用直接超声提取法. 3.1.2提取时间考察实验中采用甲醇超声处理, 考察了不同超声时间15,30,45,60rain所提取的4 种成分的含量,结果以超声3Orain提取较完全,之 后随超声时间延长,大黄素和大黄酚含量变化不大, 而土木香内酯和异土木香内酯含量反而有所下降, 故最终确定超声处理30rnin. 3.2色谱条件考察 3.2.1波长的选择采用DAD在190,400nlTt 全波长扫描,结果大黄素和大黄酚的最佳吸收波长 分别为220和223nm,土木香内酯和异土木香内酯 的最佳吸收波长分别为193和196nm,而在220nm 处均有吸收且共同吸收最大,同时可排除杂质对待 测物的干扰,故选择220nm为检测波长. 3.2.2流动相的考察对不同比例的甲醇一水和乙 腈一水体系选择比较,结果发现甲醇一水体系对同分 异构体土木香内酯和异土木香内酯的分离效果较 差.因大黄蒽醌类衍生物为具紫外强吸收的脂溶 性,弱酸性物质,采用反相离子抑制技术,于流动相 中添加少量酸,可抑制各组分的解离,使色谱峰达基 线分离且峰形对称.在权衡分离度,分析时间,拖尾 因子等因素后,确定最佳流动相为乙腈一0.04甲酸 (60:40). 3.2.3色谱峰干扰性考察按2.2.2项下方法操 作制备样品溶液,在2.1项色谱条件下通过DAD 峰纯度检查,以及利用Agilentl100LC/MSD联用 仪分析,在质谱全扫描模式下,提取色谱峰离子,通 过棒图检测,结果发现两种方法的待测峰处均无干 扰性成分,对测定结果无影响. 4结论 采用HPLC-DAD同时测定六味安消胶囊中4 种成分含量未见文献报道,本方法既比分开测定缩 短了分析时间,提高了工作效率,而且节约了流动 相.土木香和大黄分别为方中君药和臣药,以土木 香内酯,异土木香内酯,大黄素和大黄酚为代表的方 中活性成分综合体现了本制剂的整体质量,能够为 六味安消胶囊的质量评价提供准确依据. 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