纤维素_半纤维素_木质素等植物组成成分的测定.doc

纤维素_半纤维素_木质素等植物组成成分的测定.doc 纤维素测定: 纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，纤维素含量的多少，关系到植物细胞机械组织发达与否。因而影响作物的抗倒伏，抗病虫害能力的强弱。测定粮食、蔬菜及纤维作物产品中纤维素含量是鉴定其品质好坏的重要指标。 一、原理 纤维素(cellulose)为β,葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热能分解成β,葡萄糖。β,葡萄糖在强酸作用下，可脱水生成β,糠醛类化合物。β,糠醛类化合物与蒽酮脱水缩合，生成黄色的糠醛衍生物。颜色的深浅可间接定量测定纤维素含量。 二(材料、仪器设备及试剂 (一)材料:烘干的米、面粉或风干的棉、麻纤维。 (二)仪器设备:1. 小试管;2. 量筒;3. 烧杯;4. 移液管;5. 容量瓶;6. 布氏漏斗;7. 分析天平;8. 水浴锅;9. 电炉;10. 分光光度计。 (三)试剂:1. 60,H2SO4溶液;2. 浓H2SO4(AR);3. 2,蒽酮试剂:将2g蒽酮溶解于100ml乙酸乙酯中，贮放于棕色试剂瓶中;4. 纤维素液:准确称取100mg纯纤维素，放入100ml量瓶中，将量瓶放入冰浴中，然后加冷的60,H2SO460,70ml，在冷的条件下消化处理20,30min;然后用60,H2SO4稀释至刻度，摇匀。吸取此液5.0ml放入另一50ml量瓶中，将量瓶放入冰浴中，加蒸馏水稀释至刻度，则每ml含100μg纤维素。 三.实验步骤 (一)求测纤维素标准回归方程 1. 6支小试管，分别放入0，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00ml纤维素标准液，然后分别加入2.00，1.60，1.20，0.80，0.40，0ml蒸馏水，摇匀，则每管依次含纤维素0，40，80，120，160，200μg。 2. 向每管加0.5ml2,蒽酮，再沿管壁加5.0ml浓H2SO4，塞上塞子、摇匀，静置1min。然后在620nm下，求测不同含量纤维素溶液的吸光度。 3. 以测得的吸光度为Y值，对应的纤维素含量为X值，求得Y随X而变的回归方程。 (二)样品纤维素含量的测定 1. 称取风干的棉花纤维0.2g于烧杯中，将烧杯置冷水浴中，加入60,H2SO460ml，并消化30min，然后将消化好的纤维素溶液转入100ml容量瓶，并用60,H2SO4定容至刻度，摇匀后用布氏漏斗过滤于另一烧杯中。 2. 取上述滤液5ml放入100ml容量瓶中，在冷水浴上加蒸馏水稀释至刻度，摇匀后用。 3. 取2中的溶液2ml于具塞试管中，加入0.5ml 2,蒽酮试剂，并沿管壁加5ml浓H2SO4，塞上塞子，摇匀，静置12min，然后在620nm波长下，求测吸光度。 四、结果与分析 根据测得的吸光度按回归方程求出纤维素的量，然后按下式计算样品纤维素的含量: Y(%),X×10-6×a×100 /W 式中:X,按回归方程计算出纤维素含量(μg)。W,样品重(g)。10-6,将μg换算成g的系数。A,样品稀释倍数。Y,样品中纤维素含量(,)。 间接法:一种测定非纤维素各部分，一种用强酸水解纤维素使其成测定方法具体有两种:1. 还原糖，根据该含量换算成纤维素含量。2.直接法:用化学试剂容出木素。半纤，抽提物，的纤维素。最为常用的是硝酸——乙醇法 1.试剂:800ml乙醇(95,)于干的1000ml烧杯，徐徐加入200ml硝酸(密度1.42g/cm3，)每次加入10ml，搅拌匀后在加，备好后放载棕色瓶中，硝酸要缓慢加入，否则可能发生爆炸。 2.步骤 1g(精确到0.0001g)式样于250ml干净锥形瓶中(另取一份测定水分)，加入25ml硝酸——乙醇混合液，装上回流冷凝器，放载沸水浴上加热1小时，加热过程中，随时振荡，以防式样跳动。 移去冷凝器，取下锥形瓶静置。用倾斜法用G2玻沙漏斗滤出液体，用真空将滤器中滤液吸干，在用以上方法反复几次，直到式样成白色。 最后将锥形瓶中式样全部移入滤器，用10ml硝酸——乙醇混合液洗涤，在用热水洗涤用甲基橙试之不呈酸性为止，最后用乙醇洗涤两次。吸干洗液，在105，,3度烘干至恒重。 木素测定 常用的有72,硫酸Tappi标准法和80,硫酸法(更适合非木材原料) 1.1g(精确到0.0001g)式样，用定性滤纸包好，用线扎主，用索氏抽提器，苯醇混合液(2:1)抽提6小时，同时另取一份测定水份。将式样取出风干，用洁净毛笔仔细将抽提风干后式样刷入250ml磨口锥形瓶重，加入12,15度的72,硫酸15ml，摇荡1min，将锥形瓶放入18,20度的恒温水浴锅中，2,2.5小时，随时摇动锥形瓶。 2.将锥形瓶中式样完全移入1000ml锥形瓶中，加水量(包括漂洗小锥形瓶的水)总体积为560ml。回流冷凝，煮沸4小时。用恒重G3玻沙漏斗滤出式样，热水多次洗滤。在105，,3度烘干至恒重。 若是非木材原料需减去原料中的灰份量。 半纤维素的测定: 一般采用间接法，即测定综纤维素的含量，减去纤维素的含量即为半纤维素的含量。 半纤维素含量的测定 1.1实验仪器及试剂 100ml烧杯一只、电炉、离心机、玻棒、球形玻盖、分光光度计、80%的Ca(NO)溶32液、2mol/L盐酸、6%苯酚、浓硫酸 1.2实验步骤 称取黄姜粉0.2g装入100ml烧杯，加入80%的Ca(NO)溶液15ml，加热至沸，在微沸32 的条件下加热5min。稍冷后离心，用10ml热水洗涤，共洗涤离心3次。向装有沉降物的离心管中加入2mol/L盐酸10ml，盖好带有玻棒的球形玻盖，沸水中煮沸45min，同时要定时进行搅拌，随后过滤，收集滤液，待测。取待测样品和对照各2ml(含糖10~50μg)，分别加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，静止10min摇匀，室温放置20min后550nm测光密度。用预先以葡聚糖做好的标准曲线即可计算出样品中总糖的重量，再用下面的公式计算半纤维的百分含量(%) W2 X= ，100%W1 式中: X:半纤维素的百分含量(%) W:黄姜粉的重量(g) 1 W:半纤维素的重量(g) 2 纤维素含量的测定 2.1实验仪器及试剂 离心机、玻棒、球形玻盖、电炉、HAc溶液、HNO溶液、0.25mol/LKCrO-HSO溶液、3227240.25mol/LKCrO-HSO溶液、淀粉溶液、0.05mol/L的NaSO溶液 22724223 2.2实验步骤 称取黄姜粉0.1g，装入离心管中，加入HAc和HNO混合液10ml，盖上带有玻棒的球形玻3 盖，置沸水中煮沸25min，同时要定期进行搅拌。冷却后离心，弃上清。而后向沉降中加0.25mol/LKCrO-HSO溶液10ml，搅匀，将离心管放入开水中10min，并定时搅拌。冷却22724 后将溶液倒入250ml烧杯中，同时用15ml蒸馏水冲洗沉淀。待溶液冷却后加入0.25mol/LK2 KCrO-HSO溶液50ml和几滴淀粉溶液，用0.05mol/L的NaSO体积。按下面的公式计算22322724 纤维素的百分含量(%) 0.675，K(a,b)，100% X= W 式中:X:纤维素百分含量(%) K:NaSO滴定度 223 a:滴定10ml KCrO-HSO对照液所用去NaSO的体积(ml) 22724223 b:测定纤维素所用去NaSO的体积 223 W:黄姜粉的重量(g) 0.675:纤维素的滴定度乘100 木质素含量的测定 3.1实验仪器及试剂 离心机、电炉、玻棒、量筒、1%HAc、丙酮、72%的HSO溶液、10%的BaCl、0.25 mol242,L KCrO-HSO溶液、0.1 mol,LKI溶液、淀粉溶液。 22724 3.2实验步骤 称取黄姜粉0.1g，装入离心管中，加入1%HAc10ml，摇动5min，混匀，然后离心，倾出上清液，将沉降用1%HAc5ml洗一次，然后加丙酮3,4ml，在摇荡的情况下浸泡3min，共浸泡3次。将离心管放入开水中，待沉降充分干燥后，加入72%的HSO溶液3ml，用玻24棒搅成匀浆。室温静置16h(一般放一夜)，使目的物质木质素全溶。第二天向离心管中加10ml蒸馏水，搅匀，置沸水中5min，溶液冷却后加5ml蒸馏水和10%的BaCl0.5ml，搅匀，2离心分离，沉淀用蒸馏水洗2次。向沉淀中加0.25 mol,L KCrO-HSO溶液10ml，搅匀，22724将离心管放入沸水中15min，并定时搅拌。然后冷却，讲溶液倒入250ml烧杯中，同时用15ml蒸馏水冲洗沉淀。待溶液冷却后，加入0.1 mol,LKI溶液50ml和几滴淀粉溶液，用0.05 mol,L NaSO滴定至蓝绿色，记下滴定用NaSO体积。按下面的公式计算木质素的223 223 百分含量(%) 0.675，K(a,b)，100% X= W 式中:X:木质素的百分含量(%) K:NaSO滴定度 223 a:滴定10ml KCrO-HSO对照液所用去NaSO的体积(ml) 2272423 b:测定木质素所用去0.05 mol,L NaSO的体积(ml) 23 W:黄姜粉的重量(g) 0.433:木质素的滴定度乘100. 果胶含量的测定 4.1实验仪器及试剂 250ml三角烧瓶、电炉、回流柱、1000ml烧杯、玻棒、玻璃砂芯漏斗、0.05mol,L盐酸、0.1mol,LNaOH、1mol,LHAc、0.1mol,LCaCl 2 、2mol,L CaCl、 2 4.2实验方法 称取黄姜粉5g，装入250ml三角烧瓶，加入150ml经加热至沸的0.05mol,L盐酸，加热回流1h后，冷却至室温，过滤，将滤液装入1000ml烧杯中加水至300ml，再加入0.1mol,LNaOH100ml，充分搅拌，放置过夜，以皂化。然后加入1mol,LHAc50ml，5min后，加入0.1mol,LCaCl25ml，接着，一边滴加2mol,L CaCl25ml，一边充分搅拌。放置1h后，22 加热煮沸5分钟，趁热过滤，用热水洗至不含氯化物。然后用热水把滤纸上的沉淀无损失的洗入原来的烧杯中，加热煮沸数分钟后，用已知重量的玻璃砂芯漏斗(1G2)过滤，85?烘至恒重。用下面的公式计算果胶百分含量(%) 0.9233，K(W,W)12 X= ，100%W 式中:X:果胶的百分含量(%) W:果胶酸重和玻璃砂芯漏斗重(g) 1 W:黄姜粉的重量(g) 脂肪的含量测定 5.1实验仪器及试 纸筒、索氏提取器、黄姜粉、丙酮 5.2实验步骤 称取黄姜粉5g，然后装入纸筒，用丙酮在索氏提取器中抽提12h。回收丙酮后，烘干称重。再用下面的公式计算脂肪的百分含量(%) W2 X= ，100%W1 式中:X:脂肪的百分含量(%) W:黄姜粉的重量(g) 1 W:脂肪的重量(g) 2 蛋白质的含量测定(考马斯亮兰法(Bradford法)) 6.1实验原理 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置(,max)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A，与蛋白质浓度成正比。 595 6.2试剂与器材 (1)标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白(BSA)或酪蛋白，配制成1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。 (2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 (3)器材:(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)试管10支 6.3实验步骤 1、取10支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管按中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、 0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮 兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量 气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 2、称取被测样品(过100目筛)0.1000g，放入干燥的150ml三角瓶中，先加入1ml 四氯化碳再加入50ml考马斯亮兰G-250试剂，盖上瓶塞，利用振荡器振荡5分钟后， 再 于室温下放置20分钟 ，取适量溶液倒入离心管中，在4000r/min下离心10分钟，将澄清 的上清液倒出，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值 A595。 注意:可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑 料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表格: 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质(1.0mg/ml) 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 未知蛋白质(约2.0mg/ml) 0.05 0.05 0.05 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.05 0.05 0.05 考马斯亮蓝G250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量(,g) 光吸收值(A) 595 3、用标准蛋白质量(,g)为横座标，用吸光度值A为纵座标，作图，即得到一条标595 准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 595 查表数(mg/ug)，稀释倍数100g蛋白质含量= ，100g3/6加入样品总量(g)，10