冬虫夏草菌丝体水提物的抗新城疫病毒作用

冬虫夏草菌丝体水提物的抗新城疫病毒作用 第 卷 第 期 河 北 工 程 大 学 学 报 自 然 科 学 版 . .年 月 .文章编号:? ? ?冬虫夏草菌丝体水提物的抗新城疫病毒作用 刘彦威,王 斌,刘 娜,刘利强,林 燕 河北工程大学 农学院,河北 邯郸 摘要:通过低温水浸提取方法,获取冬虫夏草菌丝体水提物。采用的方法和观察细胞病变的方法分别研究了水提物毒性和抗病毒作用。结果显示水提物浓度? . / 时,对 细胞无毒性, ./ 水提物与新城疫病毒作用,或预处理 细胞,均能抑制新城疫病 毒在细胞上病变的形成。提示水提物具有直接抗新城疫病毒和预防新城疫病毒感染的作用。 关键词:冬虫夏草茵丝体;水提物;新城疫病毒 中图分类号: . 文献标识码:? ? ? ? ?, ,, ? ,, , ,: ? ., . ? . /.? ? .. : ;; 新城疫,,又称为亚洲鸡 病毒滴度,升高血清中? 和? 瘟,是由新城疫病毒 , 等细胞因子的水平,具有较强的抗流感病毒的活 引起的一种高度接触性传染病,本病自年首 性。最近,实验证明冬虫夏草提取物具有抗人巨 次发生以来,已成危害养禽业发展的最严重的禽 细胞病毒活性和抗甲型流 感病毒的活性 。鉴于 此,本课题拟研究冬虫夏草是否具有抗鸡 活 病之一。尽管对该病在诊断与防制方面进行了大 性。由于野生冬虫夏草的昂贵,本研究选用市面 量的研究,并取得了较大的成就,但目前尚无有效 上可以买到的人工冬虫夏草菌丝体为研究对象, 的治疗方法 。 采用低温下水浸提的方法,获取冬虫夏草菌丝体 冬虫夏草是一种名贵的中草药材,含有多种 粗提物,其抗鸡活性。 药理活性成份,比如核苷、多糖、甘露糖等。冬虫 夏草具有多种生物活性:抗氧化、免疫调节、抗肿 和方法 瘤,抗菌,调节血脂等 “ 。目前,冬虫夏草的抗病 毒活性报道较少。等’ 从北冬虫夏草中分离 . 仪器和试剂 出一种酸性多糖,发现该多糖可以降低甲型流感 病毒感染小鼠肺泡灌洗液中流感 培养基 ; ; 细 收稿日期: 一 ? 作者简介:刘彦威 一 ,男,河北辛集市人,教授,博士,从事动物病理方面的 研究。河 北 工 程 大 学 学 报 自 然 科 学 版 细胞病变程度判定 胞和新城疫病毒由中国农业大学传染病室惠赠。 . 酶标仪? :北京艾普生物设备有限公司,:培养箱?:上海搏迅实业有限公司 医 病变程度 病变 无 疗设备厂,倒置显微镜。%的细胞出现. 方法%的细胞出现%的细胞出现 . . 冬虫夏草菌丝体水提物的配制%的细胞出现 在超净工作台中,取干燥菌 丝体,放高速 组织捣碎机,加入 水。温度控制在 ?,置 . . 水提物对新城疫病毒的直接作用 摇床上浸提,每次浸提 , 离心 将 。 、 如 、留取上清,共浸提 次,每次均加入 水,合 。 的新城疫病毒悬液分别与水提物混合, ? 并上清后, 试剂瓶分装。 水浴 ,加入培养 细胞的 孑 细胞板中作用 放人 一 ?冰箱,冷冻,真空冷冻干燥机 ,吸弃液体,加维持液,每组重复 孔,并设无毒浓 冷冻干燥。得到浸膏后放一 ?冰箱保存,备用。 度药品对照仅加水提物 、细胞对照病毒和水提物取冻于菌丝体水提物,加入 水,混匀,溶解 均不加 、病毒对照 仅接种病毒 。放于 ?, % 后,用 .微孔滤膜过滤,放 冰箱备用,用,培养箱中培养, 用 法观察结果。 细胞培养液 稀释成使用液。 . . 水提物对新城疫病毒的预防作用 . . 检测 将培养好细胞的 孔板中的液体吸出,待培养的 细胞铺满后,吸掉培养液上 加入水提物 ?作用 ,吸弃液体,加 清,清洗两次,加入配制好的 . %胰酶消化贴壁的新城疫病毒悬液 细胞,待细胞变圆脱落后,加入含 %的培养?作用 ,吸弃液体,并设无毒浓度药品 液终止反应。 对照、细胞对照、病毒对照。放于 ?, %,培将细胞吹匀后,计数,转入 孔板细 胞,孔 ,其中第 列与第 列,加人不含细胞的培 养箱中作用 ,用法观察结果。 养液,放入培养箱, ?, %培养。 . . 水提物对新城疫病毒的治疗作用 将培养细胞的 孔板中的液体吸出,加 后,观察细胞,如呈较好分布,则加入 等量梯度稀释药物,其中第 列不加药物,作为 、 。的新城疫病毒悬液 对照。/?作用,吸弃液体,加入水提物后,每孑 分别加人含 /丫 的培 ?作用 ,吸弃液体,并设无毒浓度药品对照、 养液 ,孵育 。 细胞对照、病毒对照。放于 ?, %,培养箱吸干上清后,加入 ,在振荡器 中作用,用 法观察结果。所得结果进行秩 上混匀 。 和检验中的检验。用酶标仪读板,记录 值。 结果 . . 病毒液 半数感染量 的测定 吸取已培养好 细胞的 孔培养板 . 浸膏的特征的培养液,将新城疫病毒 株 用维持液分 别配成原液的 ~、 ~、 一、 ~、 ~、 ~、 菌丝体经过粉碎、浸提、真空冷冻干燥后, ~、 ~、 一、 。悬液 管,接种在细胞 形成浸膏,为褐色,较粘稠,但用水很容易将其 板中 ,吸弃病毒悬液,加维持液,每浓度梯度重 融解,得到褐色的储备液/,最后用 复 孔,设空白对照和细胞对照。放于 ?、 % 培养液稀释。 培养箱中培养, 后观察结果。法判断 . 水提物的浓度与毒性 细胞病变程度见表 。按 ? 公式计算 。。新城疫病毒的 为 ~。 在选择冬虫夏草水提物的测试浓度时,当冬 虫夏草水提物浓度为 / 时,对细胞具有代第 期 刘彦戚等:冬虫夏草菌丝 体水提物的抗新城疫病毒作用 谢毒性,而为 . / 时,无代谢毒性。所以 预防作用。水提物在 病毒 我们选择 / ,进行 倍系列稀释,这样可以 。 和 。病毒时,对病毒抑杀作用 保证有产生细胞毒性的浓度,也可保证较小的组 不明显 表,在 病毒时,明显抑制 问差别,而且梯度差别较大, 值上可以表现细胞 形成,与病毒对照组统计学有显著出一定的差距。 性差异 .。病毒对照有明显的细胞病变 当冬虫夏草水提物浓度为/ 时,在镜下 出现,而药物对照未见细胞病变,提示药物对细胞 观察细胞形态,细胞边界清晰,但是有些细胞已经 没有毒性作用。细胞对照也未出现病变。 ? 悬浮,细胞形态严重改变,胞质中有异物感,细胞 表 水提物对病毒的预防作用 .发生严重的细胞病变。而在 . / 的浓度下。 与未添加药物的细胞相比,镜下观察,没有变化。 病变 水提物 病毒对照 细胞 药物 同时采用法,当冬虫夏草水提物浓度 ? . / ,发现细胞的活性基本没有变化 表 。 表 菌丝体水提物的细胞毒性试验 一 一 一 一 ~ 一一 治疗作用。水提物对不同浓度的病毒均没有治疗作用表 。病毒对照有明显的细胞病变出现,而药物对照未见细胞病变,提示药物对细胞没有毒性作用。细胞对照也未出现痫变表 水提物对病毒的治疗作用 .病 变 水提物 病毒对照 细胞 药物 . 对病毒的作用直接杀灭作用。水提物在 病毒 。 时,对病毒抑杀作用不明显 表,在病毒 病毒量为 时,明显抑制 细 胞形成,与病毒对照组统计学有显著性差异 .,在 病毒 毒量为 。时,基本可抑 制细胞 形成。病毒对照有明显的细胞病 结论 变出现,而药物对照未见细胞病变,提示药物对细大体积溶剂低温浸提,可以充分溶解成份, 胞没有毒性作用。细胞对照也未出现病变。 表 水提物抗病毒的直接杀灭作用 从而减小了低温下某些成份溶解速度慢,溶解度 . 低的弊端。 ./ 冬虫夏草水提物对细胞的代谢无 影响。 水提物 病毒列照 细胞 约物 病变 体外实验发现水提物对病毒具有预防和抑 对照 杀作用,而对细胞没有毒性,是一种低毒的体外抗 新城疫病毒物质,具有潜在的抗鸡新城疫病毒临 床应用价值。 参考文献:, , ,.