猪脑蛋白水解物中小分子肽的制备及生物活性测定

猪脑蛋白水解物中小分子肽的制备及生物活性测定 猪脑蛋白水解物中小分子肽的制备及生物 活性测定 河北医药2OO6年3旦箜婴鲞筮塑旦丛2垫!: 猪脑蛋白水解物中小分子肽的制备 及生物活性测定 张惠敏王娅莉耿亚鹏 【摘要】目的从猪脑中制备不同分子量范围的小分子肽组份,测定各组份的生物活性.方法 (1)猪脑经脱脂,酶解,SephadexG-15凝胶过滤制备小分子肽.(2)采用东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障 碍模型,通过小鼠被动回避跳台实验测定组份的生物活性.结果(1)得到A1,A5五个小分子肽组份. (2)分别给药A4,A5的两组小鼠潜伏期和错误次数与模型组差异显着(P<0.05). 结论组份A4,A5 具有明显的生物活性,能显着改善记忆获得障碍小鼠的学习记忆能力. 【关键词】猪脑蛋白水解物;小分子肽;跳台实验 动物脑蛋白水解物可用于治疗一些脑功能性疾病,近年来 人们对其进行了大量研究,并有众多的脑蛋白水解物产品涌入临 床,其中奥地利依比威药厂(1~-we)生产的脑活素注射液已有40 年的历史,临床应用最为广泛.国内外众多学者对脑活素的药理 活性给予充分的肯定"I2J.脑活素临床上可用于神经系统疾病特 别是阿尔茨海默氏病(AD)的治疗J,能明显延缓老年痴呆病变 的进展,改善痴呆症状.还可用于脑中风,脑震荡,脑损伤,脑动 脉硬化,新生儿缺血缺氧性脑病等许多脑部疾病的治疗. 脑活素1989年进入中国市场并以其良好的疗效广泛应用 到临床.脑活素是由猪脑蛋白经水解进一步提取制得的生物 制剂,含有75%的游离氨基酸和25%的小分子肽.研究明脑 活素的药理作用与其含有的小分子肽类的多种生物活性有 关,因此对制备和研究动物脑组织水解物中小分子肽具有重 大意义. 1与方法 1.1材料猪脑(市场购得),昆明种小鼠(中国药品生物制品 检定所提供),SephadexG-15(AmershamBioscience). 1.2试药与试剂酸性蛋白酶(肇东市北方酶制剂有限公司 25000U/g),生理盐水(石家庄制药集团有限公司),氢溴酸东莨 菪碱注射液(上海禾丰制药有限公司,0.3ms/m1),其他化学试 剂均为分析纯. 1.3仪器Wate~650E蛋白纯化系统(Waters公司),Viais AD2.0ES冻干机(theVirtisCompany),JXDT-1型小动物跳台仪 (冀星实验仪器有限公司). 1.4方法(1)小分子肽的制备:新鲜猪脑去膜,去血管,洗净 后切成小块,放入索氏提取器内,用丙酮回流12h后,取出压碎 晾干,再用丙酮回流12h,所得固形物再用乙醚按上法回流提取 共24h,晾干后即得到猪脑脱脂蛋白粉.猪脑脱脂蛋白粉与5 倍的水混合,加入猪脑脱脂蛋白粉重量2%的酸性蛋白酶,混匀 后用冰醋酸调pH值至2.00?0.05,50~C连续水解36h,并保持 pH值在2.0,4.0,过滤,滤液5o?减压蒸干后,分别用石油醚 和无水乙醇搅拌24h,抽滤,滤饼真空干燥即得猪脑蛋白水解 物.水解产物用SephadexG.-15凝胶柱,以0.9%NaC1为洗脱液 进行分离纯化,分段收集各流份并脱盐,冷冻干燥后即可得到 不同分子量范围的小分子肽组份.(2)对小鼠学习记忆的影 作者单位:050015石家庄市,华北制药集团新药研发公司 223 ? 药物研究? 响:取小鼠70只,体重19,21g,雌雄兼用,随机分成7组,每组 10只.正常对照组和模型对照组均腹腔注射生理盐水,其余5 组分别按剂量150ms/kg腹腔注射所制得的样品.连续注射7 d,每天1次.末次给药30min后,除正常对照组腹腔注射生理 盐水外,其余6组按剂量3ms/kg腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射 液.30min后在跳台仪中训练测试.先让小鼠熟悉跳台仪环境 3min,然后通以36V电压,小鼠受到电击后会跳上跳台逃避. 跳下时以小鼠双足同时接触铜栅为触电,视为错误反应.训练 5min,观察和记录小鼠跳上跳台的时间和5min内的错误次数 作为学习指标.24h后重作测试,测时先将小鼠放置在跳台 上,同时开动秒表记录小鼠第1次跳下的时间,此为触电潜伏 期,同时记录5min内跳下跳台次数(错误次数),若5min内小 鼠没有从跳台上跳下,则潜伏期记为300s,错误次数记为0,潜 伏期和错误次数作为记忆指标.训练和测试均在下午同一时 间内进行,各组动物交叉进行"J. 1.5统计学处理测定数据以牙?s表示,采用t检验统计处 理.P<0.05为差异有显着性. 2结果与讨论 2.1脱脂蛋白粉及酶解产物的收率1800g新鲜猪脑共制得 脱脂蛋白粉67g,收率为3.7%.脱脂蛋白粉的酶解收率为 31.2%.经过凝胶过滤共收集到5个组份,此步的收率为94. 5%.直接用去离子水洗脱,可以省去脱盐步骤,操作简单,但 是用去离子水洗脱只收集到4个组份,且收率仅为79.4%,这 可能与用纯水洗脱时,Sephadex凝胶对某些蛋白的非特异性吸 附有关,因此本实验采用0.9%NaC1溶液洗脱. 2.2对小鼠学习记忆影响的测定结果对各组动物的触电潜 伏期和错误次数进行t检验,结果表明模型对照组与空白对照 组比较,潜伏期明显缩短,5min内错误次数明显增加 (P<0.01),说明所造的记忆获得障碍模型成功,见表1. 表1跳台实验结果n:10,i? 注:与空白对照组比较,P<0.05,P<0.01;与模型对照组比较,P< 0.05.P<0.01 224北医药2006年3月箜28卷筮::垫:: A1,A2组与模型对照组比较,潜伏期和5min内的错误次 数差异均无显着性(P>0.05),这说明组份A1,A2不具有显着 的学习和记忆改善作用.A3组与模型对照组比较,潜伏期明显 延长(P<0.05),但错误次数没有显着减少(P>0.o5),这一 结果表明组份A3学习和记忆改善作用尚不能肯定.A4,A5组 与模型对照组比较,潜伏期明显延长(P<0.05,P<0.01),错 误次数显着减少(P<0.05,P<0.01),说明其能明显增强记 忆障碍小鼠的学习记忆能力.虽然A1和A2组与对照组差异 无显着性,但两组的潜伏期均有所延长,5min内的错误次数均 有所减少. 本文以新鲜健康猪脑为原料,采用酸性蛋白酶水解,Sepha- dexG-15凝胶过滤方法对酶解产物进行分离纯化,得到5个小 分子肽组份,并对其生物活性进行测定,这对进一步研究小分 子肽的结构以及临床用药的质量控制都有积极意义. 参考文献 1K_orolevaVI,KorolevOS,MaresV,eta1.Hipp0c8IIdamgeinducedby carbonn~noxidepoiso,~ingandspreadingdepressionisalleviatedbychronic trealmentwithbrainderivedpolypeptides.BrainRes,1999,816:618-627. 2RubenJB,DafangWu,ManfredW.InvivoIlp鹎0l10ftheblood-brain barrierGLUT1gluo0日etransporterbybraln-derivedpepdes.Neua'~dBes, l999.34:2l7-224. 3RuetherE.M0es8lH,WindischM.TheMABstudy-A?,d?eddl:lu~e- blindO1aeebo-eontrolledtrialwitheerebrolysininAlzeimer'8disease.Fair Neum~ychophann,2OO0,10:S355. 4RaiIlerM.M0es8lH.~ysininthetresUnerltIfd~lelllJSlOpen-label stuldywith8m呻cagera.EurNeumpsydaophann,2O00,l0:S3:56. 5RuetherE,Gn~inbauerR,WindischM.Follow-upinves~iguficninp tIlAlzheimer'sdise?e24weeksaftertem~nationofcerebrolysin出e捌py. 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