孕妇外周血中胎儿有核红细胞数目与孕周关系研究

孕妇外周血中胎儿有核红细胞数目与孕周关系研究 [摘要] 从孕产妇静脉血中提取胎儿有核红细胞的检测方法是产前诊断胎儿遗传性疾病的最佳途径之一。沈阳市妇婴医院随机选择了30例7-26周的孕产妇，采用Kleihauer染色法标记胎儿有核红细胞。结果明，Kleihauer法能检测到胎儿有核红细胞的最早期为孕8周，从孕8-20周，母血中胎儿有核红细胞数量与孕周有显著直线相关性，母体血循环中胎儿细胞的比例随孕龄增加。 [关键词] 胎儿有核红细胞;产前诊断;孕周 [中图分类号]R714 [文献标识码]C [文章编号]1673-7210(2008)06(c)-195-02 目前，对遗传性疾病的产前诊断，根据诊断方法是否对胎儿构成不良影响的程度分为无创性的和有创性的。有创性的产前诊断方法包括绒毛活检、羊膜腔穿刺、胎儿宫内取血等，这些手段虽然诊断准确率较高，但对胎儿有一定的危害，且有导致孕妇发生流产的可能。而从孕妇外周血中富集、纯化胎儿细胞或游离DNA，用于产前诊断则属无创性的。通过胎盘循环进入母体血液的胎儿细胞有许多不同种类，它们是:有核红细胞[1]、滋养层细胞、淋巴细胞和粒细胞。研究发现胎儿有核红细胞因为其拥有完整的胎儿基因组、寿命短而不受上次妊娠影响、形态上易于辨认及多种特异的标记可供选择等特点，成为最佳候选[2]。本研究应用Kleihauer染色法标记胎儿有核红细胞，以初步揭示孕妇外周血中胎儿有核红细胞数目与孕周关系。 1实验材料与方法 标本来源，随机选择2006年9月-2007年3月在沈阳市妇婴医院遗传咨询门诊的30例受试者，妊娠7-26周，取孕妇静脉10 ml，枸橼酸钠抗凝。1例男性胎儿脐血作为阳性对照和3例正常未孕女性及3例正常男性做为阴性对照。(均来自于沈阳市妇婴医院节育门诊)。上述样本的采集均获得孕妇及其家属的知情同意，用于无创性产前基因诊断的研究。 1.1不连续密度梯度离心法初步富集有核红细胞 取孕妇静脉血10ml，枸橼酸钠抗凝，经二倍体积PBS(PH7.4)稀释后，轻轻加入到1.085g/ml和1.075 g/ml的Percoll液上，400 g室温离心30分钟，吸取1.075 g/ml和1.085g/ml分离介质之间的细胞层，二倍体积PBS洗3次，每次1200转/分室温离心10分钟。去上清，将离心沉淀部分放入1.5毫升Eppendorf管中，按40个细胞/视野将离心沉淀加入到细胞涂片离心机中，800转/分钟室温离心3分钟制成玻片。 1.2 Kleihauer染色法标记胎儿有核红细胞 载有待检细胞的涂片自然干燥后，浸入80%乙醇中固定5 min，再浸入预热的柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH3.3~5.0)37? 5 min。自然干燥后滴加Mayer's苏木素溶液染色3 min，最后用0.1%伊红水溶液复染玻片4 min。用流水缓慢冲洗，自然干燥后镜下观测、计数。 2实验结果 Kleihauer法染色标记胎儿细胞 阳性胎儿有核红细胞的胞浆呈深红色，而周围母体的有核红细胞则无色。 Kleihauer法能检测到胎儿有核红细胞的最早期为孕8周，最适孕周为孕13~17周。30例孕妇中，有25例检出有Kleihauer染色阳性细胞，其余5例未检出。检出数量从2.2/10 ml~14.25个/10ml不等，平均为7.12个/10ml。另外3例正常未孕女性及3例正常男性的外周血中均未检出有NRBC。 3讨论 世界上现已发现的遗传性疾病共有6000多种，并以每年新发现100种的速度递增。以现行的医疗水平，绝大多数遗传病仍缺乏行之有效的治疗手段。产前诊断的目的是出生前判断出胎儿的染色体或基因是否正常，如诊断胎儿患有遗传性疾病或畸形给予选择性流产，防止遗传性患儿的出世，达到优生的目的。 目前产前诊断热点辅助生殖技术中的植入前遗传学诊断(PGD)，该方法取样于辅助生殖技术中植入前的胚胎，进行基因检测，排除致病基因的胚胎才移植，避免了选择性流产和多次流产的危害及伦理道德观念的冲突。但该方法也存在一些缺点:1.胚胎存在嵌合型，胚胎中的细胞带有不同的遗传物质，活检获得的单卵裂球并不能代表整个胚胎的基因型。2胚胎可供诊断的物质有限，这些将影响PGD的准确性。3胚胎活检受损或诊断技术(荧光原位杂交或聚合酶链反应)的失败都将影响PGD的成功率，减少妊娠的机会。 孕妇外周血中分选胎儿NRBCs和血浆中胎儿DNA的方法已取得较大进展.利用母血中胎儿细胞诊断遗传性疾病可望成为最佳非创伤性产前诊断技术.妊娠过程中，胚胎与母体血液间从无直接沟通，胚胎生长发育所需的氧气和营养物质必须通过胎盘屏障吸收，同时也经此途径排出代谢产物。由于绒毛直接浸泡于母血中，因而胎盘屏障容易受到物理化学及免疫等因素的影响而出现损伤，胎儿有核红细胞及游离的DNA因此有可能通过胎盘进入母体循环。因此，在排除血液系统疾病后，妊娠妇女外周血中如果发现有核红细胞，应来自胎儿。胎儿有核红细胞属单个核细胞,含胎儿全部基因组。存在于孕母血液中的胎儿有核红细胞寿命一般不超过100天，与继往妊娠无关，容易通过形态学及特殊的血红蛋白反应进行鉴别，且含量在1:102-1:107 之间，只要有适当的方法便足能作遗传学和分子生物学分析。在母体循环中胎儿细胞的数量与胎儿本身产生红细胞的多寡，胎盘的完整性以及母体全身免疫和对胎儿的局部免疫状态密切相关。孕妇年龄、孕次、产次及孕周对母血中胎儿有核红细胞计数均有影响。 母血中胎儿有核红细胞的提取可能因实验方法的不同而有差异。可采用密度梯度离心、荧光激活细胞分选术,磁激活细胞分选术、细胞培养,显微操作分选等方法将胎儿细胞分选富集.现可从基因和染色体两个水平通过母血中胎儿细胞进行非创伤性产前诊断。本实验我们采用了不连续密度梯度离心法及Kleihauer法染色，该方法操作步骤少，减少了细胞丢失及破坏，细胞形态完整，检出率高。在本试验中，正常妊娠时母血中胎儿有核红细胞约为2.1-13.17个/10ml ,稍高于以往报道[3]。其中有5例受试者没有检测到Kleihauer染色阳性细胞，可能有以下几点原因:?胎儿个体发育速度有差异，孕7-8周孕妇外周血中可能无胎儿有核红细胞存在。?母体外周血中胎儿细胞数量稀少，在实验中易受各种因素的影响，在操作过程中可能由于细胞破坏，从而检测不到胎儿有核红细胞。 胎儿NRBC首次出现于孕妇外周血中的时间存在个体差异，在不同孕周胎儿细胞数量会发生相应改变。Lee等[4]应用电荷流式分离法对NRBC在不同孕周出现在母血中的频率进行研究发现，在7-25W分离效果较好。Rodriguez等[5]应用双重密度梯度离心和MACS分离胎儿细胞，结果表明，胎儿有核红细胞从孕早期到孕中期逐渐增高，而孕15周是无创性产前基因诊断的最佳孕期。但也有母血中胎儿有核红细胞数量与孕周无关的报道[6]。 本实验结果表明，经Kleihauer染色法能检测到胎儿有核红细胞的最早期为孕8周，自孕8-20周，母血中胎儿有核红细胞数量与孕周有显著直线相关性，母体循环中胎儿细胞的比例随孕龄增加。我们推测,随着胎儿发育成熟，虽然胎儿血液中有核红细胞在全血细胞中所占比例逐渐降低，但与此同时，胎儿的血容量逐渐增加，与母体交换加快;而且，细胞滋养层外壳在胚胎及胎儿发育过程中迅速增殖，使母体循环和胎儿循环间的物质交换面积大大增加。此外，胎盘血流量随妊娠进展逐渐增加。这些可能是母血中胎儿有核红细胞数量随孕周显著增加的主要原因[7]。 [参考文献] [1]Diana W, Bianchi, John M, et al. Quantitative of fetal cells in maternal blood in normal andAneuploid pregnancies. Am J Hum Genet,1997,61:822-829. [2]Kuo PL. Frequencies of fetal nucleated red cells in maternal blood during different stages of gestation. Fetal Diagn Ther,1998,13(6):375-379. [3]马旭, 张恩仲, 赵丽.孕妇血中胎儿细胞性质和来源的研究. 中华医学杂志, 1995, 75 (10) : 631,632. [4]Simpson JL , Elias S1Isolating fetal cells from maternal blood: advances in prenatal diagnosis through molecular technology.JAMA,1993, 270: 2357,2361. [5]姜宏,孕妇外周血胎儿细胞的分离及其在产前诊断中的应用.国外医学妇产科学分册, 2000, 27 (1) : 6,101. [6]Benirschke K1 Anatomical relationship between fetus and mother In: Simpson JL , Elias S1 Eds1 Fetal cells in maternal blood: prospects for noninvasive prenatal diagnosis [J].New York: New York Academy of Science, 1997, 731: 9, 20 [7]Hamada H，Arinami T，Hamaguchi H，et al. Fetal nuleated cells in maternal peripheral blood:Frequency and Relationship to gestational age. Hum Genet 1993, 91: 427-432. (收稿日期:2008-02-21)