母乳蛋白质组学研究_王静（可编辑）

母乳蛋白质组学研究_王静（可编辑） chinadairynet 中国乳品工业 rpgychinajournalnetcn 母乳蛋白质组学研究 1 2 2 2 1 1 王静 王利红 高艳 张成岗 邹丽萍 王航雁 中国人民解放军总医院小儿内科北京 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京 1 100853 2 100850 摘 要建立并评价一种去除母乳中高丰度蛋白的方法富集低丰度蛋白通过蛋 白质组学技术探索母乳中的重要活性蛋白 选取了30 个不同等电点及分子量区域的孤立蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定 通 过Mascot搜索引擎检索UniProt数据库 确定蛋白质信 息 结果表明母乳中的 种高丰度蛋白均得到一定程度的去除并通过蛋白质 组学技术鉴定出 个蛋白发现母乳中低丰度的蛋白如 4 29 补体 的片段维生素 结合蛋白 家族等 C3 D A NDRG 关键词母乳多克隆抗体制备高丰度蛋白免疫亲和层析蛋白质组 中图分类号 文献标识码 文章编号 TS2521 A 1001-2230 2009 01-0004-06 Proteomics analysis of brest milk 1 2 2 2 1 1 WANG Jing WANG Li-hong GAO Yan ZHANG Cheng-gang ZOU Li-ping WENG Hang-yan 1Department of Pediatrics Chinese PLA General Hospital Beijing 100853China 2Department of Neurobiology Institute of Radiation Medicine Beijing 100850China AbstractWe established and evaluated a method for removing high-abundance proteins in breast milk The method enables enrichment of low-abundance proteins and study of important proteins in breast milk by proteomicsThirty protein spots in the 2-D gel were identified with MALDI-TOF-MS The peptide mass fingerprints were analyzed by Mascot searching in the UniProt database to identify the proteins In our study four high-abundance proteins in breast milk were removed with different efficiencies Furthermore 29 proteins were identified in our study including complement fragments chain A of vitamin D binding protein and NDRG3 Therefore our study established a novel method for the enrichment of low-abundance proteins in breast milk and identified novel low-abundance proteins Key words breast milk polyclonal antibody high-abundance proteins immuno-affinity chromatography proteomics [4] 血浆 蛋白质组 所面临的挑战相同由于标本上 0 引 言 样量 的限制低丰度蛋白检出率低而很多低丰度蛋 母乳作为婴儿理想的天然食物 除了蛋白质脂 白很可能正是信号转导和生物调控等生命活动中的 肪碳水化合物矿物质微量元素等为婴儿生长发 关键蛋白 目前除去高丰度蛋白富集低丰度蛋白是 育提供能量与营养物质外还含有丰富的生物活性物 解决研究瓶颈的主要策略 质在增强婴儿抗感染能力促进组织器官发育建立 本研究将母乳样品中的全部蛋白作为混合抗原 自身免疫系统乃至调节婴儿社会行为等多方面发挥 免疫动物制备多克隆抗体通过免疫亲和层析技术将 着重要的生物学功能其中包括占母乳总蛋白量20 所制备的抗混合抗原的抗体进行结合并洗脱达到除 40 的酪蛋白乳铁蛋白免疫球蛋白细胞因子生长 去部分高丰度蛋白富集低丰度蛋白的目的进行进 [1 2] 因子激素和酶类等 已有学者采用利用蛋白质组 一步蛋白质组学研究 [3] 学技术路线来探索母乳中尚未报道的蛋白 与国际 , 材 料 收稿日期 2008-05-20 1(1 试剂与仪器 基金项目北京市自然科学基金项目7053080 作者简介王静 1976- 女主治医师研究方向为母乳对婴儿发育的 福氏佐剂CNBr- 活化的Sepharose 4B Protein 层析 影响 AG agarose Western Blotting Luminol Reagent 年第 卷第 期总第 期 4 2009 37 1 2 18 Research Papers 研究报告 预装柱抗人酪蛋白单克隆抗体抗人乳铁蛋白单克 干式电转仪转至醋酸纤维素膜上质量分数为 脱脂 5 隆抗体 抗人白蛋白单克隆抗体及抗人 抗体辣 奶粉的 封闭过夜 再分别以含抗人酪蛋白单克隆 IgA TBS 根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体 其他试剂为国产 抗体 ? 抗人乳铁蛋白单克隆抗体 ? 1 2000 1 2000 分析纯 固相 梯度等电聚焦仪 抗人 白蛋白单克隆抗体 ? 及抗人 抗体 ? pH IPGphor IEF System 1 1000 IgA 1 垂直板电泳仪 质 的 缓冲液中室温孵育 用 缓 Ettan DALT Six MALDI-TOF-MS 1000 TBS-T 15 h TBS-T 谱仪 冲液洗涤5 min 4 次分别放入辣根过氧化物酶标记 母乳的采集 的羊抗鼠抗 体 ? 的 缓冲液室温孵育 1(2 1 3000 TBS-T 1 h 收集 位产后 母亲的初乳 采集样本前 缓冲液洗涤 次最后用化学发光试剂 10 25 d 5 mL TBS-T 5 min 4 用酒精棉球消毒乳头及收集者的手人工挤压法将乳 对膜进行发光反应并感光于柯达 光片上显影 X 汁直接挤入消毒的试管内在4 ? 2 000 g离心20 min 2(5 双向电泳 避开上层的脂质层吸取乳清部分将 份样本混合 将母乳蛋白样本超滤离心 10 10 ku Microcon YM- 法测定蛋白质量浓度分装并冻存于 冰箱 浓缩脱盐 法测定蛋白质量浓度确定上 BCA -70 ? 3 Bradford 中待检 样量 体 积 胶 750 μg 450 μL 24 cm pH 3-10NL IPG 实验动物 条 重水 化 随后等电聚焦总电压时间积为 1(3 20 ? 14 h 月龄左右的雌性日本大耳白兔 只 体重约 平衡胶条第二向 电泳将胶条移 3 3 2 70 kVh SDS-PAGE 由本院动物中心提供 至 聚丙 烯酰胺凝胶上端 电泳条件设置为恒定电 25 kg 12 流20 mA胶30 min 后改为恒定电流30 mA胶 2 方 法 电泳至指示剂溴酚 蓝前沿达胶底线 考马斯亮蓝染 2(1 母乳多克隆抗体的制备 色扫描 胶图 母乳样本经完全福氏佐剂乳化后 终质量浓度 2(6 质谱鉴定 皮下多点注射免疫日本大耳白兔 免疫剂量 胶内酶切切取双向电泳胶上蛋白点 2 大 4gL 1,2mm 只 免疫前取兔耳血留作正常血清对照 在初 小置离心管中加入 脱色液浸泡并振荡重 125mg 100 μL 次免疫后的第 周分别以等量的抗原与非完全福 复此步骤至蓝色褪尽真空干燥加入 胰蛋白酶 4 6 8 15μL 氏佐剂乳化进行加强免疫 并于加强免疫后第 取 10d 酶解液 放置 待被胶块吸收后补充酶解 4 ? 30 min 耳血间接ELISA法测定抗体效价当抗体效价达到105 缓冲液使胶完全浸没 孵育 过夜 向胶块中 37 ? 16 h 以上时从动物颈动脉放血分离血清 加入 肽提取液 水浴 收集上清再加 100 μL I 40 ? 1 h 2(2 母乳多克隆抗体的纯化 入 肽提取液 水浴 收集上清合并上 100 μL II 30 ? 1 h 将Protein AG agarose 装柱 操作步骤按书 清真空干燥 采用MALDI-TOF-MS质谱仪肽质量 进行将收集的抗母乳蛋白的兔血清在纯化柱中孵育 指纹谱鉴定蛋白采用Mascot搜索引擎检索UniProt数 30 min 先后以浓度为100 mmolL 及10 mmolL 的 据库检索参数如表 所示 1 Tris-Cl pH 80 洗涤最后用浓度为100 mmolL甘氨 表 蛋白点数据库检索参数 1 酸 pH 30 洗脱分管收集洗脱液经SDS-PAGE 电 Type of search 检索类型 Peptide Mass Fingerprint 肽质量指纹谱 泳将含有抗体的洗脱液合并 Database数据库 NCBInr 2(3 母乳的免疫亲和层析 Taxonomy物种 Homosapiens human 人 参照说明书操作步骤 将纯化后的母乳多克隆抗 Enzyme酶 Trypsin胰蛋白酶 体与CNBr-活化的Sepharose 4B偶联并装柱柱体积为 Modifications修饰 Carbamidomethyl C 半胱氨酸碘乙酰胺化 15 mL 基于抗原与抗体结合的特异性母乳经045 μm Oxidation M 氧化 Mass values 肽段值 Monoisotopic单同位素峰 的滤纸加压过滤用纯水稀释至15 ml 约8mg 室温下 Protein mass蛋白质量 Unrestricted不限 在层析柱内孵育30 min过柱收集过柱液以15 mL浓 Peptide mass tolerance 03u 度为100 mmolL的Tris-HCl洗涤出大部分未与抗体结 可接受的肽段质量误差 合的母乳蛋白 收集此段洗涤液作为去除高丰度蛋白 Peptide charge state 1 的母乳再充分洗涤层析柱后用浓度为200 mmolL 的 肽段电荷 甘氨酸 pH 20 洗脱与抗体上结合的蛋白分管收集 Missed Cleavages 1 洗脱液平衡及再生亲和层析柱将收集到的样本进行 允许漏切的酶切位点数 SDS-PAGE 电泳合并含有洗脱蛋白的洗脱液 3 结 果 2(4 Western-blot法对免疫亲和层析效果验证 将母乳与免疫亲和层析收集到的非特异洗脱液 3(1 抗母乳蛋白多克隆抗体的制备纯化 5 去高丰度蛋白后的母乳 进行 电泳经半 于免疫第 周后测定兔抗血清效价已达 以上 SDS-PAGE 8 10 Vol37 No1 2009 total 218 5 研究报告Research Papers 收集抗血清过Protein AG agarose亲和柱纯化 抗血 组结果中均有显影考虑为非特异性条带尽管如 清经纯化后出现明显的IgG 55 ku 的重链带和24 ku 的 此该条带也有减弱趋势仍能提示乳铁蛋白有所 轻链带 见图 去除 1 分泌型 分 子量为 [6] 箭头所指的特 3 IgA 7880 ku 异性条带消失提示 分泌型 被有效去除 IgA 人血清白蛋白 是血浆中的高丰度蛋白 占血浆 4 蛋白的5070 [7] 蛋 白分子量为67 ku 本研究用人 血清白蛋白抗体跟踪了母乳中血清白蛋白被屏蔽的 效果结果显示箭头所指的约66 ku处及31 ku处的条 带有消失考虑 处为白蛋白条带 处的条带 66 ku 31 ku 可能为白蛋白的片段 因此提示血清白蛋白的成分有 所去除 多克隆抗体纯化前 多克隆抗体纯化后 1- 2- 图 母乳的多克隆抗体纯化前后的比较 1 SDS-PAGE 3(2 母乳样品的免疫亲和层析 图 为母乳免疫亲和层析的 电泳结 2 SDS-PAGE 果 图 中每孔上样量 银染 2 4 μL 泳道为母乳亲和层析前后的比较可观察到 2 4 4 泳道中高丰度蛋白有所减少而在具有相同上样体积 的情况下一些新的条带显现出来 图中左箭头标注 泳道中可观察到在 及 左右有明显的高 710 80 60 30 ku 酪蛋白 乳铁蛋白 分泌型 白蛋白 A B C IgA D 丰度蛋白洗脱下来 图3 Western-blot结果的比较 3(4 母乳双向电泳胶图 图 为母乳双向 电泳图谱 图 中考马斯亮蓝染 4 4 色 图中所 24 cm pH 3-10NL IPG 12 SDS-PAGE 标数字序号130蛋 白点为所鉴定蛋白点 图2 SDS-PAGE 电泳结果 图 中 为 为母乳 为母乳经孵育过 2 1 Marker 2 3 柱收集到的柱体积液 为洗涤液洗下的未与抗体结 4 合的母乳蛋白 去高丰度蛋白后的母乳5为洗脱液 管 为洗脱液 管 为洗脱液 管 为洗脱液 ? 6 ? 7 ? 8 ? 管 为洗脱液 管 为洗脱液 管 9 ? 10 ? 3(3 Western-blot法对免疫亲和层析的验证 图 为母乳免疫亲和层析前后的 结 3 Western-blot 果的比较 图 中 为母乳 为经免疫亲和层析除去 3 a b 高丰度蛋白的母乳箭头所指的显影条带均在亲和层 析后的样本中消失或减弱 图中 图 母 乳双向电泳图谱 4 1 酪蛋白分子量约为3040 ku[2] 箭头所指条带 正位于此分子量区 提示酪蛋白在一定程度上被去 3(5 母乳蛋白质谱鉴定 除 切取 个蛋白点 进行质谱鉴定有 个蛋白点的 30 29 乳铁蛋白分子量约为 [2] 箭头所指条带 肽 指纹谱在数据库中检索到蛋白如表 所示 2 79 ku 2 符合其分子量范围经亲和层析后条带消失但其 其中 号蛋白点鉴定为 结合蛋白 链其肽 27 VD A 下方约 处的条带也很清晰 由于这 组使用不 指纹谱见图 所示 数据库检索分值如图 所示 图 66 ku 4 5 6 6 同的抗体分别与转至膜上的蛋白结合 该条带在 中获 分大于 分有意义 4 93 66 P 005 年第 卷第 期总第 期 6 2009 37 1 2 18 Research Papers 研究报告 表 质谱鉴定结果 2 蛋白 匹配 NCBInr 蛋白名称 分子量 匹配 编号 分值 编号 ku 序列数 1 186 gi2104522 Lactoferrin Incomplete at NH2 end 53615 13 2 193 gi386855 Lactoferrin 31418 12 3 155 gi2104522 Lactoferrin Incomplete at NH2 end 53615 14 4 122 gi20151212 Chain B Crystal Structure Of A Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 9 N-Lobe Refined From A Merohedrally- Twinned Crystal Form 5 121 gi20151212 Chain B Crystal Structure Of A Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 9 N-Lobe Refined From A Merohedrally- Twinned Crystal Form 6 154 gi2104522 Lactoferrin Incomplete at NH2 end 53615 12 7 140 gi20151212 Chain B Crystal Structure of A Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 12 N-Lobe Refined From A Merohedrally- Twinned Crystal Form 8 149 gi386855 Lactoferrin 31418 11 9 159 gi640200 Lactoferrin Copper And Oxalate Form 77899 16 10 155 gi4699853 Chain A Structure of Human Apolactoferrin At 20 A Resolution 77941 17 11 130 gi2104522 Lactoferrin Incomplete at NH2 end 53615 9 12 113 gi4699853 Chain A Structure of Human Apolactoferrin At 20 A Resolution 77941 10 13 148 gi386855 lactoferrin 31418 12 14 53 gi119596519 NDRG family member 3 isoform CRA_e 18299 4 15 106 gi146387599 Chain A Solution Structure of Human Secretory Component 65388 8 16 243 gi178345 alloalbumin Venezia 71177 21 17 74 gi20151211 Chain A Crystal Structure of A Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 8 N-Lobe Refined From A Merohedrally- Twinned Crystal Form 18 164 gi28948741 Chain A Crystal Structure of Human Seminal Lactoferrin At 34 A Resolution 77928 16 19 94 gi453155 keratin 9 62178 11 20 106 gi4699853 Chain A Structure of Human Apolactoferrin At 20 A Resolution 77941 9 21 133 gi386855 lactoferrin 31418 9 23 79 gi20151211 Chain A Crystal Structure of A Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 7 N-Lobe Refined From A Merohedrally- Twinned Crystal Form 24 57 gi78101271 Chain C Human Complement Component C3c 40204 6 25 50 gi400044 Immunoglobulin J chain 16041 4 26 50 gi400044 Immunoglobulin J chain 16041 4 27 93 gi18655424 Chain A Crystallographic Analysis of The Human VD Binding Protein 52780 9 28 150 gi119626083 albumin isoform CRA_t [Homo sapiens] 60211 16 29 156 gi386855 lactoferrin 31418 10 30 84 gi2094891 Human Lactoferrin N-Terminal Lobe Mutant With Arg 121 Replaced By Glu R121e 37207 6 图6 27号蛋白点Mascot检索UniProt数据库横坐标为得分该蛋 图 号蛋白点肽指纹 横坐标 质量电荷比纵 坐标为峰值 白点获 分大于 分有意义 5 27 MZ 93 66 P 005 Vol37 No1 2009 total 218 7 研究报告Research Papers Of The Human Lactoferrin N-Lobe Refined From A 4 讨 论 Merohedrally - Twinned Crystal Form 9 号蛋白点为 本研究为去除母乳中高丰度蛋白实验方法的初 号蛋 Lactoferrin Copper And Oxalate Form 10 12 20 步探索建立了母乳多克隆抗体制备及纯化的技术路 白点为Chain A Structure Of Human Apolactoferrin At 线且证明使用这种混合蛋白抗原免疫动物所制备的 号蛋白点为 20 A Resolution 17 21 Chain A Crystal 复合性多克隆抗体能够较为有效地去除母乳中的高 Structure Of A Domain-Opened Mutant R121d Of 丰度蛋白并将去除高丰度蛋白的母乳样本利用蛋白 The Human Lactoferrin N -Lobe Refined From A 质组学技术平台进行研究对所获得的母乳双向电泳 Merohedrally- Twinned Crystal Form 18 号蛋白点为 图谱的部分蛋白质点鉴定发现了母乳中具有生物活 Chain A Crystal Structure Of Human Seminal Lacto- 性的蛋白 号蛋白点为 ferrin At 34 A Resolution 30 Human 早在 世纪 年代就有提取全脑组织的蛋白作 20 70 Lactoferrin N -Terminal Lobe Mutant With Arg 121 [8] 为混合抗原制备组织特异性抗体的报道 但并非为 Replaced By Glu R121e 初乳中含有大量的乳铁蛋 此目的而建立 显然抗体的生成受抗原的免疫原性 白及其片段在成熟乳中其成份明显减少 母乳喂 10 [5] 及免疫量等因素影响 母乳中主要含有酪蛋白分泌 养的婴幼儿的粪便和尿液中可检测出大量的乳铁蛋 型 乳铁蛋白及 乳白蛋白等 种高丰度蛋白已有 白片段 乳铁蛋白可抑制产毒的大肠埃希氏杆菌 IgA α 4 Es- 大量文献表明这 种蛋白都曾被制备出相应抗体证 4 cherichia coli 和弗氏志贺氏杆菌 Shigella flexneri 对肠 明了其免疫原性 且这 种高丰度蛋白在母乳中的质 道上皮吸附与侵袭在婴儿胃肠道发育抵抗病原体 4 量浓度均在100 mgdL以上能确保一定的免疫量 本 感染和损伤修复等方面有重要的生物学作用 在感染 研究通过Western-blot 法对免疫亲和层析效果进行验 早期 如病毒被吸收或扩散的阶段 部分乳铁蛋白在 证结果显示母乳经免疫亲和层析后这 种高丰度蛋 4 胃中的水解产 物可提高婴儿对单纯疱疹病毒巨细胞 白特异性显影条带均有减弱或消失提示所制备的抗 病毒HIV病毒等病毒的抵抗力乳铁蛋白还具有免疫 母乳复合性多克隆抗体中含有这 种高丰度蛋白的抗 调节活性可与细胞上的特异性受体结合使单核细 4 体通过免疫亲和层析可将高丰度蛋白去除 同时从 胞释放的白细胞介素1 IL-1 白细胞介素2 IL-2 白 图 可见 经免疫亲和层析后的母乳 电泳 2 SDS-PAGE 细胞介素6 IL-6 肿瘤坏死因子α TNF-α 及巨噬细 结果中看到新的蛋白条带显现出来提示低丰度蛋白 胞释放的前列腺素 减少 乳铁蛋白还可激活自然杀 E2 得到了富集 以上结果证明了该技术路线的可行性 伤细胞调节补体活性影响凝集素反应并可抑制由 但是也要考虑到抗体的产生是由抗原的免疫原性及 铁催化的过氧化物和过氧化氢形成羟基还可抑制脂 [9] 免疫量等因素决定的 虽然微量的低丰度蛋白产生 多糖介导的中性粒细胞的激活和内毒素诱导的细胞 抗体的可能性小且很难达到有效的效价仍不能排除 [211] 因子释放的过 程 有这些抗体存在的可能同时也会伴有其他蛋白的丢 免疫球蛋白及补体片段 和 号蛋白点 2 25 26 失 不过传统的方法从母乳中分离出各种蛋白成分 为组成分泌型 的单体 Immunoglobulin J chain IgA [12] [3] 分别免疫动物制备抗体再进行免疫亲和层析 也会 分泌型 可在婴儿的呼吸道 肠道和泌尿生殖道等 IgA 存在分离的抗原不纯多次洗脱过程中蛋白被稀释以 [2] 粘膜表面抵抗 病原体感染 15号蛋白点Chain A So- 及有价值蛋白丢失等问题 lution Structure Of Human Secretory Component 为构 通过以上去除母乳高丰度蛋白的策略对我们所 成分泌型 的分泌型片段 有研究表明其还以自由 IgA 获得的去除高丰度蛋白后的母乳进行蛋白质组学研 片段形式存在 通过研究其片段的三维空间结构揭 究在母乳样本的双向电泳技术上因样本高脂高盐 [13]