利福霉素B产生菌的推理选育及发酵工艺优化（可编辑）

利福霉素B产生菌的推理选育及发酵工艺优化（可编辑） 利福霉素B产生菌的推理选育及发酵工艺优化 浙江工业大学 硕士学位论文 利福霉素B产生菌的推理选育及发酵工艺优化 姓名:孟根水 申请学位级别:硕士 专业:生物化工 指导教师:裘娟萍 2002.4.1浙江业大学硕论文 利福霉素产生菌的推理选育 及发酵工艺的优化 摘要 利福霉素由地中海拟无枝酸菌.产生,在生物合成过程中受芳 香族氨基酸、利福霉素芳香前体抖的结构类似物及利福霉素的反馈调节。本 文根据利福霉素生物合成途径和代谢调节理论,对利福霉素的产生菌进行了 推理选育。出发菌种.。经次紫外诱变,再分别由.%的 色氨酸、.%.色氨酸、.%邻氨基苯甲酸和.%利福霉素进行药物耐受筛 选,并用自然分离的方法进行复筛,获得变株..,其摇瓶发酵 。单位达到/以上,比出发菌株?提高了%。 利用筛选到的菌种. .在发酵罐上按原发酵工艺进行发 酵时,发酵单位与出发菌种..相比没有相应提高,没能体现菌 种优势。为激发突变菌种的产利福霉素的潜力,进一步对发酵工艺进行优化。 ..一/ 一采用摇瓶和发酵罐进行利福霉素发酵,研究温度、溶氧、无机氮、巴 \ 比妥、磷酸盐、前体物质及补料方式对利福霉素发酵的影响。结果明控制 培 养温度。、溶氧%以上的条件下,在培养基中以。:。部分替代 ,,.%,采用流加补料工艺和补加前体工艺,利福霉素的发酵单 位较原工艺有明显提高,而巴比妥对利福霉素的生物合成没有促进作用。经 优 化后的生产工艺已成功应用到发酵罐中进行工业化生产,发酵单位达到 、 /以上,比原生产工艺提高了一倍以匕/ 关键词:利福霉素,推理选育,发酵工艺,浙江工业大学硕七论文、【??氏 . , . ,? .% .%..%..% ., . ? . , . ./,?. ? .. , . ? . , ,, ,.?,, .%, %.?.%. ./, , , 浙江业人学硕‘论文 第一章绪论 .课题背景 利福霉素是主要用于治疗结核病的一大类抗生素。众所周知,结核病曾是 一种可怕的疾病,在本世纪三、四十年代肆虐全球,严重危害人类健康,曾经 夺走许多人宝贵的生命,被称为十九世纪的巨大灾难。人们在与之作斗争的过 程中,先后发现了异烟肼、对氨基水杨酸、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等化学合成药 物以及氨基糖甙类、肽类抗生素。特别是利福霉素类抗生素中的利福平、利福 喷汀等的研制成功,使结核病的危害得到了很大的控制,这是抗痨事业的重大 胜利【”。 尽管如此,目前结核病仍是一大类常见病、多发病,尤其是近二十年来, 由于各国对结核病的忽视,使结核病在世界范围的流行重新加剧。全球/人 口约二十亿已经感染了结核病,现有结核病人万,每年新发现. 万,每年约万人死于结核病,结核病死亡达到历史最高水平,超过其他各 类传染病死亡人数的总和。年世界卫生组织宣布结核病为全球紧急病症, 官员宣称结核病菌仍是传染病中的“头号杀手”,尤其是在不发达的第三 世界各国发病率较高。中国结核病人数居世界第二位,仅次于印度,全国至 少亿以上人口感染了结核菌,有肺结核病人力.,其中具有传染性的病人 力,每年死于结核病的越力.多。随着结核病的卷土重来,有科学家警 告:“致命的抗药性结核病可能成为二十一世纪的新灾难”《新科学家》杂志 最 近发表文章说:“如果医生不能找到一种办法去对付抗药性结核病,那么十九 世 纪的这种灾难很可能会使二十一世纪陷入恐慌”?。 利福霉素是具有抗分枝菌活性的安莎霉素类 产生】,广泛应用 抗生素,由地中海拟无枝酸菌 于结核病、麻风病和与艾滋病有关的分枝菌感染的治疗】。在.发 酵液中有五种利福霉素组份、、、、,其中组份的酸性最强,性 质最稳定,容易分离,最易制得。组份经氧化、水解及还原即得利福霉素一 第一个用于临床的利福霉素类药物,因其口服后排泄太快,不易达到治疗所 需浙江丁业人学顺‘论文 的血药浓度,从而希望通过化学结构改造,合成出口服吸收好,排泄慢,能维 持血药浓度的半合成的衍生物,利福平就是其中较好的一种。 利福平是六十年代新发展起来的一种新型的抗结核菌的利 福霉素衍生物,具有广谱的抗菌作用,对结核杆菌、麻风杆菌和革兰氏阳性球 菌,特别是耐药性金黄色葡萄标菌,有很强的抗菌作用,对革兰氏阴性菌及 一些病毒也有一定的作用,副作用低,对那些用其他药物已产生耐药性的菌株, 以及对繁殖期和静止期的结核杆菌都有效。近几年随着临床应用推广,其用途 也不断扩大,除被广泛用于分枝杆菌感染的治疗,还用于治疗革兰氏阳性菌所 致胆道感染和脑膜炎球菌带菌者,也可用于治疗麻风病和沙眼。另外,利福 布汀在抗药性结核菌感染及治疗结核菌与艾滋病毒复合感染、利福昔明作为肠 道用药方面起了重要作用,已在全世界范围内广泛应用于临床。目前国内外下 在研制的较有希望的利福霉素新衍生物大约有十来个,而且利福霉素类抗生素 的研究仍然蓬勃发展,正向纵深推进?。 .本文研究内容 本课题是浙江医药股份有限公司新昌制药厂从瑞士气巴一嘉基引进的利福 霉 素国产化项目,瑞士气巴嘉基公司的利福霉素的生产水平代表着目前世界 最好水平。在本课题中,主要着重解决二个问题:一是菌种选育,解除利福霉 素生物合成中的反馈调节作用,提高菌种产单位能力;二是利福霉素生产 工艺国产化,利用获得的突变株,研究最佳的生产工艺条件,提高生产能力, 并进行工业化生产。浙江业人学硕‘论文 第二章文献综述 .利福霉素研究进展概述 利福霉素属于安莎类抗生素,由地中海拟无枝酸菌 产生【。在年意大利研究室首先从 法国南部的拉斐尔植物园的土壤中分离获得利福霉素产生菌【”,该菌株原名为 ,经等研究该菌的细胞壁 地中海链霉菌 组分,发现其水解物中含内消旋二氨基庚二酸并含阿拉伯糖,从而将它归属为 地中海诺卡氏菌 ,年经分类学家进一步研究, 更名为地中海拟无枝酸菌】。年等首次从地中海拟无枝酸菌发酵液中 分离得到利福霉素,它是第一个用于临床治疗的利福霉素。】。年 等确定了利福霉素的化学结构“,它是由一个芳香核的两个不相邻的位置通过 脂肪桥的联结,即一个发色基团和一条安莎链组成,并首先对这类抗 生素的命名,的工作有力地推动了这类抗生素的研究和不发。年第 一个半合成利福霉素药物??利福霉素应用于临床【。年等 首次发现了利福霉素的作用方式??特异性抑制细菌聚合酶畔,同时瑞士 一公司和意大利公司经过多年合作成功地合成了新的半合成 口服利福霉素??利福平,并广泛应用于结核病的临床治疗,与随 后陆续上市的利福定、利福喷汀等品种一起成为临床上 广泛使用的重要抗生素。年、和完成了安莎类抗生素 的典型代表??利福霉素的全合成,这是年代在天然产物合成化学领域中 取得的最大成就?。几个重要的利福霉素的结构式见图.。浙江丁业人学顺 ‘论文 喝 吼?一忙 图.儿种重要的利福霉素的结构 浙江业人学硕‘论文 .菌种 ..利福霉素的产生菌 产生,该 利福霉素主要由地中海拟分枝菌似 ,后又曾广泛称为地中海诺 菌原名为地中海链霉菌 卡氏菌 年经分类学家进一步研究,更名为地中 海拟分枝酸菌。地中海诺卡氏菌 经发酵可产生多种 活性物质,称为利福霉素,,,和,其中只有利福霉素的性质最稳定,应 用其阻断变株和形态变异株进行发酵,还能产生各种各样的利福霉素,如原 袢环霉 素、原利福霉素【“、利福霉素“】、【“”、”、、“、、和”, 后三者在位接上一个硫、位上的氧被氮替代形成噻唑环。 放线菌许多属的微生物也能产生利福霉素,如利福霉素可由诺卡氏菌. 、链霉菌或乳脂色马杜拉放线菌利福霉素变种产生,本人用白酒 生产出利福霉素,柴阳元 线链菌菌 雄分离得带颗粒链霉菌 ..该菌在含硫酸铁小 于.%的培养基中,主要产生颗粒霉素,如超过.%,则还产生利福霉 素和。用诱变方法获得地中海诺卡氏菌的阻断突变株。 发酵时产生利福霉素,直接从土壤中筛选出产生利福霉索或的地中海 诺卡氏菌亦有报道。后来发现许多小单孢菌能产生利福霉素或,如利福霉 ..发酵时能产生利福霉素,这 素小单孢菌 是小单孢菌能产生利福霉素的最早报道,年后又陆续发现椭圆小单孢菌. 能产生 发酵时能产生利福霉素,湖生小单孢菌 利福霉素、和一甲基一硫利福霉素,.、三种甲硫利福霉素衍生 物,由嗜赫小单孢菌 和它的黑色变种伽. 能产生有四种组份、、、的卤霉素,它们都有抗结核 分技杆菌和革兰氏阳性菌的活力其中卤霉素的结构和利福霉素仅位取代 基不同,经亚硝酸处理很容易转变为利福霉素。因此可以预见小单孢菌属的 许多种还将发现能产生一些新的利福霉素【】。 ..菌种选育浙江业人学硕‘论文 工业微生物的菌种选育在发酵工业中占有重要的地位,是决定该发酵产 品能否具有工业化生产价值及发酵过程成败与否的关键。现代发酵工业之所 以如此迅猛发展,除了发酵工艺有改进和发酵设备的更新之外,更重要的因 素是由于进行了菌种的选育和改良而为发酵工业提供了人类需要的各种类 型 的突变株。 自从年英国的首次发现青霉素,年和 成功应用于临床以来,短短几十年青霉素的研究和生产获得很大发展。 依靠菌种选育和工艺革新,青霉素的产生菌的生产能力从刚发现时的?单位/ 毫升到目前已达单位/毫升以上,比原始菌株的产量提高了上千倍。至于 其它抗生素,通过菌种选育都获得了很大提高】。 育种技术可分为自然分离、经典诱变育种技术和现代生物技术。在自然界 中,由于菌种基因自然突变的机率很小,而且突变往往导致菌种退化,符合生 产的突变非常难求,因此自然选育是比较缓慢和被动的过程。同时在自 然 分离过程中由于菌种的同源基因反复传代,易引起菌种遗传上的退化。因此自 然分离技术目前在工业生产中仅用于维持菌种的优良性状,达到纯化菌种、稳 定生产的目的,很少单独用于菌种选育。 经典的诱变育种技术包括物理因子:诱变、磁场处理、射线处理、 高温和激光处理等;化学因子:、、、等具有速度快、收 效大、方法简便等优点,是抗生素产生菌选育的一种主要方法,但诱变育种缺 乏定向性,比较盲从,育种周期长,工作量大。从年代末在经典育种的基础 上根据微生物遗传和代谢调节的理论发展了一种新的育种技术,实现人为的定 向控制育种,通过打破微生物调节机制,获得各种解除或绕过微生物正常代谢 途径的突变株,从而人为地使有用产物选择性的大量积累,并且在有控制的条 件培养,大量地生产这种有用的产物。使工业微生物育种展示了极为光明的前 景?。 随着现代生物技术的发展,将目的基因导入宿主菌,进行克隆和表达,从 而构建基因菌的报道已有不少,在?年期问瑞士的公司、意 大利研究所、莫斯科全苏抗生素研究所,以及中国、韩国和同本的几个 研究所已经对地中海拟无枝酸菌进行过遗传操作,使得利福霉素的产量提高 或可产生活性更高的利福霉素类及其衍生物。在年后,采用改进重组 浙江业人学硕论立 技术便于进一步对地中海拟无枝酸菌菌株的操作,达到菌种改良的目标。但基 因工程菌用于大规模工业生产的还为数不多,经典的诱变育种仍是目前最重要 的遗传育种手段,特别是对遗传背景不很清楚的对象,诱变育种更是必不可少。 对于抗生素生产厂家,理化因子诱变育种技术和原生质体融合技术是为提高抗 生素产量而经常采用的有效方法”。 需要发展重驵技术以利于进一步遗传操作 试图利,『:::???磊::::??????焉质粒并 探针分离山利福霉素 顺序性质和现存 识别其复制起点 生物合成基冈 基因文库识别利福霉素抗性厂??? 基冈 发展作为 转位于的分离 末成功 克隆载体 』 “ 被】于克隆利祸霉素 .。 生物合成基冈 进一步改良 进一步鉴别 平?操作较小的载体和有效的利福霉素生物合成 转化系统 基因的克隆和特征 为了突变而发 幽. 利福霉素产生菌地中海拟无枝酸菌遗传操作的研究现状 利用定向育种技术和基因重组技术,对利福霉素产生菌进行菌种选育已取 得重大成功,不仅大幅度提高了利福霉素的生产能力,而且获得了许多新的 利 福霉素。会玉坤等根据利福霉素的生物合成和调节特点,利用定向育种技 术,对地中海诺卡氏菌 .先采用超声波处理菌丝 浙江业人学坝‘论文 片段,经诱变处理后,再经.色氨酸、氯化铯以及利福霉素进行耐受 筛选,获得了解除利福霉素生物合成的关键前体物质.氨基一.羟基苯甲酸 ,合成中的色氨酸反馈调节、氨离子反馈调节以及利福霉素合成中解 除终产物反馈调节的高产菌株,产量提高%左右。金志华等利用诱变 处理. 一菌丝悬浮液后,再经芳香族氨基酸、、 作耐受处理,获得了利福霉素的高产菌株,产量提高%以上。 张益菜等对地中海诺卡氏菌 经亚硝基胍 .诱变,用谷氨酰胺的拮抗物一一谷胺酰肼进行筛选,获得消除谷氨酰 胺对谷氨酰胺合成酶的阻遏作用的变株,从而使利福霉素的产量有较大的提 高 。 等通过个地中海诺卡氏菌株一个产利福霉素、一个产利福霉 素进行种内基因重组,获得的重组体菌株一,能产生许多新的利福霉素, 其中以.羟基利福霉素活性最强,它抑制革兰氏阴性菌的活性比利福霉素 强【”。 等在研究巴比妥对地中海拟无枝酸菌的毒性与利福霉素生物合成 的关系时,筛选到巴比妥敏感菌株,其利福霉素的产量比亲株高一倍。 ..菌种保存 菌种生产能力的保持是菌种选育和抗生素生产中最重要的问题。抗生素产生 菌在不断的重复传代培养过程中,由于同源基因的不断复制,易引起菌种回 复 突变,产抗生素能力下降。因此要保持菌种的产抗能力,防止菌种退化,除了 进行不断的菌种选育,保持菌种的优良性状外,还要对优良菌种采用必要的保 藏手段。菌种保藏的基本原理是根据菌种的生理、生化的特点,创造条件使菌 种停止生长、不能进行代谢活动或代谢活动处于不活泼的状态,从而达到长时 间保存原有菌种的优良特性的目的。目前经常采用的菌种保存方法是低温冷冻 保藏如液氮保藏法和冷冻干燥法。这两种方法的保藏效果的好坏取决于使用适 当的孢子培养基、斜面的培养温度和培养时间、孢子的浓度及添加适当的保护 试剂。但这两种方法需要有真空干燥和冷藏设备,另外还需要保护剂,在工业 化生产中较少使用,一般仅用于菌种的长期保藏。国内在生产实践中,一般使 用沙土管法和低温冻结保藏法。前者效果较好,操作简便。保存期在一年以上;浙江下业人学硕‘论义 后者的优点是存活率高,变异率低,使用方便,如将利福霉素产生菌制备成冷 冻营养菌丝,保存在一。冰箱中九个月不降低产利福霉素的能力。 .利福霉素的遗传学研究 产生, 利福霉素主要由地中海拟分枝酸菌 等通过遗传重组得到了产生新利福霉素的菌株,所用亲株是从一始发菌 株. 得到的突变菌株。一亲株为一阻断突变株, 产生利福霉素;另一亲株本身为一重组菌株,为一多重标记菌株,产 生利福霉素,分离得到的重组菌除产生已知的利福霉素、、、、 和外,还产生七种新的利福霉素。对这种由重组过程产生生物合成能力的 增加,提出了两种可能的解释:遗传重组可激活沉默基因,如解除有效阻遏, 或加入活性启动因子;能大大增加胞内利福霉素前体的浓度。为了得到利福 霉 素遗传控制的基本信息,进行了阻断突变株之间的杂交。利福霉素生物合成 的最后三步是由染色体决定的,这些基因紧密连锁。两突变株转酮酶缺失 和芳香族氨基酸营养缺陷的初步连锁分析显示,这些基因与利福霉素 生物合成的三个基因不是紧密连锁的。 等通过测定.的序列定义了含个基因的 基因簇,其中一些参与利福霉素的生物合成,五个基因?组成的 基因簇编码型聚酮酶,戊二酰和甲基戊二酰是 肽链 延长的底物。一氨基.一羟基苯甲酸由其他几个利福霉素基因编码下 通过莽草酸途径产生,有两个活性中心,它的末端能选择性地将利福霉 素合成的起始单元一连到上,然后由引导产生的,在其催 化下进行环化而形成利福霉素】。 从利福霉素的产生菌.的甲基戊二酰变位酶基因的上 游区,克隆了约.的片段并测定了部分序列。密码子分析显示三个完整的 。在内,编码一个个氨基酸的多肽,而编码一 个氨基酸的多肽。它们编码天冬氨酸激酶:.和.亚基。下洲其起始密码 子与和的终止密码子重叠,为天冬氨酸半醛脱氢酶基因, 编码一个个氨基酸的鑫肽。构建了含基因或基因的亚克隆,这些基 浙江业人学硕一仑文 因在启动子下表达。两亚克隆能转化.和.一 成原养型。杂交表明约.序列区代表染色体的一连续片断。和 基因存在于.同一操纵子中【】。 .利福霉素的生物合成 ..利福霉素发色团合成机理 等研究发现利福霉素的结构由安莎链和发色基团组成。利福霉素的 发色团为一七碳氨单位,,,已鉴定为一氨基一一羟基苯甲酸 或其衍生物,起源于莽草酸途径““’,是合成利福霉素的一个关键前体。 等合成了【羧基一“卜.氨基.一羟基苯甲酸,并指出这种标记化合物能掺入 到安莎霉素 里去,和用不同的方法对地中海诺 卡氏菌产生的利福霉素进行研究获同样的结果,将一氨基一一羟基苯甲酸加 到变 株转酮醇酶营养缺陷型,与原株相比只产生%的利福霉素培养基中 能强烈刺激利福霉素的产生甚至可达到原株的水平“”】。 对于,的生源问题已有许多报道,等指出一脱氢奎宁酸或一脱 氢莽草酸是七碳氨单位,的最有可能的前体阱”。等认为磷酸烯醇式丙 酮酸和磷酸赤藓糖缩合形成.脱氧.一阿拉伯庚糖醛酸..磷酸,氨基一 环化和脱水形成.脱氧.一氨基一.脱氢莽草酸氨基.,氨基. 在合成酶作用下芳构化形成“。 应用代谢阻断突变株,用合成试验和添加前体试验及羧基标记”的.氨 基一.羟基苯甲酸证明】,氨基一一羟基苯甲酸是生物合成袢环霉素芳香环的 直接『体,先由葡萄糖形成赤藓糖..磷酸和磷酸烯醇丙酮酸,两者形成脱氧. 一 阿拉伯庚酮糖酸一一磷酸,然后可能通过三个途径形成一氨基.一羟基 苯甲酸。其中的来源于谷氨酰胺四。利福霉素发色团芳香核部分可能的生 物合成途径见图.圳 浙江业人学硕论文 岳。 :.。 泖伽\?“ /臣: ?。‘ 二 ? / \ / \ / \ ???,利福蚕:素 转氨作用,脱水作川,脱氢作,环化,脱水作用,芳构化 .一脱氢奎尼酸.一脱氢莽草酸.莽草酸?一氨基一脱氧一 图..山莽单酸途释的中问代谢物形成.氨基一一羟基苯甲酸 ..利福霉素安莎链的合成机理 等示踪实验已证明利福霉素的安莎链起源于乙酸、丙酸和甲硫氨 酸“”““】;由个丙酸盐单位和个乙酸盐单位缩合装配而成,但这些二碳、 三碳单位是如何进入利福霉素分子的机制却下直不清楚,等认为这些二 碳、三碳单位的产生和进入利福霉素分子的机制可能类似于长链脂肪酸的合 成 途径】,因此可以认为活化二碳、三碳单位乙酰、丙酰的形成是 利福霉内酯环合成的第一步。丙酸盐的真下的活化型是甲基丙二酰.,它由 葡萄糖代谢为丙酮酸,通过三羧酸循环或乙醛酸循环,再由琥珀酰一形成; 乙酸盐的真下的活化型是丙二酰一,它由葡萄糖形成乙酰一后再形成之暇 ,。,浙江业人学倾一论义. 利福霉素的合成 利福霉素的生物合成是从七碳氦单位开始的由两个乙酸单位和八个丙酸单 位在型聚酮酶的作用下的聚酮装配【】,氨基.一羟基苯甲酸是生物 合成利福霉素芳基部分“”的直接前体。.脱氧利福霉素 是利福霉素的~个直接的生物合成前体物质,利福霉素是第一个分离 到的利福霉素的前体,地中海拟无枝酸菌.合成利福霉素 后经修饰可生成各种利福霉素利福霉素、、、、、、、、、 、、、和吼 焦瑞身等应用非活性突变株之间的生化互补关系,并制定国产利福霉素的 生化互补图,将有助于进~步研究及阐明利福霉素的生物合成途径。利福霉素 生物合成先从形成.氨基..羟基苯甲酸开始,然后由.氨基一.羟基苯甲酰辅 酶 依顺序和丙酸盐和乙酸盐单位缩合,首先形成,.丙酸盐.乙酸 盐,?。之后,.缩合形成聚酮体型键,先形成原袢环霉素,原 利福霉素,进一步形成利福霉素。由此形成利福霉素和,最后通过修 饰利福霉素和,从而形成不同基团的最终产物『。浙江丁业人学顺‘论文 , 】 ?...........................。....., 【一 卜眦卜 【】一【鼢】 ?紫霉素 原袢环霉素?? 原利福霉 利福霉素??, 利福霉素; 利福霉素 利福霉素 利福霉素一利福霉素 利祸霉素 丙酸盐单位一甲基丙酰 乙酸盐单位一丙酰 图.以一氨基.一羟基苯甲酸作为前体,生物合成利福霉素的可能途径浙江业 人学坝:论文 .利福霉素的代谢调控 ..利福霉素生物合成的反馈调控 利福霉素属于安莎类抗生素,其结构由安莎链和发色基团组成。.氨基一 羟基苯甲酸,是利福霉素生物合成七碳起始单位的直接前体,来自莽草 酸途径。,的生物合成受三种末端芳香族氨基酸,,的调节,其 中色氨酸的抑制作用最强,苯丙氨酸和酪氨酸仅略有抑制作用,当三种氨基 酸 一起加入时,总的效应是三种单个氨基酸抑制作用的迭加。 .垒塑 墅鱼堕也塑:鱼塑盟 / / / / 耐/ 虫坐型坐 兰兰 研究表明芳香族化合物的作用部位是莽草酸途径第一个酶,即合成 酶:该酶不仅在芳香族氨基酸的生物合成中,而且在利福霉素生物合成中都 起着关键作用,芳香族氨基酸抑制该酶活性,从而抑制,和利福霉素的生物 合成。 利福霉素芳香前体,的结构类似物对氨基苯甲酸、对羟基 苯甲酸、邻氨基苯甲酸等对,的生物合成有抑制作用,尤 其是对羟基苯甲酸、邻氨基苯甲酸的抑制作用更为强烈,在 .%浓度下,几乎全部抑制了利福霉素的生物合成。 、 垒鲢垫 墅鱼坐鱼亟鱼塑盟. . 进一步研究表明,只有对合成酶有抑制作用,可能是是 浙江业人学坝‘论文 色氨酸生物合成的前体。利福霉素的生物合成过程中,利福霉素没有反馈调 节作用,但合成利福霉素的前体物质利福霉素对,的生物合成有反馈 抑制作用。对,生物合成大致过程和它的反馈调节见图. 图. 生物合成人致过程和它的反馈调竹 ..:磷酸赤藓糖::磷酸烯醇式丙酮酸;:脱氧.一阿拉伯庚松糖酸..磷 酸::脱氢垒尼酸;脱氢莽草酸;:莽草酸;:分枝酸 ..丙酸盐的调控 利福霉素的结构包括一个袢环发色团和一条安莎链,等用同位素示 踪研究发现利福霉素的安莎链由个乙酸单位和个丙酸单位缩合而成【】。经 研究表明,地中海拟无枝酸菌.进行丙酸盐代谢时有两条酶学 途径,即酰基合成酶系统、脂肪酸激活酶偶联酰基磷酸转移酶系统激活形 成丙酰,进而由丙酰羧化酶催化形成利福霉素合成前体一甲基 丙二酰,因而促进了利福霉素的合成。在两个丙酸盐激活酶系统中,丙酰 合成酶为组成型表达,而丙酸激酶/丙酰磷酸转移酶可由丙酸盐所诱导。丙 酸盐对丙酸激酶和丙酰磷酸转移酶活性的促进涉及到蛋白质的从头合成。过量 的氨赫存在时能阻遏丙酸盐激活酶系统以及利福霉素的合成,如果添加丙酸盐 由于促进了活化三碳单位的供应,可使受氨盐抑制的利福霉素的合成部分恢复。 浙江业人学硕:论文 张蔚文等研究发现,在添加丙酸盐的菌体在发酵早期生长较慢,这一生理 现象有利于利福霉素的生物合成,因为利福霉素主要在菌体生长的对数期合成, 有利于细胞将能源、碳和氮源更多地用于次级代谢。在地中海拟无枝酸菌 伪.合成利福霉素中,如果外源添加/的丙酸盐, 能提高产量%; 丙酸盐的加入时间对利福霉素的生物合成会产生不同的影响,过早加入, 丙酸盐将部分被用作细胞生长的碳源而消耗掉,加入太迟,由于激活丙酸的酶 系以及转化形成甲基丙二酰的酶系的比活力下降,从而对利福霉素生物合 成不产生影响。经研究表明,在利福霉素发酵中,加入丙酸盐的最佳时问是在 培养进行到小时左右。此时加入的丙酸盐大部分能作为次生代谢前体物质直 接转化为丙酰和甲基丙二酰而进入利福霉素分子中。丙酸盐促进利 福霉素合成的最佳作用浓度为.%,高浓度的丙酸枯则能抑制利 福霉素合成和菌比生长【】。 利福霉素的氨同化 氨对利福霉素及其大环内酯类抗生素生物合成的抑制已有不少报道,这种 现象称为氨阻遏。等和等认为加氨盐的抑制作用是减少细胞内短 链脂肪酸的供应。在初级代谢中被迅速利用的氮源特别是氨阻遏作用于含 氮底物的酶的合成,这类酶包括:亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、谷氨酸脱氢酶、 胞外蛋白酶等。 在利福霉素产生菌一菌体中具有丙氨酸脱氢酶/谷氨酸脱氢酶 和谷氨酰胺合成酶催化的氨同化途径,氨浓度的高低对这 两条途径起调节作用,当氨浓度增加,的活力就降低,活力升高, 不受氨的调节。倪榴英研究表明,利福霉素的合成同时受这两条氨同化途 径的调节,两个氨同化酶对利福霉的合成起着相反的作用,/ 的比值与利福霉素产量有下相关性【柚“】,这表明是利福霉素生物 合成中的关键酶。因此在利福霉素发酵过程中,尽管含。:。的培养基 中葡萄糖的利用要比含,的快得多,且.比,一更迅速被利用,所 形成的生物量也较多,但含,的培养基中利福霉素的产量要比含。 :。的高得多,这是由于在含。:。的培养基中较高的铵离子浓度明显 浙江业人学顾论义 阻遏利福霉素的产生,在含,的培养基中,从释放出束的铵浓度很低, 即使葡萄糖浓度高,也不致形成阻遏,则利福霉素的产量呈线性增长。 张蔚文等研究认为,氨对利福霉素合成的抑制位点之一可能是作用于丙酸 豁激活途径,进而影响了合成前体.甲基丙二酰的供应。这种抑制 作用能被添加丙酸盐所部分恢复,丙酸盐的加入能诱导被氨盐阻遏的丙酸激 酶、 丙酰磷酸转移酶的合成,将外源提供的丙酸盐激活为丙酰”。 ..硝酸盐的影响 硝酸盐促进抗生素的合成是一个较普遍的现象,不仅在利福霉素的发酵中 需添加硝酸钾,在林可霉素、卡那霉素、庆丰霉素等抗生素的发酵中,硝酸钾 也有较明显的促进作用四。 在利福霉素发酵中,硝酸盐含量与产量有一定的相关性,在地中海诺卡氏 菌?发酵中加入.%,时,发酵单位可达到对照不加, 的%,当硝酸盐浓度增加到.%时,可达%【“。 硝酸赫对地中海诺卡氏菌的代谢途径起着一种调节作用,可诱导硝酸盐还 原酶的形成,诱导期长,同时戊糖途径中的葡萄糖一一磷酸脱氢酶、。磷酸一 葡萄 糖脱氢酶、节果酸脱氢酶等酶活性相应的得到提高。同时硝酸盐能调控,促 进糖酵解途径、三羧酸循环、戊糖途径和莽草酸途径的一些酶的活力,降低 菌 丝体内的脂肪含量,为利福霉生物合成提供更多的前体物质’,这是由于硝酸 盐的存在,使琥珀酰转化为甲基二丙酰酶系甲基二丙酰变位 酶、甲基二丙酰消旋酶的活力提高。硝酸钾的加入能同时促进碳代谢和 氮代谢,即一方面调节碳的代谢朝着有利于为利福霉素多酮链合成提供前 体甲基二丙酰的方向进行,另一方面又调节氮代谢朝着有利于为芳香 环,提供氮原子的方向进行”’“。 焦瑞身等研究证明,在地中海诺卡氏菌?.?进行发酵 小时前加入硝酸钾可促进利福霉素产量的增加,同时使菌体生长减少,而 且产量的增加随加入时问的延迟而降低,进一步的研究证明,硝酸钾在利福霉 素生物合成中不仅仅是作为氮源,而且诱导利福霉素合成所需的酶系,其 作用不能为蛋白胨所能替代。氯霉素的存在使得硝酸盐不能再促进利福霉素的 合成,是由于氯霉素抑制了硝酸盐所诱导的酶系的合成。铵盐能阻遏硝酸还原浙江丁业人学硕‘论义 ”。 酶的合成,从而明显抵消硝酸盐对利福霉素合成的促进作用 ..溶氧对利福霉素生物合成的影响 在利福霉素发酵过程中,发酵至第三天后氧的溶解度有一低谷,如果在发 酵.小时时缺氧,会引起后期糖利用率的下降,将造成利福霉素低产;提 高发酵罐罐压,虽然可改善氧的传递,但是升高罐压又增加了二氧化碳的溶解 度,从而对菌丝产生毒性,会抑制利福霉素的产生。 表.罐压对利福霉索形成的影响 ..无机盐对利福霉素生物合成的影响 磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成份,还能强烈阻遏许多抗生素 的合成,已发现它对四环素类、氨基糖苷类、肽类和多烯大环内酯类等种抗 生素的生物合成产生阻遏作用。在利福霉素发酵过程中,如果在培养基中加 入 过量的磷酸盐,易形成大量无活性的利福霉素”。 巴比妥在利福霉素和蒽环类抗生素生物合成中能产生诱导作用, 等在早期研究中证实,培养基内加入/巴比妥,可使生产菌定向产生 利福霉素”,而不产生其它利福霉素,推测巴比妥的作用可能是抑制合成其他 的利福霉素、、、的酶系,但在利福霉素的发酵中不需要加入巴 比妥【。进一步的研究证实,在利福霉素发酵过程中,巴比妥只有在发酵早 期加入才能促进利福霉素的生物合成朝着利福霉素的方向进行,在小时 以后加入就不显示作用。 .利福霉素的发酵 工业化的利福霉素发酵主要有两条生产工艺,即利福霉素发酵和利福霉 素发酵,这两条生产工艺目前在国内都在生产。利福霉素的发酵是单相 的,即菌丝生长的同时合成产物”,发酵单位较高,发酵单位在/以 浙江业人学顾‘论文 上,但发酵液粘度高,不利于提取,而且在利福平合成过程中,反应步骤多, 收率低。利福霉素的发酵是两相的,即生长和产物合成不同步,发酵单位 低,在/左右,但发酵液粘度低,有利于提取,而且利福平合成步骤少, 收率高。目前国外采用的是利福霉素工艺,其中以瑞士气巴一嘉基公司的利 福 霉素的发酵水平代表世界最好水平,发酵单位在/左右;国内仅剩 两家企业在生产利福霉素,刚好代表着这两条生产工艺,沈阳抗生素厂进行 利 福霉素的生产,浙江医药股份有限公司新昌制药厂进行的是利福霉素的 生产,到目前为止,新昌制药厂的利福霉素经不断的菌种选育和工艺革新, 发酵单位有明显提高,已接近瑞士气巴.嘉基的生产水平。沈阳抗生素厂的利福 霉素经不断的工艺改进和菌种选育,发酵单位也有长足提高,已达到/ 左右。 最近有报道利用玻璃纤维对地中海拟无枝酸菌 进行细胞固定化发酵生产利福霉素和,但尚未应用到工业 化生产中”。 .抑菌机制 利福霉素类抗菌素的主要生物活性是对革兰氏阳性菌和结核分枝杆菌有抑 制作用。有些半合成衍生物对革兰氏阴性菌也有中等活性。利福霉素是 指导的聚合酶的潜在抑制剂,能阻断所有细胞的合成, 但是大多数利福霉素对哺乳动物的聚合酶是无效的,仅对病原体具有选择 性的毒性,因此是一类毒性低、疗效好的广谱抗生素。在晦床上主要用于治疗 结核病,同时对革兰氏阳性菌、麻疯杆菌、鸟分枝杆菌和肺炎球菌的感染也有 疗效旧】。浙江业人学顾‘论文 参考文献 国家经济贸易委员会医药司,“十五”及年医药科技发展规划背景资料汇编, 年.. 【】马海战,陈峥.抗结核药物联合应对耐多药结核分枝杆菌的体外抗菌效力, 年 中国药学会学术年会论文集,. . . 【】 .,:. 、. ~, .,:. 】周家惠.利福霉素生物合成的进展,国外医药抗生素分册?,:】. .,?: , , 【 . : . . . ,:. .. , 【】 ,.,:? ., , 】 ..,:? 【】郭伽刑福霉素的全合成.国外医药抗生素分册,,:? 【】 ..,:? . , , 【】 .,:. 【】陈代杰.微生物药物学,华东理:人学出版社,,. , . . 【.., 、:, ,】 浙江业人学硕。论文.,:.. . , , 【】 ., ,,: . , , , . 【】. .,: , , .. 【】 . , .,:? 施巧琴,吴松刚编著.业微生物育种学,福建科技出版社。. 【加千虹秋,刘桂杰,刘雪慧.经典遗传育种在国内医药生产中的一些应,中国医药‘ 业杂忠,,: 【】方金瑞,黄维真.利福霉素产生菌地中海拟枝酸菌的遗传操作,国外医药抗生素分 册,,:. 【】金玉坤,熊宗贵,白秀峰.利福霉素产生菌的推理选育,中国抗生素杂忠,; 。 【金忐华,张国钧,金一平等.利福霉素产生菌~地中海诺膏氏菌的推理选育,中 国抗生素杂志,;.。 【】】张益藜,金忠坤,焦瑞身.地中海诺氏菌谷氮酰肼抗性菌株的选育与力复霉素 产耸的提高,抗生素,;: . , , 【】 . .,:? 【】.廖福荣.巴比妥对地中海拟无枝酸菌的生欧毒性及其与利福霉素的超产 的关系。 国外医药抗生素分册,:. 【】俞文利杨纪根航生素‘艺学,辽宁::业出版社,, . ,【】.. .,: 浙江业人学硕论文 . , 。 .?...,: ., , 【】 ..,:. , . , 【】 ?..:? , . : 【 【且】 ..,:? 【】 ” , , . 【】..,: 【】吕淑君,江丽频译.地中海诺膏氏菌利福霉素发色团的生物合成,国外医 药抗生素 分册,,:?, , 【 . : .,:? , 【】 , , . 一一 . .,: , ,【】 ; , ? . , 【】 ? . ? ?..,:. . , ,. 浙江业大学硕论义 ? ‘ ? ..,: / 【倪榴英刘慈俊金志坤焦瑞身等.力复霉素合成与谷氨酰胺合成酶活力的止 相关 性,微生物学报,,,. , , .【】: 张蔚文,焦瑞身.丙酸盐对利福霉素生物合成的调控,中国抗生素杂 ,基.;: 顾微玲,夏天辉,焦瑞身.芳香途径终产物和中间体对力复霉素生物合成的调 仃作用,微生物学报,,:., 【】 . . .;: 倪榴英,焦瑞身.儿种氮化合物对地中海诺氏凶一氨同化酶的影响,抗生素, ,. ., ,【 .,: . 【.廖福荣.地中海诺膏菌的菌丝形态特征与产生利福霉素的定嚣分析,国外 医约抗 生素分册,,:? 合成力 【】焦瑞身,陈津美,吴梦淦,顾薇玲等.地中海诺氏菌 复霉素代谢调节的研究.硝酸盐对地中海诺氏菌合成力复霉素的促进作,植 物生理学报,,, 【熊宗贵,白秀峰.抗生索生物合成控制的进展,抗生素,;: 合成力复 【陈津美,顾薇玲,于武,焦瑞身等.地中海诺氏菌 霉素代谢词,的研究.硝酸盐对地中海诺氏菌代谢途径的调节,植物生理学 报。 .:, :,, 】. .,. , ,】..,: . 浙江业人学坝十论文 第三章利福霉素产生菌的推理选育 月 吾 菌种选育在抗生素工业生产中的地位越来越重要。抗生素产量和质量的不 断提高,是由于在菌种选育、发酵和提炼等三个方面不断取得进展的结果, 但 其中菌种选育的作用是主要的、根本的。菌种选育的目的是改良已知菌种或 生 产菌株的特性,使其符合工业生产的要求。 本文根据利福霉素生物合成途径和代谢调节理论,对利福霉素的产生 茵地中海拟无枝酸菌进行推理选育,以望获得高产菌株而大幅提高利福霉索 的发酵单位。 .和方法 ..出发菌株 地中海拟无枝酸菌 .,由浙江医药股份有 限公司新昌制药厂提供,该菌已经多次诱变处理。 ..培养基 、斜面培养基% 酵母抽提物.,麦芽抽提物.,葡萄糖.,燕麦片.,琼脂. 、种子瓶培养基% 淀粉.,葡萄糖.,黄豆饼粉.,蛋白胨.,.,。., . 、发酵瓶培养基% 葡萄糖.,蛋白胨.,黄豆饼粉.,鱼粉.,巴比妥钠.,., ., /,消泡剂. ., 、平板培养基 采用高氏号培养基浙江丁业人学顾论文 ..培养条件 、平板培养条件 培养温度?,相对湿度?%,培养周期. 、斜面培养条件 培养温度?,相对湿度?%,培养周期? 、种子瓶培养条件 培养温度。,装量/么,摇床转速,培养时间? 、发酵瓶培养条件 培养温度。,装量/么,摇床转速,接种量%,培养时 『白 ? ..分析方法 、还原糖的测定 采用菲林试剂法 见附录一 、氨基氮的测定 采用甲醛法【 见附录二 、的测定 见附录三 用计测定 、菌丝浓度的测定 用离心沉降法 见附录四 、利福霉素的效价测定 用分光光度法测定 见附录五 ..诱变处理 加入无菌水于.?新鲜斜面培养物,用接种铲将菌 丝刮下,用玻璃珠打碎成菌丝碎片,经一层滤纸过滤,制成菌丝悬浮液。吸取 上述菌丝悬浮液于无菌培养皿中,置于波长为、功率的紫外灯 直下处不盖、震荡照射。 ..药物平板的制备 所用药物为一色氨酸、邻氨基苯甲酸、利福霉素钠盐。浙江丁业人学坝‘论 文 先将不含药物的培养基倒入培养皿中,平放,待凝固后再倒入含 药物的培养基,平放,凝固后即得含药物平板。药物耐性变株从含药物平板中 分离得到。 ..仪器设备与试剂 一型计上海雷磁仪器厂 分光光度计上海分析仪器厂 一旋转摇瓶机四川长征制药厂 ?离心机??上海手术器械厂 色氨酸上海康达氨基酸厂 邻氨基苯甲酸??中国医药集团上海化学试剂公司 利福霉素钠盐??. .实验结果与讨论 ..紫外诱变剂量选择 经不同剂量的紫外线诱变处理菌丝悬浮液经适当稀释后分别涂布于不含药物 的平板培养基上,每批菌丝悬浮液涂布三只平板,平板培养后计数存活菌落数, 以不经诱变的平板菌落数为对照,计算诱变致死率,结果见表. .. . 表.紫外诱变对.的致死率 从表.可以看出,随着紫外线处理时间的延长,菌体的致死率随之上升, 照射时达到%,到时达到%。根据文献报道,在紫外线、射线等 诱变效应的研究发现,经诱变处理后菌体的正突变较多地出现在偏低的剂量中, 而负突变则较多地出现在偏多剂量中,同时经多次诱变而提高产量的菌株中, 更容易出现负变,因此在诱变育种工作中比较倾向于采用较低的剂量,特别是 对于多次诱变后的高产菌株的育种更是如此,如紫外线作诱变剂时常采用杀菌 率为?%的相对剂量【。故在本实验中选用诱变时间为。浙江丁业大学顾:论 文 .一色氨酸耐受菌株的筛选 根据文献报道,色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等三种芳香族氨基酸对利福霉 素的生物合成有明显的抑制作用,其机制是芳香族氨基酸对莽草酸途径中的 一脱氧一.阿拉伯庚酮糖酸一一磷酸合成酶具有反馈抑制,影响了莽草 酸途径中莽草酸前的中间体的合成,从而影响了一氨基.一羟基苯甲酸, 的生物合成。,是利福霉素生物合成的起始前体物质,芳香族氨基酸通过 抑制,的生物合成,从而影响利福霉素的生物合成。在几个芳香氨基酸中, 以色氨酸的抑制作用最强,苯丙氨酸和酪氨酸仅略有抑制作用。根据利福霉 素生物合成和调节机理,通过诱变育种,筛选.色氨酸的耐受变株,能获得 解除,生物合成中的反馈调节作用的高产菌株,从而大幅提高利福霉素的 发酵产量。 以地中海拟无枝酸菌 ?为出发菌株,经紫外诱变 处理后,适当稀释,然后分别涂布于含不同色氨酸浓度的药物平板上。平板培 养结果见表 .. . 表..在药物平板上的生长情况 药物浓度% . . . . . . 菌落生状况菌落生长时间 平板培养结果发现,随着药物浓度的提高,药物的抑菌作用也随之加强, 当色氨酸浓度超过.%时,即使菌丝悬浮液不稀释也很少长出菌落。 选择含.%一色氨酸的平板培养基上,筛选色氨酸的耐受变株,以诱 变和不经诱变的菌丝也分别稀释涂布于不含药物的平板上作为对照,每个稀 释 度的菌丝悬浮液各涂稚三只平板下同。待平板菌落生长成熟后,从以上各组 平板中各选取个菌落形态较好、菌丝半壮、颜色较深的单菌落移接斜面,斜 面培养好后逐一接种母瓶,培养天左右后每个母瓶转接三只发酵瓶,培养 天后放瓶测定利福霉素的效价,取三只发酵瓶的平均值,比较三者的产利福 霉素的能力,结果见表.浙江业人学颁:论文 .. , 表.自然分离株、紫外诱变株和.色氮酸耐受变株的产单位能力的比较 巳堡垒坚垡堑 鱼 壁 生堕. 型??:望里里 垒 表.结果可以发现,色氨酸耐受菌株的发酵效价明显要高于自然分离菌 株和紫外诱变菌株,其中得到的耐色氨酸的变株?的发酵效价要比出发菌 株提高了%。 以筛选到的菌株?为出发菌株,经紫外诱变处理,适当稀释后分别涂 句于含.%色氨酸平板培养基上,进行色氨酸的耐受菌株的进一步筛选。平板 经培养后分别选个菌落形念较好的单菌落传接斜面,斜面培养好后经摇瓶二 级发酵后测定利福霉素的效价,结果见表. ..表.不同浓度的色氨酸耐受变株的产单位能力的比较 璺竺曼垒韭墅 垒塾曼坠.% 堕?堂:塑哑 盟 从表.可以发现,耐.%色氨酸的变株产利福霉素的能力比耐.%色 氨酸的变株更好,其中在.%色氨酸药物平板中筛选到的一株色氨酸耐性变 株、的发酵单位比?提高%。 ..邻氨基苯甲酸耐性变株的筛选 在利福霉索生物合成过程中,菌体在合成利福霉素合成的关键前体物 质一氨基一一羟基苯甲酸 的同时,也合成了一些的结构类似 物、、,这三种物质对的生物合成有反馈调节作用,机理 可能是酶促反应中底物的结构类似物的竞争性抑制,其中以邻氨基苯甲酸 的抑制作用最为严重,同时是形成色氨酸的体物,对合成酶也有反浙江业人 学硕:论立 馈调节作用?。以为筛选剂筛选耐受菌株,可能能部分解除结构 类似物的竞争性抑制,从而提高利福霉素的发酵单位。 以菌株?为出发菌株,经紫外诱变处理后适当稀释,然后涂御在含.% 邻氨基苯甲酸的平板培养基上,经诱变和不经诱变的菌丝也分别稀 释涂布于不含药物的平板上作为对照,进行邻氨基苯甲酸的耐性变株的 筛选。在培养好的平板中各选取个菌落形态较好的单菌落传接斜面,斜面培 养好后,经摇瓶二级发酵后测定利福霉索的效价,取三只发酵瓶的平均值, 结果见表. .. .表.自然分离株、紫外诱变株和耐受变株的产单位能力的比较 塑鲤 塑壁 堑墼堕 .% 表.结果表明,的耐性变株能提高菌种的产利福霉素的能力,其 中筛选到一变株.,其产单位能力比?提高%。同时还发现,. 经紫外诱变后所挑选到的单菌落中有部分产单位能力下降,可能是由于紫外 诱 变引起菌种发生回复突变。 为防止菌种发生回复突变,确保菌株的遗传稳定性,对变株?进行 自然分离,并得到菌株?,其发酵单位比.又提高了%。这一现 象可能是诱变的延迟效应引起的。 ..利福霉素耐性变株的筛选 在利福霉素的生物合成过程中,利福霉素是利福霉素合成的前体, 其中利福霉素对利福霉素生物合成的关键前体物质一氨基一一羟基体甲酸 ,的生物合成有反馈调节作用【】。筛选利福霉素耐性变株,有可能获得 解除利福霉素反馈调节的突变株。 以菌株?为出发菌株,先进行紫外诱变,经适当稀释,然后涂布在浙江丁业人 学硕‘论文 含不同浓度的利福霉素钠盐平板中进行耐受筛选,以诱变和不经诱变 的菌丝也分别稀释涂布于不含药物的平板上作为对照。菌落在药物平板上的 生 长情况见表. .. .表..在药物平扳上的生情况 . . . 药物浓度% 菌落生长状况 堕垄尘垦堕里虫 ; 平板培养后发现当利福霉素钠盐浓度达到.%时,平板中的菌落很小, 而且颜色发白,传接斜面后,菌丝质量极差。故选择含.%利福霉素钠盐 的平板中挑选单菌落传接斜面,斜面培养好后逐一接种母瓶,培养天左右后, 每个母瓶转接三只发酵瓶,放瓶后测定利福霉素的效价,取三只发酵瓶的平 均值,比较三者的产利福霉素的能力,结果见表. .. , 表.自然分离株、紫外诱变株平利福霉素耐受变株的产单位能力的比较 墅 塑坠垒 躔 监坠 一 .% 从表.可以发现,利福霉素耐性变株的效价要高于自然分离株和紫外 诱变株,其中分离获得的利福霉素耐受变株?的发酵单位比出发菌株 ?要高%。 对利福霉素耐性变株.进行自然分离,获得一菌株.,发酵 单位又提高了.%。 ..传代稳定性试验 诱变产生的突变株在培养过程中,往往会发生回复突变,从而使突变株失去 优良性能。用群体传代的方法考察变株. ?斜面传代稳定性, 对经推理选育获得的变株?在斜面上连续传接五代,每一代斜面都进行摇 瓶二级发酵,每代斜面菌种传接三只发酵瓶,放瓶后测利福霉素的效价,每 浙江业人学顾:论文 一代的平均发酵效价见表. . ..表.菌株. .的传代稳定性 盟驶型坐 从表中可以看出,菌种. .经五代斜面传接后,生产能 .的遗传特性比较 力没有明显下降,说明经诱变获得的菌种. 稳定。 ..菌种. ?摇瓶试验 将诱变获得的菌株?的斜面,移种摇瓶进行二级发酵,每隔取 只摇瓶,测定还原糖、、、菌丝浓度、发酵单位,取三只瓶的平均值, 画成曲线图,见图.。 从图.的代谢曲线中可以发现, . 菌种?的菌体生长与单位合成不同步,在菌体生长的对数期基 本不合成利福霉素,而在稳定期则开始大量合成利福霉素。这 与文献报道不同。 . 随着菌体生长进入稳定期,糖、氮消耗加快,利福霉素开始大量 合成,因此在进行工业化生产时,应该在该段时间开始进行补料以 提供菌体生长和利福霉素合成所需的养份。 . 发酵后期,随着上升,氨基氮的回升,菌体合成利福霉素办 随之减慢,表明菌体已老化,开始自溶,发酵过程到达终点。因此 可以根据发酵液的变化来判断问隙发酵的进程和终点。浙江业人学硕‘论文 . . 主 毛 . ..舌 盆 ; 盲 羞 三山 . ? .. ;; ;; 图.菌种.的摇瓶发酵浙江丁业人学硕.论文 .小结 根据利福霉素生物合成途径和代谢