溶菌酶活力的简易测定
碧l魏最嚣蛰CHINADAIRYINDUSTRY
溶菌酶活力的简易测定
李德海,迟玉杰
(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨150030)
摘要:对溶菌酶的测定方法进行了改进,简化了读数方法
250U/mL范围内有良好的线性关系,反应底物无需用茵粉制成,
该方法与常规方法相比较无显着差异(P<0.01).
关键词:溶菌酶;酶活力;简易测定
对底物悬液进行了适当处理.本方法在酶活性为50,
读数只需
第l5s和第75s的OD.值.结果
明,
中图分类号:TS201.25文献标识码:A文章编号:100l一2230(2002)05—0l28—02
Facilitydetectionoflysozymeactivity
LIDe—hai,CHIYu-jie
(FoodCollege,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)
Abstract:Thisexperimentimprovethemeasuremethodoflysozyme,predigestthereadingm
ethod,opporitetreatingtothe
substrate.Whentheenzymaticactivityisattherangeof50to250U/mL,thismethodhasgoodli
nearconnection.Thesubstrateis
notmadefrombacteriumpowderandonlyreadingthevalueof0D450at15Sand75S.Theresul
tshowsthatthismethodisnotsig—
nificant(P<0.01)comparingwithroutinemethod. Keywords:lysozyme;enzymaticactivity;facilitydetection 0引言
溶菌酶是一种糖苷水解酶,作用于N一乙酰氨基葡萄糖
和N一乙酰胞壁酸之问的b-1,4键,能使某些细菌细胞壁中
的粘多糖成分分解,因而具有溶菌能力.在食品工业中,溶
菌酶可以作婴儿食品的添加剂,以增强婴儿的免疫力.也可 以加入到饮料,糕点,肉类制品中,作为防腐剂以延长产品 货架期.在医学上,溶菌酶是有效的消炎剂,与抗菌素合用 可以用来治疗口腔和鼻腔粘膜发炎,且对人体无任何毒副作 用,具有良好的医疗效果和广阔的应用前景. 因而近年来,溶菌酶的生产得到飞速的发展,工业化规 模不断扩大.但在生产过程中,溶菌酶活力测定的复杂性始 终与其工业化生产不相符合.本文参考以往报道溶菌酶测 定方法繁琐之处.简化了菌悬液的制备,读数的方法,得到 了一种适合工业化生产的简易方法.
1材料与方法
收稿日期:2002—06—15
作者简介:李德海(1976一)男,硕士研究生,从事食品 化学研究.
2o02年第3.卷第5期(总第l5.期)
1.1材料与仪器
溶菌酶标准品,活力为18000U/mL(上海生物工程有限 公司);
溶壁微球菌(中国科学院微生物研究所);
磷酸盐缓冲液(自己配制);
751分光光度计(上海第三
仪器厂);
研钵(东北农业大学食品学院提供);
微量进样器(东北农业大学食品学院提供). 1.2试验方法
1.2.1底物的制备
为了证明本试验采用方法的可行性,所以与常规测定溶 菌酶活力时底物制备进行了比较,常规的方法所用底物为直 接购买的标准菌粉或按标准方法自制的菌粉. (1)常规方法底物的制备.菌粉由本试验室按标准方法
自制,然后取一定量菌粉加入少量浓度为0.1mol/L磷酸盐 缓冲液(pH=6.24),置于灭菌研钵内2min,倾出并稀释,至 悬液吸光度值(450nm)在1.3左右.
(2)简易方法底物的制备.采用直接收获液体菌体,添 加保护剂,冰箱中冷冻保存使用时解冻的方法1.冰浴解 冻的菌液,置于灭菌研钵中研磨20min,同样调吸光度值在
1.3左右.
1.2.2标准酶液的制备
称取l0mg溶菌酶标样溶于1mL浓度为0.1mol/L磷酸 盐缓冲液中(pH=6.24);然后依次稀释酶为50,75,100, 125,150,175,200,225,250U/mL. 1.2.3酶活力测定
吸取底物悬液2.5mL置于比色皿中,光径1cm,测定 OD.值.此时为零时读数,然后加入标准酶液0.5mL,迅速 摇匀,从加入酶液起计时,每隔15s测1次OD.,共测6次;空 白值用浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=6.24). 1.2.4酶活力计算
酶活力单位的定义:每分钟OD.值下降0.001为一个活 力单位,那么每毫克溶菌酶的活力单位u为
AOD45o
0.001×样品量
式中:?OD.为450am处75S时的吸光值与15S时的吸光 值的差;样品量为每0.5mL标准酶液中含溶菌酶的毫克数. 2结果与讨论
常规方法的结果见表1;简易方法的结果见表2. 表1标准酶浓度,吸光度差值和测定值之间的关系 O.O23
O.036
0.O46
O.O56
O.O67
O.O8O
O.o910
O.1Ol
O.1l2
表2标准酶浓度,吸光度差值和测定值之间的关系 O.O23
0.035
0.047
0.057
O.O67
0.081
O.O95
0.1O2
O.1l2
表3为两种方法的回归分析结果.表3表明,简易方法和 常规方法的回归曲线均可作为标准酶活曲线,酶活
限均为 50,250U/mL,方法灵敏;酶活测定值均为18000U/mL左 右,测定准确.
表3两种方法相关性和回归分析结果s
2.2讨论
2.2.1底物的处理
该方法使用的溶壁微球菌悬液体系是一个不均匀体系, 由菌体颗粒和缓冲液组成的固一液相分布体系不稳定.这些 因素导致菌体和酶液不能充分接触和反应,致使结果不稳 定.因此在使用菌体之前,要经研钵充分研磨,尽量使固一 液相分布体系均匀稳定,以减少对测定结果的影响. 2.2.2读数方法的确定
在以往文献报道中,都是每隔1min,0.5min甚至15S
记录1次结果,但本实验由于底物悬液的不均匀性,从加入 酶液到第15S时吸光度下降极为迅速,误差较大,另外90S 以后菌体和酶液已经大量减少而更不能充分接触,反应,更 加不稳定,记录结果无较大意义.因此取第15s和第75S之 间的差值,这样便简化了读数范围.
3结论
实验结果表明,该简易方法优点是溶壁微球菌无需制成
冻干粉,直接加保护剂置于普通冰箱冷冻格冷冻.读数时只 需记录第15S和第75S时结果即可.此方法适合测定溶菌酶 活力,更适合工业化生产溶菌酶时测定活力.
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