国标-》%b4质+粪大肠菌群的测定——多管发酵法

国标-》%b4质+粪大肠菌群的测定——多管发酵法 ICSl3(060(50 Z 16 SL 行业中华人民共和国水利 水质粪大肠菌群的测定 多管发酵法 multi——tube of Water quality——Determination fecal coliform groupzymotechnique 2007—05—02实施 2007—02—02发布 中华人民共和国水利部发布 中华人民共和国水利部 关于批准发布水利行业标准的公告 2007年第l号 中华人民共和国水利部批准以下12项标准为水利行业标准，现予以公布。 二oo七年二月二日 I 序号 标准编号 发布日期 标准名称实施11期替代标准号 1 SL 沙棘原果汁 353--2006 2007(02(02 2007(05(02 2SL 354 20062007(02(022007(05(02水质初级生产力测定——“黑白瓶”测定法 3 SL 355---2006 2007(02(02 2007(05(02 水质粪大肠菌群的测定——多管发酵法 140--2006 4 SL SLl40 97 2007(02(022007(05(02 水泵模型及装置模型验收试验规程 5 小型水电站建设项目建议书编制规程 356—2006 SL 2007(02(02 2007(05(02 6 SL 357—2006 2007(02(02 2007(05，02 农村水电站可行性研究编制规程 7 358--2006 SL 2007(02(022007(05(02农村水电站施工环境保护导则 359--2006 8 SL 2007(02(022007(05(02水利水电工程环境保护概估算编制规程 9 SL 360一-2006 2007(02(022007(05(02 地下水监测站建设技术 10 SL 361—2006 2007(02(02 2007(05(02 大坝观测仪器位移计 2006 11 SI。362 2007(02(02 2007(05。02 大坝观测仪器测斜仪 12 SI。363--2006 2007 02(022007(05(02大坝观测仪器锚杆测力计 ? SL 355—2006 目 次 ??? 前言 ’ ’ ’ (((( ((( ? ---? ???1 1范围 ? ? ((( (((((( (((((((- ???? -??-??1 2方法原理 ? ‘ 一1-(( ( -?? -? ? 3试验条件与环境 ? ? ((( (( ( ((( (((??? -???((1 4仪器设备 ?? ?? ’ ((( -(( ((-( (-- ? ? ---????“1 5培养基 ? ? ((( (( ???? ???????????? ???-?? 2 6革兰氏染色试剂 ‘‘ ? -?????????? ???? ??? -???????? ”3 7试验步骤 ????? ((((((((((((((((????????????????? -???-?????????????48结果计算 ?? ??? ( ( ? ???????? ? ?-- ??? 49 ?? ? 一 ? SL 355—2006 刖 吾 本标准是根据中华人民 共和国水利部技术标准编制工作计划安排进行制定的。本标准的体例格式遵循GB,T 1(1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》 的规定。 本标准的主要内容包括:范围、方法原理、试验条件与环境、仪器设备、培养基、革兰氏染色试 剂、试验步骤、结果计算及注意事项。 本标准批准部门:中华人民共和国水利部。 本标准由水利部水文局提出并归口。 本标准 主持机构:水利部水文局。 本标准解释单 位:水利部水文局。 本标准主编单位:北京 市水文总站。本标准出版、发行单位:中国水利水电出版社。 本标准主要起草 本标准审查会议人:秦斌、王建厅、高俊杰、冯伶亲、武佃卫。 技术负责人:齐文启。 本标准体例格式审查人:曹阳。 ? SL 355—2006 水质 粪大肠菌群的测定——多管发酵法 1范围 本标准规定了水中粪大肠菌群的多管发酵测定方 法。本标准适用于地表水、地下水、生活饮用水等，特别是浑浊度高的水中粪大肠菌群的测定。 2方法原理 用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开。在 44(5"C仍能生 长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。 3试验条件与环境 19489 试验环境应符合《实验室生物安全通用要求》(GB 2004)要求，试验过程要在无菌条 件下进行。 4仪器设备 4(1显微镜 4(2高压蒸汽灭菌器 4(3干热灭菌箱 oC) 4(4恒温培养箱(37?--+l 4(5恒温培养箱(44(5。C--+0(2?) 4(6玻璃器皿(需置于干热灭菌箱中，160?灭菌2h) 包括: 试管、平皿(9cm)、锥形瓶、刻度吸管、倒管等。 4(7接种针、载玻片等 4(8酒精灯 4(9紫外灭菌灯 4(10 pH计 5培养基 5(1乳糖蛋白胨培养液 5(1(1成分 蛋白 胨:109 牛 肉膏:39乳糖:59 氯化钠:59 1(6,溴甲酚紫乙醇溶液:1mL 蒸馏水:1000mL 5(1(2制备方法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000mL蒸馏水中加热溶解，pH值调整为 7(2,7(4，再 加入lmL 1(6,溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器中， 115"(2灭菌20min，储存于冷暗处备用。 1 SL 355—2006 按5(1中乳糖蛋白胨培养液组成，蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯5(2浓乳糖蛋白胨培养液 化钠的3倍用量配制。 5(3 EC培养液 5(3(1成分 胰蛋白 胨:209 乳 糖:593号胆盐或混合胆盐:1(59 磷酸二氢磷酸氢二钾:49 氯化钠:59 蒸钾:1(59 馏水:1000mL5(3(2制备方法 将5(3(1中各成分加热溶解于蒸馏水中，pH值调整为6(9?0(2，然后分装于带 有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器，115?高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。 5(4伊红美蓝琼脂培养基 5(4(1成分 蛋白胨: 109 乳糖:109 磷酸氢二钾:29(琼脂:20,309 蒸馏水:1000mL 2,伊红水溶液:20mL 0(5,美蓝水溶液:13mL 5(4(2储备培养基的制备 先将琼脂加至900mL蒸馏水，加热溶解，然后加人磷酸氢二钾及蛋白胨， 混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000mL，pH值调整为7(2,7(4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀 后定量分装于锥形瓶内，置高压蒸汽灭菌器中，1150C灭菌20min，储存于冷暗处备用。5(4(3平皿培养基的配制 将按5(4(2制备的储备培养基加热融化，无菌操作，根据锥形瓶内培养基 的容量，用灭菌吸管按 比例分别吸取已灭菌的2,伊红水溶液和0(5,美蓝水溶液，加入已融化的储备培养基内，并充分混 匀‘防止产生气泡)，待其冷却至44(5"C后立即将此种培养基适量倾人于已灭菌的空平皿内，待其冷 却凝固后，倒置于冰箱内备用。 6革兰氏染色试剂 6(1染色液 结晶紫溶液:结晶紫乙醇饱和溶液(取结晶紫约4,89，溶于95,乙醇100mL 中)20mL，1,草酸铵溶液80mL，将两种溶液混合，过滤。 6(2助染剂 碘:19 碘化钾:29 蒸 馏水:300mL 将碘与碘化钾先行混合，加入少许蒸馏水，充分振摇，待完全溶解后再加入其余的蒸馏水，当溶 液由棕黄色变为淡黄色时即应弃取。 2 355—2006 SL 6(3脱色剂 95,乙醇。 6(4复染剂 沙 黄:0(259 95,乙醇:10mL 蒸馏水:90mL 将沙黄溶于乙醇中，待完全溶解 后加入蒸馏水。 7试验步骤 7(1水样的采集和保存 7(1(1水样的采集 采样瓶使用500mL已灭菌的磨口玻璃塞广口瓶，采集水样时，应避免瓶盖及 瓶子颈部受杂菌污染。 灭菌后的采样瓶2周内未使用，需重新灭 菌。 7(1(2水样的保存 采集好的水样需放置约4?冷藏设备内保存运输。一般要求在 采集4h内测定。 7(2水样接种量 7(2(1生活饮用水 接种水样总量300mL:在2个装有已灭菌50mL浓乳糖蛋白胨培养液的大试管或锥形瓶中(内有 倒管)，以无菌操作各加入水样lOOmL;在lo支装有已灭菌5mL浓乳糖蛋白胨培养液的试管中(内 有倒管)，以无菌操作各加入水样lOmL。 7(2(2受到不同程度污染的水 将水样充分混匀后，根据水样污染程度确定水样接种量。每个水样至少用3个不同的水样量接 种。同一接种量要有5管。 未受污染的水样接种量为lOmL、1mL、0(1mL。受污染水样接种量应根据污染程度加大稀释 度，可接种1mL、0(1mL、0(OlmL或接种0(1mL、0(OlmL、0(001mL等。 如果体积为lOmL，则试管内应装有浓乳糖蛋白胨培养液5mL;如接种量不多于lmL，则可接种 于乳糖蛋白胨培养液lOmL中。使用的水样量可参考表1。 表1接种用水量参考表 接种量(mL) 水样种类 2 3 l 0(1 10101010‘ 10—510—6 较清洁水 ? ? ? 一般污染水 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 严重污染水 以接种水样量lOmL、1mL、0(1mL为例: 于各装有5mL浓乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内 有倒管)，以无菌操作各加入lOmL水样;于各装有lOmL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，以无菌操作各加入1mL水样;于各装 有lOml。乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，以无菌操作各加入lmL 1:10稀释水样。共 计15管，3个稀释度。 7(3初发酵试验 将已接种的水样混匀后置于37"C恒温内培养24h士2h。产气和产酸的发酵管表明试 验阳性。如果 3 SL(355—2006 倒管产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升 起的为阳性。7(4复发酵试验 轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到 EC培养液中， 在44(5?恒温培养24h土2h，培养后立即观察，发酵管产气表明确信试验阳性。 7(5平板分离 将产气发酵管接种于伊红美蓝培养基上，置44(5 6C培养18,24h，凡出现下列特征的典型菌落， 证实为粪大肠菌群阳性: ——深紫黑色，具有金属光泽的菌落; 一紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落; ——淡紫黑色，中心色较深的菌落。 挑取菌落的一小部分进行涂片，革兰氏染色，显微镜下镜检。 8结果计算 8(1以7(2(1为水样接种量，根据试管有粪大肠菌群存在的阳性管数查表2，报告每升水样中的粪 大肠菌群数。 表2粪大肠菌群检数表 lOOmL水量的阳性管(瓶)数 1lOmL水量的阳性管数 每1L水样中粪大肠菌群数 每1L水样中粪大肠菌群数 每1L水样中粪大肠菌群数 0 11 <3 8 18 2 7 1327 3 1l 1838 142452 5 70 92 7 120 43 8 31 51 161 9 36 60 230 40 69 >230 注:接种水样总量300raL，其中2份100mL、10份10mL。 8(2以7(2(2为水样接种量，根据试管有粪大肠菌群存在的阳性管数查表3，报告每lOOmL水样中 的粪大肠菌群数。 如果接种的水样量不是lOmL、lmL、0(1mL，而是较低或较高的3个浓度的水样量，也可根据 粪大肠菌群最可能数检数表，按照3个浓度阳性管数，查表3求得粪大肠菌群最可能数(MPN指 数)，再经式(1)换算成每lOOmL的粪大肠菌群最可能值(MPN值): MPN=MPN指数×翻罹曝 ?，lO(1)习(mFL)丽 报告1L水样粪大肠菌群数，MPN值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群数。 9注意事项 9(1水样在采集、运输、保存、测定过程中应不受污染。 4 355—2006 SL 衰3粪大肠菌群最可能数(MPNj检数裹 出现阳性份散 出现阳性份数 每100mL水样中粪大肠 每lOOmL水样中粪大肠 菌群数的最可能数 菌群数的最可能散lOmL管 1mL管 0(1mL管 】OmL管 1mL管 0(1mL管 1 2 O <2 4 26 1 3 27 1 3 2 4 l 23 1 4 l 34 1 1 4 1 6 33 1 2 6 5 1 46 2 5 2 63 2 1 2 1 5 70 2 1 5 2 2 5 3 5 3 l】0 12 8 3 5 3 140 3 1 5 3 3 3 11 130 1 14 】 1 l 5 170 2 14 5 2 220 3 2 1 5 4 3 280 3 17 5 350 4 13 5 5 240 1 17 5 5 1 350 7 l 17 5 5 2 540 2】 4 1 5 5 920 1 2 26 5 4 1600 22 5 5 2 ?2400 注:接种水样总量55(5mL，其中5份lOmL、5份1mL、5份0(1m1(。 9(2试验过程中所用玻璃器皿均应要求无菌。 9(3带菌培养基应灭菌后再弃去，其他遵守实验室安全。 9(4检验开始前应充分振摇混合水样，以保证粪大肠菌群数量的准确性。 9(5对于荇染严重的水样，为了保证在接种后得到一个合适范围的阳性结果，应设置不少于4个的 连续稀释度;当4个连续稀释度的最低管或全部呈现阳性，应加大稀释度。 9(6若复发酵试验阳性结果明显，平板分离试验可以省略。 5