二羟基维生素D3和维生素K2联合诱导HL-60细胞分化及凋亡的研究

二羟基维生素D3和维生素K2联合诱导HL-60细胞分化及凋亡的研究 二羟基维生素D3和维生素K2联合诱导 HL-60细胞分化及凋亡的研究 l临床血液学杂志2005年5月第18卷第塑 ? 实验研究? 1,25一二羟基维生素D3和维生素K2联合诱导 HL一60细胞分化及凋亡的研究 任立红曲辉李钰冯玉芝刘晓阳 * [摘要]目的:研究1,25一二羟基维生素D.[1,25(OH)zD.,简称D.]与维生素K2(VK2)联合应用对HL一60 细胞分化及凋亡的影响.方法:通过四唑氮蓝(MTT)比色,细胞形态,流式细胞仪(FCM)测定细胞周期,凋亡率 及CD14的表达,观察D.,VK对HL一60细胞的影响.结果:D.与VKz都能抑制HL一60细胞增殖,并且联合使 用抑制作用显着.10,mol/LD.与10ttmol/LVK联合处理HL一60细胞72h后CD14的表达率为63.15,且 G./G期细胞显着增多,与单独一种比较差异有统计学意义 (P<0.05).10ttmol/L,20ttmol/LVK作用于 HL-60细胞72h凋亡率分别为11.31%,2O.36,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);而10ttmol/L vK与10,mol/LD.联用72h细胞的凋亡率为5.41,与对照组比较差异无统计学意义(P>O.05).结论: D.与VK联合使用可以使D.诱导分化作用加强,而VK诱导凋亡作用受到抑制. [关键词]细胞分化;细胞凋亡;1,25一二羟基维生素D.;维生素K;细胞株HL一60 [中图分类号]R329.2[文献标识码]A[文章编号]1004—2806(2005)03一O171一O4 Differentiationandapoptosisinducedby1.25_dihydroxyvitamin DcombinedwithvitaminK2inHL-60cells RENLihongQUHuiLIFENGzhiLIUXiaoyang (DepartmentofPediatrics,theSecondClinicalCollege,HarbinMedicalUniversity,Harbin, 150086,China;DepartmentofBiologyandTechnology,HarbinTechnologyUniversity) Abstract0bjective:Tostudytheeffectsof1,25一 dihydroxyvitaminD3(D3)combinedwithvitaminK2(VK2) ondifferentiationandapoptosisofhumanacutepromylocyticleukemia(APL)celllineHL一 60.Method:Weexam— inedthegrowthofcellsbyMTTassay.andobservedthechangesofmorphologicfeaturesofthecells.Cellcycle, CD14expressionandapoptosisofthecellsweredetectedbyflowcytometry.Conclusion:AfterexposingtoD3and VK,,thecellsproliferationwereinhibitedandtheeffectwasmoresignificantbycombinedthem.Exposedto10 mol/LD3andVK2togetherfor72h,theexpressionofCD14is63.15.G0/a1cellarrest,whicharemorenota— blethanD3orVK2alone.Therateofcellapoptosisinducedby10ttmol/Land20ttmol/LVK2isl1.31, 2O.36,respectively,whichhadsignificantdifferencecomparedwithcontrolgroup.However,therateofapop— tosisinducedbycombinationof10, mol/LD3and10/,mol/LVK2is5.41,whichshowednodifferencecom— paredwithcontrolgroup.Result:D3combinedwithVK2couldinereasetheeffectsofVD3ininduingdifferentia— tion,buttheeffectofVK2ininducingcellapoptosiswasinhibited. KeywordsCelldifferentiation;1,25一 dihydroxyvitaminD3;VitaminK2;Cellapoptosis;Cellline,HL一60 1,25一二羟基维生素D.[1,25(OH)D.,简称 D.]是除维甲酸(RA)以外的另一种有前途的肿瘤 细胞诱导分化剂.但就目前的应用情况而言,由于 D.易引起高钙血症等副作用,其治疗白血病等恶 性肿瘤的效果并不理想,为增强疗效,降低毒副作 用,合成高效低毒的衍生物或与其他药物联用是值 得探讨的解决问题的方法.维生素K(VK)是2一甲 基一1,4萘醌衍生物的通称,具有凝血活性,又称为 凝血维生素,其除止血作用外,也具有抗肿瘤活 性.本实验探讨小剂量D.与小剂量VK联合 应用对HL一60细胞的生长,分化及凋亡的影响. 黑龙江省卫生厅项目(NO:D9931) 哈尔滨医科大学第二临床医学院儿内科(哈尔滨,150086) 哈尔滨工业大学生命科学与系 通讯作者:曲辉E-mail:fdquhui@163.com 1材料与方法 1.1细胞培养 HL-60细胞购白天津血研所,用含10胎牛 血清的RPMI一1640培养基,在5CO,37?,饱和 湿度的培养箱中培养,细胞悬浮生长,每2,3d传 代1次. 1.2药物和试剂 1,25(OH)D.为Sigma公司产品,用无水乙 醇配成浓度为10mol/L的贮存液,一20?避光保 存,用前以培养基稀释,使终浓度为10一mol/L, 10一mol/L.VK为Sigma公司产品,用无水乙醇 配成浓度为10mol/L的贮存液,一20?避光保 存,用前以培养基稀释,使终浓度为10/,mol/L,20 /,mol/L.乙醇体积分数低于0.1,试验表明该浓 度对HL-60细胞的生长没有影响.FITC—CD14为 ? 172? 美国BD公司产品,MTT为Sigma公司产品. 1.3实验分组及用药方法 取对数生长期细胞,按2×10./L接种于6孔 培养板中培养.共分6组,每组3孔.1组为空白 对照组,加等量无水乙醇,终浓度的体积小于 0.1;2,3组分别加终浓度为10,mol/LD3,10 mol/LD;4,5组分别加终浓度为10ttmol/L VK2,2O"mol/LVK2;6组加终浓度为10tool/L D.与10ttmol/IVK2.置于'5C02,37.C,饱和 湿度的培养箱中培养. 1.4观察细胞的生长状态 取对数生长期细胞,以1×10./L接种于96孔 板,根据实验要求加入不同药物共200td,平行3 个复孔,置于CO培养箱中培养.每24h检测1 次,于每次检测前4h每孔加入MTT溶液(5g/L) 20l,37?继续孵育4h,然后终止培养.离心,弃 上清,每孔加入15OtdDMSO,充分溶解结晶物,而 后选择492nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔 光吸收值,记录结果.同时锥虫蓝染色观察细胞活 力. 1.5细胞形态学检测 将药物处理72h的HL-60细胞取1ml细胞 悬液离心涂片,自然凉干后用Wright—Giemsa染色 10min,在光学显微镜下观察细胞形态的变化. 1.6细胞凋亡及细胞周期动力学检测 分别离心收集药物作用24h,48h,72h的细 胞,以70的乙醇固定,4?保存.测定前将标本用 PBS洗涤3次,RNA酶(1g/L)消化15min (37.C),碘化丙锭(PI,5Omg/L)DNA染色30 min,然后用流式细胞仪检测,计算凋亡细胞的百分 率,72h组同期测细胞周期. 1.7细胞表面标记CD14的检测 离心收集药物处理72h的细胞,调整细胞的 密度为5×10./L,取2份细胞悬液各100l,分别 加入10l的FITC偶联的CD14,轻微混匀后水浴 3Orain,再加入400tdPBS溶液,流式细胞仪检测. 1.8统计学处理 所有试验结果均重复3次,SPSS软件处理,采 用方差. JournalofClinicalHematology.May2005.Vol18No3 2结果 2.1不同浓度D.,VK作用不同时间对HL一6O细 胞生长的影响 D及VK对HL一6O细胞都有生长抑制作用, 呈时间与剂量依赖性,且药物联用组比两者在相同 剂量单独应用的生长抑制作用更明显(P<0.05), 同时锥虫蓝染色表明各组较少出现死细胞.说明 D.与VK联用对HL一6O细胞增殖有更显着的抑 制作用(表1). 2.2形态学改变 HL一60细胞经10一mol/ID.作用72h后细 胞形态向单核细胞分化:细胞形态不规则,核浆比 变小,细胞核由圆形变为肾型,马蹄形等,可有折 叠,染色质疏松,细胞质可见颗粒.HL一6O细胞经 10,20~mol/LVK作用72h后,部分细胞呈现典 型凋亡细胞特征:细胞缩小,核染色质凝聚,断裂, 胞浆内出现空泡等.药物联用组细胞形态与10 mol/LD.组细胞形态相似,细胞也向单核细胞分 化. 2.3细胞表面标记CD14的表达的检测 CD14是成熟单核细胞的表面抗原之一,随 着细胞的分化其表达逐渐升高,检测CD14的表达 情况可反映细胞向单核细胞分化的程度.本实验 结果表明,10一mol/LD.作用72h后,30.98的 细胞CD14表达阳性,与对照组比较P<0.01,而 10_.mol/LD3,10~mol/LVK2CD14的表达与对照 组比较差异无统计学意义.药物联合组CD14的 表达率为63.15,与10一mol/LD.比较P< 0.01.说明两者的联用使诱导细胞分化的功能得 到了加强(见表2). 2.4细胞周期的检测 经D.,VK作用72h后,各组G./G期细胞 数较对照组显着增高(P<0.01),各组S期显着下 降(P<0.01),尤以D.加K组显着,而不同浓度 之间并无差别(见表3).各组G./G期增多,S期 减少,说明细胞增殖阻抑于G./G期. 2.5FCM检测细胞凋亡 波峰在G期峰前出现的峰为亚G凋亡峰. 表11,2S(on):D和VK2对HL一60细胞生长的影响A,?S 与空白对照组比较"P<O.05,P<O.01;"与D3加VK2组比较P<O.05 临床血液学杂志2005年5月第18卷第3期 D3组凋亡峰不明显,而10/lmol/L,2O/lmol/L VK:作用于HL一60细胞24h,48h,72h均有凋亡 峰出现,并呈现时间与剂量依赖性(见表4). 表2l.25(OH)和VKz对HL一60细胞 作用72h后CD14表达的影响 组别CD14表达阳性率/ 空白对照组 10,mol/LD3组 10_.tool/LD3组 10/lmol/LVK2组 20~mol/LVK2组 10,mol/LD3加10/~mol/LVK2组 2.23?O.8O 11.37?1.16 30.98?3.77 2.88?O.56 5.58?1.O2 63.15?8.35" "与空白对照组比较P<0.01;与D.加VK组比较 P<0.01 表31,25(OH1D,和VK对HL-60细胞周期的影响 ,?S "与空白对照组比较P<0.01;.与D.加VK组比较 P<0.01 表41.25(OH):I)3和VK:对HL一60细胞凋亡的影响 ,;?S 与空白对照组比较"Pd0.05,Pd0.01;与20~mol/ LVK2组比较P<0.05;P<0.01 3讨论 1,25(OH)D.不仅有维持体内钙离子稳定, 还具有诱导细胞分化,抑制细胞增殖,调节某些原 癌基因表达以及免疫调节等功能,尤其对造血及有 些白血病细胞的调节和诱导分化具有重要作用. ? 173? 体外试验证明,1,25(OH)D.作为诱导分化剂可 以诱导HL一60细胞向粒一单核细胞分化.近几年来 VK的抗肿瘤活性日益受到重视,研究发现VKz的 止血作用较弱,而具有较强的抗肿瘤活性,可以抑 制肿瘤细胞增殖及诱导细胞发生凋亡,并且诱导凋 亡的功能受到抑制时,能诱导细胞向单核细胞分 化H.此外,当VK与其他抗肿瘤药物联用时还 能增强其药物的作用.本实验将小剂量D3与 小剂量VK联合应用观察对HL一60细胞的生长, 分化及凋亡的影响,以探讨药物联合使用的作用机 制. 本实验结果显示:D.与VK联合作用于HL一 60细胞,各组观察指标(如细胞增殖,细胞形态,CD 14表达,除凋亡率外)较单独D.与VK组作用显 着:细胞的增殖显着受到抑制,细胞形态明显向单 核细胞分化,CD14表达显着升高.说明较小剂量 的D.与VK联合可达到或超过较大剂量D.,VK 的单独作用效果,二者联用使D.的有效浓度降低 90. D3与VK.联用时,可以更显着的诱导HL一60 细胞向单核细胞分化,但两者联用时VK诱导凋 亡的作用却受到抑制.推测I)3可能在VK诱导 凋亡的过程中起抑制作用,诱导细胞凋亡与分化是 通过不同的作用途径实现的.关于联合作用加强 细胞生物学活性的机制还有待于进一步的研究,推 测可能为:?细胞周期的调控:各试验组G./G期 增多,S期减少,说明细胞增殖阻抑于G./G期. 细胞阻抑于G./G期,不仅是细胞增殖受抑制的机 制,也可以认为是细胞发生分化的机制之一;?阻 碍细胞凋亡的发生,促进细胞分化:VK可激活 caspase3等凋亡因子的活性,而1,25(OH)2D3抑 制caspase3等凋亡因子的活性";?1,25 (OH)zD.,VKz与维生素受体(如维生素D受体, 推测VK也有受体,但目前还没有发现)结合及特 殊转录因子的分子调节,促进靶基因的表达引起各 种生物效应. 药物联用可以降低用药浓度,减少毒副作用的 产生,提高肿瘤细胞对药物的敏感性.因此,小剂 量抗肿瘤药物的联用是一种值得探讨的治疗途径. 参考文献 1NishikawaY,CarrBI,WangM,eta1.Growthinhibi— tionofhepatomacellsinducedbyvitaminKanditsana— logs,JBiolChem,1995,270:28304—28310. 2GoyertSM,FerreroE,RettingWJ,eta1.TheCD14 monoeytedifferentiationantigenmapstOaregionenco— dinggrowthfactorsandeceptors.Science,1998,239: 497—500. 3JarnjesSY,WilllansMA,KelseySM,eta1.Therole ofvitaminDderivativesandretlnoidsinthediffPrPntia— ?174? tionofhumanleukeamiacells.BiochemPharmacol, 1997,54:625—634. JournalofClinicalHematology.May2005, kemia,l997,l1:779—787. 6FunatoK.MiyazawaK,YaguchiM,eta1.Combina— tionof22一oxa一1,25一dihydroxyvitaminD3,avitaminD3 derivative,withvitaminK2(VK2)synergisticaUyen— hancescelldifferentiationbutsuppressesVK2一inducing apoptosisinHL-60cells 1527. (收稿日期:2004—04—31) 慢性淋巴细胞白血病伴血清IgG-~:型M蛋白增高1例 郑智茵沈建平陈均法彭来君周郁鸿虞荣喜 [关键词]白血病,淋巴细胞性,慢性;血清M蛋白;IgG-~型 [中图分类号]R733.72[文献标志码]D[文章编号] 患者,男,67岁.因反复右上腹疼痛伴腰背酸 痛半年余,于2002年5月7日收住我院外科.体 检:皮肤巩膜无黄染,全身浅表淋巴结无肿大,心肺 (一),右上腹压痛,反跳痛(+),肝肋下未及,脾肋 下1.5cm,肝区叩痛(?).血常规:Hb65g/L, WBC21.1×1O./L,L0.809,PLT145×10/L. ESR140mm/h.肝功能示:血清球蛋白94.7g/L, 白蛋白24.3g/L,余正常.胸片:双肺纹理增多. 腹部B超:肝囊肿,胆囊结石,脾肿大.上腹部CT (平扫加增强):肝内多发小囊肿,胆囊炎伴多发结 石,脾脏增大.予抗生素治疗后上腹部疼痛消失, 为进一步诊治于5月18日转入血液科.骨髓涂片 示:有核细胞增生活跃,粒系占0.125,红系占 0.075,粒红两系增生低下,形态大致正常,成熟红 细胞呈明显缗线样排列.淋巴细胞增生明显活跃 占0.745,以成熟小淋巴细胞为主,幼稚淋巴细胞占 0.025.巨核细胞19个/片,其中产板巨核细胞8 个,血小板数量正常.浆细胞易见占0.05,为成熟 浆细胞.外周血单个核细胞免疫分型:CDI9, CD2O,CD22,CD23阳性;CD2,CD3,CD4,CD5, CD7,CD8,CD1O,CD38,CD56阴性.血清免疫球 蛋白测定:IgA0.59g/L,IgG107.6g/L,IgM 0.86g/L,Jc型轻链71.0g/L,型轻链1.74g/L. 血清免疫电泳示:IgG单株峰,G亚型,.c型轻链. 尿轻链蛋白测定:Jc型0.16g/L,型d0.05g/L. 血钙,血磷正常.甲胎蛋白(一).头颅正侧位片, 骨盆平片检查无骨质破坏和骨质稀疏.核素骨扫 描(ECT):全身骨骼放射性分布左右前后均匀对 .诊断为:?慢性淋巴细胞白血病 称,未见异常 .浙江省中医院血液科(杭州,310006) 浙江省中医院检验科 (CLL)伴血清IgG一.c型M蛋白增高,尿.c型轻链增 高;?胆囊炎,胆石症.于5月23日行血浆置换 术,术后予瘤可宁(6mg/d)和泼尼松(15mg/d)口 服治疗.6月21日复查血常规:Hb88g/L,WBC 9.4×10./L,中性粒细胞占0.43,淋巴细胞占0.49, PLT174×10./L;血清IgG62.2g/L,IgM0.75g/ L,IgA0.55g/L.尿Jc型轻链阴性.于2002年6 月25日出院.出院后在外院就诊,间断服用瘤可 宁(2,6mg/d)和泼尼松(5,10mg/d).因经济困 难,放弃治疗已8个月,目前仍存活. 讨论本例末梢血和骨髓涂片检查符合CLL, 淋巴细胞免疫表型为成熟B细胞性,但CD5阴性, 与典型的CD5阳性的B—CLL不符.据文献报道在 B—CLL中,95以上的病例其淋巴细胞表达CD5 抗原,仅有7,2O的病例为CD5阴性.不少学 者认为存在CD5阴性的B—CLL(CD5一B—CLL),并 把它归为是B—CLL的亚型或变异型.本例经仔细 检查基本排除了多发性骨髓瘤及其他慢性B细胞 系统白血病,因此诊断为CD5一B—CLL.本例在病 程中仅有脾肿大,而没有淋巴结肿大,亦与文献所 报道的CD5一B—CLL的常见临床特征相符. CLL伴血清单克隆免疫球蛋白(M蛋白)增高 约占5,M蛋白以IgM为多见,一部分为IgG和 IgA,M蛋白增高的原因不明.Fu等(1978年)早 就观察到:B—CLL的B细胞在与正常T细胞共培 养后能产生免疫球蛋白,提示CLL的部分B细胞 也能分化到某种阶段,从而对来自正常T细胞的辅助信号产生应答.Hansen等(1994年)认为B— CLL患者伴有血清单克隆IgG说明CLL的B细胞 能够进一步分化及进行重链类别的转换. (收稿日期:2004一O6—2O) ?l呈,一,,一,一一一一,.ma.,nU1"K?.m.一..n??协m.??,,,一:薹 一,.,K_蚕l耋m,?Yrm一_主,一一一一一一一一,,一,一一,,一,,