缺血缺氧新生儿鼠脑蛋白激酶C活性的研究

缺血缺氧新生儿鼠脑蛋白激酶C活性的研究 缺血缺氧新生儿鼠脑蛋白激酶C活性的研 究 ? 222?中华围产医堂苤蠢2002年9月第5卷第3期ChinJPerinatMed.Sept.2002Vol5,No.3 注射液治疗HIE有确切疗效.本研究观察了新生鼠HIBD在 丹参治疗过程中F—VEP潜伏期的改变,结果发现丹参治疗 12h后F—VEP潜伏期较对照组明显缩短,说明使用F—VEP 对HIBD进行疗效监测灵敏可靠,为今后临床HIE疗效评价 及病情监护提供了客观可靠的理论依据. 参考文献 1RiceJE3rd,VannucciRC,BrierleyJB.Theinfluenceofimma— turityonhypoxic-ischemicbraindamageintherat.AnnNeurol, 1981,9:131—141. 2SilverS,KapitulnikJ.SohmerH.Postnataldevelopmentof flashvisualevokedpotentialsinthejaundicedGunnrat.Pediatr Ras,1991,30:469. 3MercuriE.Visualfunctioninfull—terminfantswithhypoxic—is— chemiaencephalopathy.Neuropediatrics,1997,28:I55—161. (收稿日期:2001—03—09) (本文编辑:徐福兰) 缺血缺氧新生鼠脑蛋白激酶C活性的研究 王华韩玉昆吴保敏 本研究通过缺氧缺血性脑损伤(HIBI)动物模型,动态观 察HI后蛋白激酶(PKC)的活性变化,试图阐明PKC在HIBI 中的作用. 一 ,材料和 1.HIBI动物模型建立:按既往实验方法进行_1]. 2.PKC测定:取待测新生鼠样品常规分离出细胞浆和 细胞膜,取皮质,海马胞浆及三硝基甲苯(Triton)X—i00处理 的胞膜蛋白样品各2O1(相当于0.5mg蛋白),分别加入含 有0.5mol三羟甲基氨基甲烷一盐酸(Tris—HC1)缓冲液,pH 值7.5,25mmol/L氯化镁,12.5mmol/L氯化钙,0.1%磷 脂酰丝氨酸,2%二脂酰甘油,0.25mmol/L冷三磷酸腺苷 (ATP),0.5%组蛋白?s,一P—ATP301的混合液中, 3O?.7min后,取反应液251点于惠特曼(Whatman)P81强 离子交换体上,贝何曼(Backman)液闪仪计数放射活性. 3.1,4,5一三磷酸肌醇(IPs)测定采用放射蛋白竞争结合 法n].所有结果用t检验行两样本均数比较. 二结果 1.HI后鼠脑皮质PKC活性变化:HI后鼠脑皮质神经 细胞胞膜PKC活性降低(284?46mol/mg),与对照组的 (628?114)mol/mg差异有显着性(f一3.50,P<O.05).细 胞胞浆PKC活性升高(648191)mol/mg,对照组(249?15) mol/mg;(f一4.26,P<O.01),细胞胞浆,胞膜PKC活性相 比差异有非常显着性(f一3.67,P<O.01).动态观察PKC活 性变化,结果显示上述改变在HI后72h内最明显(图1). 2.HI后新生鼠脑海马PKC活性变化:HI后新生鼠脑 海马神经细胞胞膜PKC活性降低(323?26)mol/mg,与对 照组的(514?57)mol/mg相比,差异有非常显着性(f一 3.35,P<0.01).细胞胞浆PKC活性无明显变化(627? 107)mol/mg,对照组623土125)mol/mg(t一0.05,P> 作者单位:110004沈阳,中国医科大学第二临床学院儿科 ? 论着摘要? 0.05),神经细胞胞浆与胞膜PKC活性相比,两者差异有非 常显着性(f一3.05,P<0.01,图2),这一变化在HI后72h 内最显着. 化 12o0 1ooO 8o0 600 譬4OO 200 O 图1缺氧缺血后新生鼠脑皮质细胞浆,胞膜PKC活性变化 1400 12o0 1ooO 800 600 40O 200 O 图1缺氧缺血后新生鼠脑海马神经细胞浆,胞膜PKC活性变 2002年9月第5卷第3期ChinJPerinatMed!P1! 3.HI后脑皮质,海马神经细胞胞浆中PKC与IP.相关性分 析:显示二者的变化无相关性(r值分别为0.398, 一 0.421.P>0.05). 三,讨论 正常情况下PKC以无活性形式存在于细胞浆中,被激 活后转移至细胞膜上,发挥一系列生理功能.许多研究证明 PKC与脑HIBI有关.Aronowski等[2]应用全脑缺血模型观 察到:缺血2Orain后脑皮质及海马PKC活性降低,且在缺 血后24h仍未恢复正常,在缺血前给予NMDA受体拮抗剂 可减少缺血导致的PKC活性降低.Lebec等[3]在2日龄新生 鼠HIBI模型中发现;HI2,3min脑组织PKC活性不变, 5,6rain时PKC活性降低,随HI时间延长PKC活性逐渐 降低,HI21,22rain时PKC活性降至零.本研究结果与国 外学者基本一致.本研究还发现生后一周左右鼠PKC活性 较高,这可能与正常脑的生长发育不同阶段有关. 目前关于PKC活性改变与HIBI神经元损伤的确切关 系尚未明确.缺血缺氧时无氧酵解增加,导致酸中毒,ATP 生成不足,蛋白质,糖及脂肪代谢障碍,而PKC所调控的磷 酸化与非磷酸化平衡直接控制着上述代谢过程.因此,PKC 持续性激活及PKC活性改变所致的磷酸化失衡可能是HIBI 时神经细胞损伤的一个重要原因. ?223? 已知IP.可促进内质网向细胞浆中释放Ca",使胞浆内 Ca抖浓度增加.本研究对HIBI时脑皮质,海马神经细胞胞浆 中PKC与IP.的变化进行了相关性,结果显示二者无 相关关系.目前有关HIBI时两者关系的研究尚未见报道.最 新实验证明用PMA激活PKC可以降低IP.生成,去除内源 性PKC作用后IP.生成增加,可见PKC与IP.之间存在着 某种联系,但目前研究资料甚少,尚需深入研究. 参考文献 1王华,韩玉坤,吴保敏.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤1,4,5一三磷 酸肌醇的变化研究.新生儿科杂志.1999,14:160—163. 2AronowskiJ,WaxhamMN,GrottaJC.Neuronalprotectionand preservationofcalcium/calmodulin—-dependentPKIIandPKCac—- tivitybydextrorphantreatmentinglobalischemia.JCereb BloodFlowMetab,1993,13:550—557. 3LebecB.Dell'AnnaE,Fang—KircherS,eta1.Decreaseofbrain PKC,PKA,cyclin—dependentkinasecorrelatingwithpHpre? cedesneuronaldeathinneonatalasphyxia.JInvestigMed. 1997,45:284—294. (收稿日期:2001—03—05) (本文编辑:徐福兰) ? 论着摘要? 一 氧化氮和一氧化氮合酶在宫内窒息胎鼠肝损伤中的作用及意义 李军利,梅 一 氧化氮(nitricoxide,NO)作为一种重要的细胞内信 一氧化氮合酶(nitricoxidesyn— 使,具有多种生理功能. thase,NOS)是合成NO的唯一限速酶.肝组织中存在内 皮型(endothelialNOS,eNOS)和诱导型(inducibleNOS,i— NOS),其诱导产生的NO参与生理和病理变化.但在宫内窒 息胎鼠肝脏缺血缺氧再灌注损伤过程中是否存在相应变化, 尚未见报道. 一 ,材料和方法 1.动物模型:Wistar大鼠,雌鼠体重(250~20)g,于妊 娠第21天用2.5戊巴比妥钠0.1,0.2ml/100g腹腔麻 醉孕鼠,下腹正中开腹,暴露双角子宫及供应子宫和卵巢的 动静脉,以无创动脉夹钳夹一侧血管(缺血组),钳夹时间分 别为1O,30min,再灌注时间为30min,2,6,24h.模型达规 定时间后,立即剖宫取出胎鼠,断头处死,取出肝脏.对侧未 作者单位:110004沈阳,中国医科大学附属第二临床学院儿科 钳夹子宫角内的胎鼠为对照组. 2.测定方法:采用硝酸还原酶法测定组织内NO含量, SABC法检测NOS,利用Universalimagingporporation的 图像分析系统,测定其光强度(intensity).常规观察肝组织 结构变化. 3.统计学处理:所有数据用均值土差(土s)示, 行t检验. 二,结果 1.缺血缺氧及再灌注胎鼠肝脏NO含量逐渐增加,于再 灌注6h达高峰(表1). 2.缺血缺氧及再灌注肝脏iNOS光强度逐渐下降,即活 性逐渐增强.eNOS光强度逐渐增加,即活性逐渐下降 (表2). 光镜检查结果:缺血10min再灌注24h中央静脉扩 3. 张瘀血明显.缺血30min,可见肝窦内瘀血,再灌注6h,还可 见肝细胞浊肿,再灌注24h,可见大量肝细胞坏死.电镜检