总大肠菌群总大肠菌群
总大肠菌群(滤膜法)
1、 适用范围
生活饮用水、水源水
2、 仪器
高温蒸汽灭菌器、滤器、口径0.45μm滤膜、培养箱、冰箱、天平、无齿镊子、直径9cm平皿、灭菌试管、灭菌吸管、酒精灯、烧杯、量筒、1000ml容量瓶。
3、 步骤
(1) 储备培养基的制备
品红亚硫酸钠培养基:
加入蛋白胨10g、酵母浸膏5 g、牛肉膏5 g、乳糖10 g、琼脂20 g、磷酸氢二钾3.5 g、无水亚硫酸钠5 g、碱性品红乙醇溶液(50g/L)20mL、蒸馏水1000mL。
配制方法:
先将琼脂加到500ml蒸...
总大肠菌群
总大肠菌群(滤膜法)
1、 适用范围
生活饮用水、水源水
2、 仪器
高温蒸汽灭菌器、滤器、口径0.45μm滤膜、培养箱、冰箱、天平、无齿镊子、直径9cm平皿、灭菌试管、灭菌吸管、酒精灯、烧杯、量筒、1000ml容量瓶。
3、 步骤
(1) 储备培养基的制备
品红亚硫酸钠培养基:
加入蛋白胨10g、酵母浸膏5 g、牛肉膏5 g、乳糖10 g、琼脂20 g、磷酸氢二钾3.5 g、无水亚硫酸钠5 g、碱性品红乙醇溶液(50g/L)20mL、蒸馏水1000mL。
配制方法:
先将琼脂加到500ml蒸馏水中,煮沸溶解(用大烧杯),于另500ml蒸馏水中加入磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏,加热溶解,倒入已溶解的琼脂,补足蒸馏水至1000ml,混匀后调pH值为7.2,7.4,再加入乳糖,分装,68.95kPa(115?,10lb)高压灭菌20min,储备于冷暗处备用。(建议培养基用多少配多少)
乳糖蛋白胨培养基
蛋白胨10g,牛肉膏3g,乳糖5g,氯化钠5g,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml,蒸馏水
1000ml。
配制方法:
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中,调节pH为7.2-
7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml,充分混匀,分装于含有倒置的小玻璃管的
试管中,于高压蒸汽灭菌锅中,在115?灭菌20min,贮存于暗处备用。 (2) 平皿培养基的制备
将上面制备好的备用的培养基加热融化,用灭菌吸管按比例吸取一定量的
50g/L的碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中,再按比例称取所需的无水亚硫酸钠
置于另一灭菌试管中,加灭菌水少许,使其溶解后,置沸水浴中煮沸10min以灭
菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液,滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色褪
成淡粉色为止,将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内,并充分混匀(防止产生气泡)立即将此种培养基15ml倾入已灭菌的空平皿内。待冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内 保存不宜超过两周。如培养基已由淡粉色变成深红色,则不能再用。
(3) 滤膜灭菌
将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中煮沸灭菌3次,每次
15min。前两次煮沸后需要换水洗涤2,3次,以除去残留溶剂。滤器用蒸汽灭菌
器103.43kPa(121?,15lb)高压灭菌20min。
(4) 水样过滤
用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床
上,固定好滤器,将100ml水样(如水样含菌数多,可减少样量,或加水样稀
释)注入滤器中,打开滤器阀门抽滤。
培养水样抽滤完后,再抽气5s,关上滤器阀门,取下滤器,用灭菌镊子夹取
滤膜边缘部分,移放在品红亚硫酸钠培养基上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与
培养基完全贴紧,两者间不得留有气泡,然后将平皿倒置,放入37?恒温箱内培
养24h。
(5) 结果观察
A. 挑取符合特征的菌落进行革兰氏染色、镜检:
紫红色、具有金属光泽的菌落;
深红色、不带或略带金属光泽的菌落;
淡红色、中心色较深的菌落。
B. 凡革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,再接种乳糖蛋白胨培养基,于37?培养
24h,有产酸产气者则判定为总大肠菌群阳性。
C. 补充知识-革兰氏染色:细菌先经碱性染料结晶染色,而经碘液媒染后,用酒精
脱色,在一定条件下有的细菌此色不被脱去,有的可被脱去,因此可把细菌分为
两大类,前者叫做革兰氏阳性菌(G+),后者为革兰氏阴性菌(G-)。为观察方
便,脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色,阴性菌
则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌,以及所有的放线菌和真菌都呈
革兰氏正反应;弧菌,螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。
(6) 样品测定步骤
按下式计算滤膜上的总大肠菌群数,即:
m*100
总大肠菌群数(CFU/100mL)= V
式中: m——数出的总大肠菌群数;
V——过滤的水样体积(mL)
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