骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究（可编辑）

骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织软骨的研究（可编辑） 骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的 研究 Ch inese J Reparative and Reconstructive Surgery, 2004, V o l 18 2 ?92? 骺板软骨细胞复合三维支架体外构建 组织工程软骨的研究 周 强 李起鸿 戴 刚 【摘 要】 目的 探讨将骺板软骨细胞复合三维支架经体外培养, 构建组织工程软骨的效果及其生物学特点。 方法 将 3 周龄幼兔第 1 代骺板软骨细胞与液态的生物凝胶混合, 接种于聚磷酸钙纤维 L 2聚乳酸 CPPF PLLA 三维 支架材料, 构建组织工程软骨组织块, 连续培养 4 周。行大体、倒置显微镜及组织学、 型和? 型胶原免疫组织化学光镜 观察, 定量检测硫酸糖胺多糖 GA G 含量。 结果 构建的组织工程软骨块在培养过程中能保持其初始外形, 种子细胞 呈稳定的三维均相分布, 外观逐渐呈乳白色、半透明, 硬度亦不断增加。培养 1 周有软骨细胞陷窝形成, 2 周后形成富含型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的工程化软骨, 且 型胶原逐渐转为阴性。 4 周时构建软骨的组织结构与 天然骺板软骨相类似, 硫酸 GA G 含量平均为天然骺板软骨的 34%以上。 结论 骺板软骨细胞复合三维支架体外培养 可生成典型软骨, 且可形成类似天然骺板软骨的组织结构, 能满足修复骺 板缺损的基本要求。体外培养 1~ 2 周可能是植 入体内修复骺板缺损的较佳时机。 【关键词】 组织工程软骨 骺板 软骨细胞 再生 中图分类号: R 318 Q 813111 - CHOND ROGENESIS IN V ITRO BY EP IPHY SEAL CHOND ROCY TES SEED ING INTO THREE D I M ENSI ONAL SCAFFOLD S ZH OU Q iang , L I Q i2hong ,DA I Gang. D ep artm ent of O rthop aed ics, S ou thw est H osp ital, the T h ird M il2 itary M ed ical U niversity. Chong qing , P. R. Ch ina 400038 【 】 2 Abstract Objective To observe the efficiency and bio logical characteristics in regenerating in vitro tissue en2 2 gineered cartilage from ep iphyseal chondrocyte scaffo ld comp lex M ethods T he first passage ep iphyseal chondrocytes w ere co llected and m ixed w ith the bio logical gel2 m atrix, the chondrocyte2gel fluid w as dropped into the scaffo ld to fo rm a comp lex. T he comp lexes w ere in vitro cultivated. T he changes of comp lexes in mo rpho logy and synthesis of co llagens type and type and aggrecan w ere observed under the gro ss and the inverted and ligh t m icro scopes T he sulfate GA G content in comp lexes w as m easured by the the modified dim ethylm ethylene blue m ethod. Results D uring cultivation, the comp lexes could keep its o riginal shape w ith the stable homogeneous th ree2dim ensional distribution of chondrocytes, gradually becam e m ilk w h ite and translucence w ith their rigidity increasing. In the 1st w eek, the chondrocytic lacunae2 , fo rm ed in the comp lexes A fter w eek s the comp lex w as gradually reo rganized into the m ature engineered cartilage w ith rich co llagen type? and aggrecan and typ ical cartilage h isto logical structure, but w ith negative imm uno logical stain2 ing of co llagen type In the 4th w eek, the engineered cartilage resem bled the nature ep iphyseal p late in the character2 , 34%istic of h isto logical structure and had over of the sulfate GA G content of the natural ep iphyseal p late Conclusion 2 2 T he ep iphyseal chondrocyte scaffo ld comp lex can be reo rganized into typ ical cartilage w ith the ep iphyseal like h isto2 logical structure, and be fit fo r repairing the ep iphyseal defect. T he tissue engineered cartilage cultivated fo r 122 w eek s m ay be a good cho ice fo r repairing ep iphyseal defect. 【 】 Key words T issue engineering cartilage Ep iphyseal p late Chondrocytes R egeneration : 39830100; Foundation item s N ational N atural Science Foundation of Ch ina Innovating Foundation of Southw est Ho sp ital of the T h ird M ilitary M edical U niversity 200224 骺板损伤早闭会导致肢体严重的畸形和功能障 术为骺板缺损早闭提供了 新的治疗手段。目前体外构 碍, 是常见的小儿骨伤病, 目前尚缺少能修复损伤骺板 建工程化骺板软骨 的方法主要为离心管内细胞团聚集 [ 1~ 4 ] 组织结构和恢复其生长功能的理想材料。组织工程技 培养、细胞复合凝胶 类基质等 , 但这些方法均有缺 陷, 很难用于临床。采用已建立的种子细胞双相接种技 [ 5 ] 基金项目: 国家自然科学基金重点资助项目 39830100 ; 第三军医 术 , 我们将骺板软骨细胞复合三维高孔隙支架经体 大学西南医院科技创新基金 200224 外培养构建组织工程软骨, 取得了较好效果, 报告 作者单位: 第三军医大学附属西南医院骨科?组织工程研究与开 如下。 发中心 重庆, 400038中国修复重建外科杂志 2004 年第 18 卷第 2 期 ?93? 采用M icro soft Excel统计程序进行分析, 数据以 1 材料与方法 均数?标准差表示, 组间比较采用独立样本 t 检验, P 值 0. 05 为有统计学意义。 1. 1 原代骺板软骨细胞的分离和培养 采用系列酶 Sigm a 消化分离 3 周龄幼兔的原代 [ 4 ] 骺板软骨细胞 。苔盼蓝排斥法计数活细胞, 以 3× 2 结果 4 2 2. 1 大体及倒置显微镜观察 10 cm 的密度和含 10% FBS H yclone 、 584 m g L 大体观察可见, 接种后细胞2凝胶混悬液立即浸满 L 2谷氨酰胺 国产分析纯 、 0. 1 mm o l L 非必需氨基 网状支架的孔隙, 10 分钟后在支架内固 CPPF PLLA 酸 Gibco 、0. 4 mm o l L 脯氨酸 国产分析纯 及 化为半透明的胶冻状, 并共同形成具有支架三维外形 50 维生素 的 2 12 Lg L C Sigm a DM EM H am ’s F 2 的整体。随着培养时间的延长透光度逐渐下降, 1 周 培养液, 接种于 175 培养瓶 , H yclone cm N unclon 时明显呈乳白色、半透明, 同时硬度不断增加, 且表面 置于 37?、 5% CO 2 培养箱内, 间天换液, 培养至 90% 润滑, 但培养 4 周其硬度仍与天然软骨相差明显。在培 融合, 收集细胞, 胰酶 消化收集第 1 代软骨 Sigm a 养过程中构建组织始终保持支架的初始外形。倒置显 细胞。 微镜下可见, 接种后细胞2凝胶混悬液完全充填 1. 2 组织工程化骺板软骨的构建和培养 CPPF PLLA 网状支架的孔隙, 细胞在其中呈均匀的 采用组织工程三维支架种子细胞双相接种技术, 7 三维分布 图 1 , 培养 24~ 48 小时, 支架外周的细胞 将第 1 代软骨细胞以 2. 5×10 m l的密度与生物凝胶 凝胶开始随支架外形收缩, 表面的细胞变为梭形, 中部 混匀制成细胞2凝胶混悬液, 接种于已消毒水化的聚磷 的细胞仍为圆形、透亮, 以后组织密度逐渐增高, 1 周 酸钙纤维 calcium po lypho sphate fiber, CPPF L 2聚 时镜下已不能透光, 仅可见边缘为梭形细胞。 乳酸 2 2 , po ly L lactic acid PLLA 三维支架材料 直径 11 、高 3 , 孔隙率 92% 中, 并行固化, 置于加 mm mm 有相同培养液的 6 孔板 公司 中, 在 37?、 5% BD CO 2 [ 5 ] 孵箱内培养, 5 小时后全量换液, 以后隔天换液 。共 培养 4 周。 1. 3 观察指标 1. 3. 1 大体及倒置显微镜观察 观察构建的复合组 织块在培养过程中形态、色泽、透明度和硬度等变化, 在倒置显微镜下观察其细胞形态、组织透光度等变化。 1. 3. 2 组织学观察 分别于培养 1、 2、 3 和 4 周各采 图 1 细胞接种 10 分钟后, CPPF PLLA 支架内饱含细胞凝胶混悬液, 集 3 个标本, 4%多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋, 脱蜡至 细胞分布均匀 倒置显微镜×100 水, 部分切片行 染色; 另一部分行甲苯胺蓝 H E to lu i2 F ig. 1 The chondrocyte-gel f luid f illed in the CPPF PLLA scaffold , 染色, 光镜观察。 dine b lue TB - with the stable homogeneous three dimen sional distr ibution of chondro- 1. 3. 3 型和? 型胶原免疫组织化学观察 常规石 cytes af ter 10 m inutes of culture Inverted m icroscope×100 蜡切片, 脱蜡至水, 一抗分别选用鼠抗兔 型和? 型胶 2. 2 组织学观察 原单克隆抗体 O ncogene , 按免疫组织化学试剂盒 培养过程中, 构建的组织块由外周向中心逐渐形 北京中山公司说明操作, 显色液 武汉博士德 DAB 成骺软骨组织结构。其表面为 1~ 3 层梭形细胞组成的 公司显色, 光镜观察, 阳性为棕黄色。 膜状物。培养 1 周时, 组织块外周部的部分细胞周围形 1. 3. 4 硫酸糖胺多糖 glyco sam inoglycan s, GA G 含 成透亮的软骨陷窝结构, 可单一或成簇状分布, 对 TB 量的测定 培养至 2 和 4 周时, 分别采集 3 个标本, 同 有明显的红色异染反应; 中心部完全为细胞与凝胶基 时取 3 只同月龄幼兔的骺板软骨作对照, 用滤纸吸干 质形成的简单而幼稚的结构, 对 TB 无异染反应。随培 组织水分, 电子天平称量组织湿重。二甲基亚甲蓝比色 养时间延长, 细胞形成软骨陷窝结构的范围向中心部 法测定硫酸 含量, 每克组织中硫酸 含量按 GA G GA G 延伸。 2 周时, 整个组织块已有软骨陷窝结构形成, 中 下列公式计算: 心部组织结构仍较为幼稚, 软骨陷窝较少而小, 外周部 组织块中硫酸 GA G 含量 m g 硫酸 GA G 含量 m g g 组织湿重 g 的少量软骨细胞开始出现肥大 图 2 a ; 对 TB 的红色 1. 4 统计学方法 异染反应外周部明显强于中心部。4 周时, 组织结构发Ch inese J Reparative and Reconstructive Surgery, 2004, V o l 18 2 ?94? 生明显变化, 具有骺板软骨结构的雏形, 外周部位为小 时的硫酸 GA G 含量明显高于培养 2 周时, 差异有统 细胞、细胞密度低而胞外基质丰富, 类似骺板软骨的生 计学意义 P 0105 , 明显低于天然关节软骨的硫酸 化层; 向中心部细胞变得明显肥大、密度增加, 呈不典 含量, 差异有统计学意义 0101 ; 构建的工 GA G P 型的同源细胞柱或簇排列, 类似骺板软骨的肥大层, 但 程化软骨块 4 周的硫酸 含量约为天然骺板软骨 GA G 排列不规则。整块组织对 TB 均呈典型的强异染反应, 的 34141%。 但外周类生化层较中心部为弱。在培养过程中支架材 料逐渐降解, 4 周时在中心区域尚残留少量支架材料 3 讨论 图 2 b 。 骺板损伤早闭的临床主要治疗手段为切除骨桥、 2. 3 型和? 型胶原的免疫组织化学观察 开放骺板缺损区并充填脂肪、骨水泥、硅胶等材料, 以 型胶原的免疫组织化学显示, 1 周时呈明显的 使上下骨区隔离, 阻止骨桥形成, 并依赖周围骺板的横 阳性, 主要分布于未形成软骨陷窝的区域; 2 周时明显 向再生能力修复缺损区。但骺板的再生修复能力很有 [ 6 ] 减弱; 4 周时已基本为阴性。? 型胶原的免疫组织化学 限, 超出其再生能力的大面积骺板缺损疗效较差 。自 [ 7 ] 显示, 培养 1 周时免疫着色为弱阳性, 主要分布于有软 体骺板软骨移植虽能取得良好的临床效果 , 但必然 骨陷窝形成的区域, 随培养时间的延长免疫着色增强; 造成供区新的损伤或畸形, 且组织来源极其有限, 临床 2 周时免疫着色已很强; 4 周时外周类生发层较中心肥 难以广泛实施。从骺板结构和功能的特殊性及骺板早 大层的免疫着色弱 图 3 。 闭发生的病理机制出发, 组织工程骺板要达到 临床应 2. 4 硫酸 GA G 含量 用的要求, 应具备以下基本条件: 能按需要制备具有特 培养 2 周时, 构建的组织工程软骨块硫酸 定大小和外形的盘状组织; 厚度为 310~ 410 ; 形 GA G mm 含量为 8132 ? 1193 m g g, 4 周时为 13. 33 ? 态结构完整、无孔隙, 达到阻止骨桥形成的目的; 能修 2. 40 m g g, 然 而 天 然 骺 板 软 骨 为 38. 74 ? 复骺板组织结构, 恢复其生长功能。 8. 97 。统计学分析表明, 工程化软骨培养 4 周 目前已有多种组织工程骺板的构建方法。 m g g Kato 图 2 构建的组织工程软骨组织学观察 ? a 2 周时组织块各部分均有软骨陷窝形成, 外周部 左少量软骨细胞出现肥大 ×100 ? b 4 周时 H E 组织块已形成类似骺板软骨的结构, 外周 上为类生发层, 中心部为类肥大层, 中心区 ?尚残留少量支架材料 甲苯胺蓝×100 图 3 4 周时? 型胶原免疫组织化学染色呈强阳性, 外周 左 类生发层较中心肥大部着色弱 Env ision’s ×200 a F ig. 2 H istolog ical observation of eng ineer ied tissue at differen t culture time ? In the 2nd w eek, chondrogenesis extended to the w ho le comp lex w ith a few hypertroph ic chondrocytes in the peripheral part left H E×100 ? b In the 4th w eek, the comp lex w as reo rganized into the m ature 2 , cartilage w ith the ep iphyseal like structure the peripheral part upper resem bled the germ inal layer and the central part resem bled the hypertroph ic ? ×100 3 4 , layer w ith a little rem aining of the scaffo ld TB F ig In the th week the complex had strong positive immunohistochem ical sta in ing of collagen type, but the germ inal- like layer in per ipheral part lef t had weaker positive sta in ing than the cen tral hypertrophic part Env ision’s ×200