克拉维酸钾中有关物质G的化学合成与结构鉴定

克拉维酸钾中有关物质G的化学合成与结构鉴定 ,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,:,,,, ,:,,,,, 克拉维酸钾中有关物质 的化学合成与结构鉴定 , , , , , , ,,,,,,陈 仿靳孝庆曹广祥张晓晓王珊珊钟传青 ,,,,,鲁南制药集团科研部山东 临沂 山东建筑大学市政与环境工程学院山东 济南 ,,,,,:::,,,,:,:, 、、,摘 要以 ，酪氨酸和琥珀酸酐为原料氯化锂为催化剂冰醋酸为反应溶剂合成了药品克拉维酸钾中的有关物质 , 。 、、、,研究了反应溶剂的种类反应物料配比反应温度反应时间等因素对有关物质 收率及纯度的影响在 酪氨酸和 ,,,， 、加热反应的优化条件下,有关物质 粗品的最高纯度达到,收率为琥珀酸酐的摩尔比为,?,,,,, ? ,,:～, ,,,,, ,,, 。 ,,。 ,通过制备液相色谱对粗品进行纯化有关物质 的纯度达到总收率为 采 用 对 所 合 ,, , ,,,,, ,,,,, ，:,,,,, ,确定其为欧洲药典中克拉维酸钾的有关物质 。成物质进行了结构鉴定 , 关键词,克拉维酸,有关物质 ,化学合成,结构鉴定, ,,,,, 中图分类号文献标识码文章编号,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,:,,::,,,:, 。,,法和提高克拉维酸钾药品质量提供帮助克拉维酸是 一 种 不 可 逆 性 竞 争 :,,～,,:,:,,,,, ,型内酰胺酶抑制剂可与内酰胺酶的丝氨酸活性 ,,ββ 实验 ,, 逆 结 合从 而 保 护内 酰 胺 类 抗 生 素 的 活 位点不可,β,,,,, 。,随着细菌 耐 药 性 的 不 断 增 强克 拉 维 酸 在 临 性主要试剂与仪器,,, ,,、,,、酪氨酸生物纯琥珀酸酐化学纯有关物质 ，,,最成功的例子就是葛兰素公 床上的应用越来越广泛 ,标 准 品 , ::～,: : ，～:;，,,, :, ,::,,,,,,,,, ,,司的 克拉维酸钾与 阿 莫西林的复合制 ,～,;,,,,,,、、、、 ,,,氯化锂冰醋酸乙酸乙酯,,,,:,,,,,,,,:～,:;,;,, 。,,剂克拉维酸钾一般采用发酵法生产生产过程 、、,,、、碳酸氢钾无水乙醇乙腈色谱纯三氟乙酸丁二酰 ,,,中始终存在 琥珀酰酪氨酸结构式见图在欧洲 ，,,、、。 。四氢呋喃硫酸所用试剂除注明外均为纯 氯,药典中标识为有关物质 并且不容易在提取过程中 ,,,型旋转蒸发仪循环水式真空泵 ,,::,， ，,,,,,,, 。,随着人们对药品质量的要求越来越高有关 去除,,型电加热 套型 低 温 冷 却 循 环 泵梅 特 勒,,:, ,，,, ,物质 因为对药品质量影响很大其含量要求也越来 , ,,型 分 析 天 平型 冷 冻 干 燥 机,，,:, ，,，,: ,,,,, ,、因此研究有关物质 的性质控制生 产 过 程 越严格, ,,型真空干燥箱型液相色谱仪北 ,:,:, ,,,,:: ;,,,,、中有关物质 的产生降低药品中有关物质 的含量 , , ,,,泵检测器京创新通恒制备色谱仪,: ,， ,, , ,， 。 由于 克 拉 维 酸 钾 中 有 关 物 质 的 标 准 品非常关键 , ,,。定量环型液相质谱仪,,,,::,,,:;,,,,, ,。的价格极其昂贵严重限制了对其性质的研究 合成,,, 酸酐法,,,,, 称取 酪 氨 酸 和 琥 珀 酸 酐 放 入,,,,，,,:: , ,, ,三口烧瓶中加入冰醋酸和 氯化 , , ,,:，,:，:,,, ,,,放入电热套中加热常压下缓慢升温至搅拌 锂图有关物质 的分子结构式 , , ,, ? 。, ,～,～～～～～,, ;:;:,,,,,:,,;:,;,;,,;,,,,,,:;,,,,将反应液减压蒸馏至无液体滴出后回流反应,,:～,,,,, ,,向三口烧瓶中加入纯水搅拌溶解再用 , ,,:，,:， 作者分别采用酸酐法和酰氯法合成克拉维酸钾有,。乙酸乙酯萃取水相次合并乙酸乙酯相将乙酸乙酯 ,,,关物质 并通过 对所合成物质进行了结 ,, ,，:,,,,,冷冻除水过滤萃取液置于低温冷却循环泵中,,: ? ,、以期为研究有关物质 的生成机制控 制 方构鉴定, ,收稿日期 ,:,,,:,,,, ,,,,,,,,,,,,,,作者简 介陈 仿 女江 苏 邳 州 人助 理 工 程 师研 究 方 向生 物 制 药 工 程通 讯 作 者钟 传 青博 士副 教 授 , ,,,,,,，,,, 。,～:,:～,,,,::,, ,, ,, 陈 ,,仿等克拉维酸钾中有关物质 的化学合成与结构鉴定年第期 ,,:,,, 。溶液的配制去除冰渣向除水后的乙酸乙酯相中加入 ,,,,,,, ,,:,，,: ,,,碳酸氢钾溶液进行反萃搅拌后静置分出重 ,: ,, ,,品溶液精密称取克拉维酸钾有关物质 标 , ,,,,。 向其中加 入 无 水 乙 醇室 温 下 养 晶 抽 相液,， ,～,? 准品适量加水溶解并制成浓度约为:,,, ,,，, ,,。滤饼 真空干燥得有关物质 粗品滤,。,: ?,～, 的溶液作为标准品溶液 ,,供试品溶液精密称取供试品适量加水溶解并制 ,,,。?的溶液作为供试品溶液 成浓度约为:,,,,,，, 样品检测,,,,,,, , 取标准品溶液和供试品溶液分别进样用外标法 。计算供试品含量 图酸酐法合成有关物质 的化学反应式 , , 结构鉴定 ,,,,,,,, :～,,,～～;:,,;,:,::,,;,,:,;,;,,;, ,,,,,,,,,!,。采用 对所合成物质进行结构鉴定,, ，:,,,,～,,,,:;,,,:,,,～,,;,;～:,,,,,, !!,,,,,;离子化方式离子模式负离子色 谱 柱，,,，，, 酰氯法,,,,,流动相,,,,, 乙: ,,× ,,,, ,,,,,,,,,:,,:,,,,,μ,, ,,, , ?称取酪氨酸放入三口烧瓶中,,,:，,,: ,， 三 氟 乙 酸 水 溶 液流 速腈,,,,:,,, , ,，,,, ,,,,检测 器检 测 器,,:,,,, ,,,,～,:,,:,:, ,加入饱和碳酸氢钾溶液并将三口烧瓶置于低 ,,,: ,， , ,。,,::,:,;,;,,,,,,,, ,!下缓慢滴加含有丁二 温冷却循环泵中: ? :,,, ,:,: 。,滴加完毕后保持酰氯的四氢呋喃溶液 ? ,:,，: 结果与讨论 ,。 ,反应将反应液减压蒸馏至无液体滴出后,～,: ? 向三口烧瓶中加入水溶解并用调 , ,:,，,,，,: ,, 反应路线的选择 ,,,。 ,值至加入等体积的乙酸乙酯萃取次合并 ， ,,,, ,,在欧洲药典中有关物质 又称为 , ，,～::,,,,,!!, ,,, 。。后续操作同乙酸乙酯相,,,,, ,,该物质中含有 酪氨酸和琥珀酸的结构其 :,,;，,,, , 酪氨酸在发酵培养基中属于常见物质琥珀酸是 中，,,,,,,,二者有可能在 细胞代谢三羧酸循环中的重要物质 ,某种酶的催化下形成酰胺键进而生成有关物质 因此 , 。 推测有关物质 极可能是在发酵过程中产生的化学 ,,,,。 合成中常用的酰胺键生成方法有酸酐法和酰氯法图酰氯法合成有关物质 的化学反应式 , ,,研究明作为酰化剂时酸酐的活性比相应的酰 ,,,:～;,:,;,::,:,,～;,,:～;;,;, ,,,,,,,,,,,,,,,!,,, ,。反应速度比酰卤慢但本研究中对比两种合 卤弱,～,,,,,:;,,,:,:～,:,,,;,;,～:, !!,,酰氯法的反应时间比酸酐法要长很多有 成方法发现 , 的纯度和收率也比酸酐法低经过多次实验 关物质, 制备液相色谱法纯化有关物质 ,,,,,有关物质 的最高纯 对酰氯法合成条件进行调整后, ,称取有关物质 粗品适量加水溶解制成浓度约 , ,, ,,总收率为而酸酐法合成的有关 度为,,,,, ,,,:, ?,。 的溶液进制备液相色谱从制备液 为,: ,,，, ,。 , 粗品纯度达到收率为因此物质,, , , ,,,,,,,,经高效液相色谱检测确定为纯 相色谱中接出的溶液 ,,。有关物质 后收集减压蒸馏至没有液体蒸 出 后冷 选择酸酐法作为合成有关物质 的路线, , ,。得白色晶体有关物质 冻干燥, ,,,,, 色谱条件色谱柱:,: ,,×,,: ,,,:, ,,μ 反应溶剂的选择,,, ,,,流动相乙 腈 三 氟 乙 酸 水 溶 液流 速, ,, ,::,,,: , 由于酪氨酸的溶解性较差所以选择合适的反 ，,, ,,,,,。?检测波长进样量,，,,,,:,,, ,， ,。 在碱性条件下有利于氨基酸类物质酰 应溶剂很关键,,,:,、、 进 行首 先 选 择 水二 甲 基 甲 酰 胺二 甲 化反应的 测试与表征,,, 、,,氯仿等作为溶剂结果均没有有关物质 生成苯, ，, ,,, 高效液相色谱分析 ,,,,,,,酪氨酸易溶于甲酸因而选用甲酸作为溶剂虽然有有 色谱条件 ,,,,,,,,,关物质 生成但反应副产物很多纯度最高仅能达 , ,,色谱柱,;,,:,,,, ,,,,,, ,,×,,: ,,,,,,,,进而选 用 冰 醋 酸 作 为 溶 剂酪 氨 酸 和 琥 珀 到, ,:，, ,,,,流动相乙腈 三 氟 乙 酸 水 溶 ,,,, ,, ,,::,,,。 合成有关物质 的含量较高因 酸酐反应较为充分μ, , , ,,,,,,?流速柱 温检 测 波 长液,。最终选择冰醋酸作为反应溶剂 ,, ? ,，,,:,,: ,此 ,,。进样量,,,:， μ ,, ,,陈 仿等克拉维酸钾中有关物质的化学合成与结构鉴定年第期, ,:,, , 。有利于反应 向 所 期 望 的 方 向 进 行但 由 于 酪 氨 酸 ，, 反应物料配比对反应的影响,,, ,, 、,导致其在反应溶剂中的浓度很低反应的溶解性较差在反应温度为反应时间为的条件下 ,, ?,,:～ ,,,,。 考察反应物料配比酪氨酸和琥珀酸酐摩尔比下同 速度很慢因此需要升高 反 应温 度 以 加 快 反 应 速 度，, ,,,由图随着反应温度的升高反应速度加快有 可知, 对有关物质 ,结果如图所示。 收率和纯度的影响, , ,,关物质 的收率逐渐上升在但反 时达到最高, ,, ? ,,应温度过高超过导致 后容易引起副反应发生,, ? ,。副产物增多有关物质 的收率和纯度反而下降因 , ,。此选择适宜的反应温度为,, ? 反应时间对反应的影响 ,,, 、在物料配比为反 应 温 度 为 的 条 件 ,?,,,,, ? ,, 下考察反应时间对有关物质 收率和纯度 的 影 响, 。结果如图所示 , 反应物料配比对有关物质 图收率和纯度的影响, , ,,,, ，,,;:,:,,;,:,,,,,,,,,::,,;,,,,,～,,,,!! , :,,～;,;,,,;,,～,,,,,:;, ,从有关物质 的结构上分析琥珀酸酐和 酪氨, ， , 酸的反应摩尔比为。 但是由于琥珀酸为二元酸, ,?, ,若 酪氨酸过量则有可能与 酪氨酸形成个酰胺 ，，,,, ,。 键生成较多的副产物而琥珀酸酐过量则有利于与 ,,酪氨酸形成生成较多的有关物质 同 个酰胺键 ，,,, 。 ,时使 酪氨酸反应更充分但琥珀酸酐过量太多则 ，,图反应时间对有关物质 收率和纯度的影响 , , ,会有大量的琥珀酸酐未反应造成浪费同时也不利于 ,,,, ，,,;:,:,,;,:,,:,,,,;:,,;,,,,, ,!。 ,,后期纯化由图物料配比为 有关 可知时, ,?,,, ～～～,,,,:,;,;,,;,,,,,,:;,,,! ,,,物 质 粗 品 的 收 率 最 高达 到 纯 度 达 到, ,,,,, ,,由图反 应 时 间 为 时反 应 时 间 太 可 知, :,,～ 。,。因此选择适宜的物料配比为,,,,, ,?,,, ,,短反应不充分有关物质 的收率和纯度分 别 只 有, 、,,当反应 时 间 为 收 率 和 纯 度 时,:,,, ,,,,, ,,:～ 反应温度对反应的影响,,, ,、,,最高分别为而 反 应 时 间 过 长 时副 ,,,,, ,,,,, 、反应时间为在物料配比为的条件 ,?,,,,,:～ ,,产物增加收率和纯度反而下降如反应时的收 ,,:～,, 下考察反应温度对有关物质 收率和纯度 的 影 响, 、。 ,率和纯度分 别 为 因 此选 择 适 宜 的 ,,,,, ,,,,, 。结果如图所示, 。反应时间为,,:～ 液相色谱分析,,, 酸 酐 法 合 成 有 关 物 质 的 粗 品 最 高 纯 度 为 , ,,。 含 有 较 多 杂 质其 液 相 色 谱 见 图 利 用 制 , ,,,,,,,,,,,备液相色谱对有关物质 粗品进行纯化纯化后的 , 。有关物质 的液相色谱见图, , , ,, 由图纯 化 后 的 有 关 物 质 的 谱 峰 单 一可知, , 。 ,经计算纯度为经统计分析酸酐法合成有关 ,,,,, 。物质 的总收率为, ,,,,, ,结构鉴定,,, ，:,,,, ,图反应温度对有关物质 收率和纯度的影响 , , ,,采用 对 合 成 的 物 质 进 行 结 构 鉴 定，:,,,, ,,,,, ，,,;:,:,,;,:,,:,,;,;,,,～,;:,,;,,,,, ,,!。其二级质谱谱图如图所示, ～:～;;,;,,～,,,,:;,,,,,,,,,,! ,,经 所 合 成 物 质 的 结 构 与 欧 洲 分 析,, ，:,,,,,,,,,,,, 药典 中 标 示 的 克 拉 维 酸 钾 中 有 关 物 质 虽然很多酰化反应属于放热反应低温条件下, ,,,, ,, 陈 ,,仿等克拉维酸钾中有关物质 的化学合成与结构鉴定年第期 ,,:,,, ,,,,图有关物质 粗品和纯品的液相色谱 , ,,, ,,,,,,, ,～～,,～～,～～～～,,;:,:,,:,,,::,,;,:,:,,,,,;,:,:,,:,;,;,,;,,,,,,:;,,,,,,,, , 、,,,,在 酪氨酸和琥珀酸 酐 的 摩 尔 比 为 加，,?,,,,, ? , :,,:,,,～,:,～;,;～,,:,:,:,～,,,,,,,!,,,!!,!!,,, ,,,热反应的优化条件下有关物质 粗品的最高 的化学结构相符即该物质为 琥珀酰酪 ,,::,:,，,,,,,:～ , , ,,。,。氨酸收率为纯度达到，,～::,,,,,:,,,;, , ,,,,,,,,, !! ,,,经高效制备液相色谱纯化有关物质 的纯 ,, 有关物质 的 可 能 裂 解 路 径 及产物离子的可能 , ,。总收率为度达到, , ,,,,,,,,。结构见图, ,,,,通过 表征确定合成产物为欧洲 ,，:,,,, , 。药典标示的克拉维酸钾中有关物质 , ,,,该方法可以较大规模地制备有关物质 便 ,, ,进而降低该物质在克拉维酸钾 于对其性质进行研究 ,。 最终提高克拉维酸钾的产品质量中的含量 , 参考文献 ,, ,, ,,～,:,:,,,,;,,,，,:,,:,:,,,:;;～,:,::;～,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,:,,,:,,:,～::,,,;::;,:,,～;～,，,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,!,, ,,,,,:,,;,,,:～;,:,～;,,,,,,,,,,,,,,,, , ,,,,,，,,,，,，～,，,，,,,,,;～,:～,::,:,,:,,,,::,,,,,,,,,,,,, ,,!! ,,,, ,～,,:,:,,,～;:～,,:～:,,，,:～;,,～,,,～,,,,,,,,,,,,,,,, , ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,:,,,～,,,,～,,,,;,～,,,～,,:,:,,;,;,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,:;:～,::,,,,,:;,,::,,,,,,,,,,,,,,,!, ,, ,,,,,刘宝树王静康龚俊 波等克 拉维酸钾反应结晶研究 中 国 ,,，, ,,,,,抗生素杂志,::,,:,,,,,,,,,, ,,,,,,,～,,～～,,;，;,,;,,,,,,;,,;,,,,,;,:,,,:,,～;,;,,;,,,, ,,:,,:,～:,～::,，:,,;:～;,:,,,;,～,:,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,!,,!,!,β,,::,,～,,:,:,～,,,,:;:～,,,,;,;，,,:;:～,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,!! ,,,,,,::,,,,:;,,;;,,::,,,,,,,,,,,,,,, ,,,! ,,,,，,,,,:,,,,,,,,,～,:;,,～,,,:::;,,, ,, ,,,,,,,,,王镜岩朱圣庚徐长法生物化学第三版下册北京高 等 ,,,, ,,教育出版社,::,,,,,,, ,, ,,管桂萍王红兵田杰生琥珀酸对产酸克雷伯氏菌好氧发酵甘油 ,, ,,,,,,,,产,,丙二醇的影响，,食品与发酵工业,::,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,黄宪王彦广陈振初新编有机合成化学北京化学 工 业 出 ,,,, ,,版社,::,,,,,,,,, 胡宏纹有机化学北京高等教育出版社 ,,,,,,,,:,,,,,,:,,,,,,,,,, ,,,,,龚报森有机化 学 实 验 西 安陕西科学技术出版社,,,,,,,,, ,,:,,,,, ,,,,,,,王学军赵锁奇王仁安制备色谱技术进展青岛大学 学 报,,,，, 结论, ,,,,,::,,,,,,,,,, ,,下转第页,, ,,、以 酪氨酸和琥珀酸酐为原料氯化锂为催,， , 、,化剂冰醋酸为溶剂合成了克拉维酸钾中有关物质 , ,, ,,李兴玉等乌鸦果根甲醇提取物的抑真菌作用研究年第期 ,:,,, ,,,,,,,,:～,;,;:～～;;:～,～;，,，～～:,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,!!,, ,,,云南省彝族医药研究所中国彝族药学昆明云南人民 出 版 ,,,,,,,, ,,社,::,,,,,,,,, , ,,,,,,,,， ,，,,,, ～,,,:,～:,;,～,,～,,;,,,:,;,,,，,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,张之 道彝 药 本 草 第 一 卷昆 明云 南 人 民 出 版 社,,,,,::, ,, :,～,,:::;,;,:, ,,:～,,,,～, ,,,,, ，, :,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,! ,,,, ,,,,,, ,, ,,:,:,,,,,,,:,,,,,～;～,,～,,, ,, ,,,中国土农 药 志 编 缉 委 员 会中 国 土 农 药 志 北 京科 学 出 版 ,,,,,, ,,,:，:,～,,,～,;,,, ,,,～,;,,，,,,,,,,:,;,,,,,,,,,,,,～,,,,:,, ,,,社,,,,,,,,,,,, ,,,,,,:,～;,,,,::,:,,:,:,,:,,;:～～:,，;,,，,，，;,,:～;, ,!,,,, ,,,,李兴玉李立兵李兴奎乌鸦果提取工艺研究国际中医中 药 ,,,，,,,,,::,:,,,,,,,,,,, ,,,,,杂志,:,,,,,,,,,,,,, ,,,,，,:～, ,,,,,,,,;;,,;,,,:;::,:,～::,,,～,,,,,,,,,,,,,,,,!, ,,,,,,,， ,,,,,,～;,;,,;,～,,,,,,,:,;:～,～;,:,,;;:,，,,,,! ,,, ,,,,,,,,:,,～,,;～,,,:,,,～, ，,，,;, ,,:,:,,:,,,,,,,,,,,,, ,,,, , , ，,,,,,,～;,,,,,:～,;,,,～:,～,,,～,;,,,,,:;,,,,,,,,，, , ,,,, ,,,～,,:,:,;～,,:，,,::, ,:::,,::,～, ,,;,,,:～ ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,!,, , , ,,,,，,,～，,,，～，， ,,，,,:,,,，,，,,，,，,,,,, ,!,, ,,,,,,,::;;:,:;,:;,,,,:,,:,，,,;;,,～,,,,,:～～,,,,;,，～,,,,,:,:,:～,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,, ,,,,!,,, ,,,,,,，:,:,,:～,～,,,,,:～～,,,,;,，～,,,,,:,:,:～,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,!, ,,,,,:,,::,～, ,; ,,,:～,;:,,:,,::,～, ，,:，:,:;,;,,～:;,,,～;:～,;,,::,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,::～:;,,:～,,,,:;:,,:,,;::,,;;:,,,,::,:,:,,～,,～,,,～,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,, ,!!,;,～,,:,;,,,,:,,,:, ,::,:,,,::,,,～, ,,,,; ,,,,:～～,,,;;,,;,;,,:～;,,,～;,::,,,,:,，;, ,,,～,:, ,;,, :～,,:,,, ? ～,,;;～,,,;～,,:;,,:,,;,,;,,～;:;～,;～;,,,;,,,;,:,,;,, ～,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,! ,,,;;,～:;,;,,～;,,～;,,～,,:,,,～,;,,～,:～,;,;:～～;;:～,～;,,,～;,:,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,!!,, ::,,;,;,;,,,,;,,,～;,;,,,,,,:,:,,,,,,,,～,,:, ,;,～:,～,,,,,,:,;,,,:,;,,, ,;,,,,:,,,,, ,,,!,,,,,, ,,?, ,,～:;,,,;～,,:;,,::,,,～,:,～:,,,～:;,,,::,:;,,:,:,:::，;,;:,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ?,,～; ,:,,, ,,:,;:～,,,,,,,,: ,,，,,;～,,:;,,::,:::,,::,～, ,; ,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,!,, ,,::～～,,,,;;,,:,;,;:,;,,;:,～,;:,,:,,,,～,,:,,;:～,,～:～, ,;,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,!, ,～～～～～,,,,,,,,,;,;,,::,,:,,,:,,:,;,,:,;,,,,,,,,,,, ,,,,, ，;,:,,,,::,～,,;,,,:～,:,,:,;,:,;,,～,,:,,,,～,,～,:::,:;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,!,,,!! , ,,,,,,,,,,:,,，:,,,,,～, ,,:,;,,:,,,,::,:;,,,,,,:,,,: ,,上接第页,, :～;,:,,,～;,,,,,,～:～,,;,:,:,:～;,;,;, ,～,,,,:;,,:,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,! ,,,,,,,, :，，，,,,，，,,:,:,:,～,,,,,,，,，,,,:,,:,,，,,～,,,～，,,,,,,,,,,～,,,,,;,:,,,,,～, ,,,,, , ,,,,,，:，, :～～,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,;,;,:～,,,,;,;:;,,;,;,:，～,,,,～,,:;～:,,:～，,,,,::::～,,,,,,,,,,,,,,,,,,! ,, ,,,,,,,:～::,:,～,,:,,,,,,，,,,,:,,;,,,,，,,,;;,,,,～,,,:,，,,,,～～,,,,;,,,,，,,,,,,:,:,:～,,, ,,,,!, ,:,,,,,,:,,～;,;,,,;,,～,,,,,:;,,,:,,,～,,,,,;,,,,,～, ,,,,,,～;,,,;,,,:, ，,,:,,,;,,,,～::,,,: ,,!! ,,,,～,,;,,:,,:;:,:,,～～～:～:,;,,:,,,,，;:,:;:;,::,,:,;,;,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,!,!!,, ,:;,::,;,;,～;,,,;,::,,;:,～;;,,,,～:～;;,;,,～,,,,:;, ,;;,～,;,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,!!, , ,,,,～;:,,,～,::,,,,,:,,,,,:,,:,,,～;,:,,,,,,,::,，,,:,,,;,:,～::,,,:,,～,,,,;,,,,?,,,,～;,;,:,,:,, !!, ,,, ? ,;,;,～;,,,,,～;;,::,,;,,,,,:～～;～,,,;,:～;;,;,,～,,,,:;,;,:～;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,!! ,,,,,,, ,,,,,,,, ;,;:,;,,;,,,;～,:～:,,:,～,,,～,;,:～:,:,,～;～;～,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,!!! , , ;,:～;,,,,,,,,～;:,;,;,:～;,,,,,,,～;,～:～;:～;,～,,,,:;,,～;,,;,,,,:,;,:,; ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,!!, ,,,,,～;,,;,,～,:～;;,;,,～,,,,:;,,，～:;,,,～,,:::;,,，:,,,,,,,,,,,,,,,,, !,, ,,,,，;,:,,:,～,,:,:,;,;,,～,,,,:;,:～;,:,,,～;,,,～:～,,;,:,:, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,!!