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灯盏细辛注射液对大鼠大脑皮层神经元细胞存活率的影响

2017-11-29 6页 doc 20KB 32阅读

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灯盏细辛注射液对大鼠大脑皮层神经元细胞存活率的影响灯盏细辛注射液对大鼠大脑皮层神经元细胞存活率的影响 灯盏细辛注射液对大鼠大脑皮层神经元细 胞存活率的影响 中药药理与临床2007;23(5)l35 ~smutase(SOD),thecontentsmalondialdehyde(MDA)andglutathione(GSH)weyedeter minedbyspectrophotometryinbrainhomogenate ofmice.Results:JNLWEsignificantlyprolongedthesurvivaltimeofmice,enhancedt...
灯盏细辛注射液对大鼠大脑皮层神经元细胞存活率的影响
灯盏细辛注射液对大鼠大脑皮层神经元细胞存活率的影响 灯盏细辛注射液对大鼠大脑皮层神经元细 胞存活率的影响 中药药理与临床2007;23(5)l35 ~smutase(SOD),thecontentsmalondialdehyde(MDA)andglutathione(GSH)weyedeter minedbyspectrophotometryinbrainhomogenate ofmice.Results:JNLWEsignificantlyprolongedthesurvivaltimeofmice,enhancedtheacti vityofSOD,degradedthecontentsofMDAand raisedthecontentsofGSHinthebraininducedbyischemia?reperfusion.Conclusion:JNLW Ehasprotectiveeffectagainstcerebralischemia— reperfusioninjuryviaitsantioxidantactivity. KeywordsJasminumnudiflorumLindl;ischemia?reperfusion;antioxidantactivity 灯盏细辛注射液对大鼠大脑皮层神经元细胞存活率的影响 张静,盛艳梅,张艺 (成都中医药大学,成都611137;成都医学院,成都610083) 摘要目的:探讨灯盏细辛注射液外对大脑皮层神经细胞存活率的影响.方法:利用 细胞培养技术,M1Tr法检测灯盏细辛 注射液对细胞生长的影响.结果:与空白对照组比较,灯盏细辛含量在75, 37.5mg/ml时,其吸收值均明显增加,且有一定的量效 关系.结论:灯盏细辛注射液体外能够促进大脑皮层神经元细胞存活. 关键词灯盏细辛注射液;大脑皮层神经元;细胞培养 药理研究表明,灯盏细辛注射液具有舒张脑血管,增加脑 血流量,改善微循环,抑制血小板聚集,降低血黏度,促进纤溶活 性,拮抗脂质过氧化,清除自由基等作用,临床用其治疗缺血性 脑血管病具有良好效果.目前,对于其治疗脑血管疾病的神经 保护作用研究较少.本文对灯盏细辛注射液对大脑皮层神经 细胞保护作用进行研究. 1材料与方法 1.1试验药物灯盏细辛注射液,由云南生物谷灯盏花药业 有限公司提供,批号:20050203,浓度相当于0.3g生药/ml. 1.2动物SD乳鼠(出生1d内),由成都中医药大学实验动 物中心提供,合格证号:川实动管第11号. 1.3试剂和仪器胰蛋白酶,?型胶原酶,胎牛血清(Gibco公 司),多聚赖氨酸,DMEM高糖培养基,四甲基偶氮唑盐(Sigma 公司),其余试剂均为国产分析纯.超纯水仪(Millipore);二氧 化碳培养箱(Thermo3111);超净工作台(苏净集团安泰公司); 倒置显微镜(日本OlympusOpitical公司);ZS-2型酶联免疫检 测仪(北京新风机电技术公司) 1.4方法 1.4.1大鼠大脑皮层神经细胞培养l1.2J 铺板:取96孔板,每孔加入0.1mg/mL多聚赖氨酸50, 振荡均匀,室温静置过夜,备用. 制备细胞悬液:将乳鼠断颈处死,75%酒精消毒,无菌条件 分离大脑皮层组织,尽量除去脑血管膜,置人冰Hanks液中漂洗 2,3次.将所获组织剪成1mm组织块,用0.125%的胰蛋白 酶+0.05%I1型胶原酶37?下消化,35min后加入培养液终 止消化,用70txm细胞筛网滤过.将滤液1000rpm离心10 min,弃上清液.加人完全培养液(900ml/LDMEM高糖培养 基,100ml/L胎牛血清,L?谷氨酰胺0.45g/L,NaHCO3g/L, HEPES5g/L,青霉素1X10U/L,链霉素1X10U/L),吸管吹 打使之分散均匀制成单细胞悬液.计数并调整培养液量使每 mL含1X10个细胞. 1.4.2接种培养和药物加入将细胞悬液接种于经包被的96 孔板中,每孔100培养24h后加入阿糖胞苷以抑制非神经细 胞生长,以后每2d半量换液,第6d全量换液,每孔加入培养液 l50,同时分别加入培养液(空白对照组)和浓度梯度的受试 药物(均设5个剂量组,成倍稀释,起始浓度为母液)各50l, 继续培养. 1.4.3M1Tr法检测灯盏细辛注射液对细胞存活的影响加入药 物培养1d后,每孔加入M1Tr液(四甲基偶氮唑盐,5me/rIl1)50 l,继续培养4h后,去上清液,PBS液漂洗2次,每孔加入二甲 基亚砜(DMSO)150,充分振荡,室温静置10min,用酶标仪于 492nm波长处测定吸收值. 2结果 2.1形态学观察倒置相差显微镜下观察,大脑皮层神经细胞 培养约4h开始贴壁,贴壁后的细胞呈圆形.24,48h细胞开 始伸出长短不等的细小突起,加入阿糖胞苷后见少量细胞溶解 坏死.72h后部分细胞伸出典型突起且少数突起相互连接,细 胞呈圆形或多边形生长.6d后细胞胞体明显增大,四周光晕 明显,突起多而粗大. 2.2NSE免疫组化染色检查胞膜完整的细胞中大部分为神 经元特异性烯醇化酶阳性染色细胞,表明存活细胞中大部分为 神经元细胞. 2.3大脑皮层神经细胞活性测量M1Tr法测定结果见表1. 裹l灯盏细辛注射液对大脑皮层神经细胞存活率影响(i?s,n=6) 与对照组比较?P<0.05,??P<0.01 136中药药理与临床2007;23(5) 3讨论 已有文献报道灯盏细辛具有视神经保护作用,但其对大脑 皮层神经元的保护作用尚未明确.本次实验研究发现,灯盏细 辛注射液多个浓度均具有促进大脑皮层神经细胞存活的作用, 其具体作用机制有待进一步探讨. 参考文献 1DildyJE.LeslieSW.Ethano1inhibitsMDA—inducedincl~asesinfree intracellularCaindissociatedbraincells.1}rainRes,1989;499(4): 383,387 2WuJunfang.ZhangJuntian.Antagonisticeffectofnel'cega'owthfactor onneuronalinjuryinducedbyhypoxiainculturedce~bmlcerticalneuronsof rats.ActaPhamacologiaSinica,1999;20(2):47,51 田基黄对人肝癌细胞HepG2增殖的影响 林久茂,王瑞国,陈旭征,赵锦燕 (福建中医学院中西医结合研究院,福州350108;福建中西医结合研究院,福州350108;福建中医学院药 学系,福州350108) 摘要目的:探讨田基黄对人肝癌细胞增殖的影响.方法:体外培养人肝癌细胞株HepG2,用M1Tr法和流式细胞术(FCM) 检测田基黄提取物及其含药血清作用于HepG224h后的细胞增殖情况.结果:MTr法结果表明,田基黄对HepG2增殖有抑制作用; FCM检测表明,田基黄阻止增殖中的HepG2进入S期.结论:田基黄能有效地抑制HepG2细胞增殖,提示阻滞细胞周期,抑制细胞 增殖可能是田基黄治疗肝癌的一个机制. 关键词田基黄;肝癌;HepG2;细胞增殖;细胞周期 田基黄具有清热利湿,散瘀止痛,消肿解毒的功效.现代临 床用于治疗原发性肝癌,其作用机理不详.本文研究了田基黄 对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响,现将结果报道如下. 1材料与方法 1.1试验药物田基黄购自福建中医学院国医堂医院,批号: 060410,经福建中医学院中药鉴定教研室鉴定为藤黄科金丝桃 属植物地耳草HyperieumjaponicumThumb的干燥全草.田基 黄制成含生药2g/ml的提取物,提取物经微孔滤膜过滤除菌, 于4T:保存待试;含药血清的制备:SD大鼠12只,体重140, 180g,雌雄各半,随机分为2组(即含药血清组,空白血清组), 按1ml/lOOg体重灌胃给药,连续7d,第7d给药后1h采用安定 :氯胺酮(1:1)按0.1ml/lOOg体重腹腔注射麻醉,腹主动脉采 血,于4?3000rpm离心10min,分离血清.合并同组血清,56? 灭活30min,于.20?保存待用. 1.2动物与细胞株清洁级SD大鼠,上海斯莱克实验动物有 限责任公司,许可证号:SCK(沪)2003-0003.肝癌细胞株 (HepG2),购自南京凯基生物科技发展有限公司. 1.3试剂与仪器RPMI1640培养基于粉,GIBCO公司;胰蛋 白酶(trypsin),Hyclone公司;胎牛血清(fetalbovine8eiq.1m, FBS),杭州四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑蓝 (methylthiazolyltetrazolium.M1Tr)干粉,Sigma公司;细胞周期 (DNA)检测试剂盒,BD公司.ELX800酶标仪:BioTek公司;流 式细胞仪:BeetonDickison公司;二氧化碳培养箱:德国Heraeus; ?基金项目:福建中医学院科研基金(X20040019) IX70荧光倒置相差显微镜:日本OLYMPUS. 1.4方法 1.4.1细胞培养将人肝癌细胞HepG2置于含10%热灭活 胎牛血清(FBS)的RPMI.1640培养液中,于37?5%CO2饱和 湿度的细胞培养箱中培养. 1.4.2MTr法测定细胞增殖取对数生长期的人肝癌细胞 HepG2,用0.25%胰酶消化并收集细胞.以RPMI1640培养液 (含10%FBS)制成细胞悬液,进行细胞计数,调整细胞密度为1 x10个/ml,接种于96孔培养板中,每孔100,常规培养24h, 使细胞同步化.设田基黄提取物组(终浓度分别80,40,20,10, 5,2.5mg/m1),田基黄含药血清组(终浓度分别为:20,15,10,5, 1%),空白血清对照组(终浓度分别为:2O,15,10,5,1%)和对 照组(直接加等体积的培养液)并加药.以上各组均设8个复 孔.继续培养24h,吸弃各孔中的液体,每孔加入0.5mg/ml的 M1Tr溶液100,37?孵育4h,然后吸弃各孔中的液体,加入 DMSO100/孔,振荡混匀,室温放置10min,使结晶充分溶解并 混匀,于全自动酶标仪570nm测定各组吸光度值(即OD值), 并按下列公式计算增殖抑制率:抑制率(%)=(对照组平均吸 光度值一实验组吸光度值)/对照组平均吸光度值x100%. 1.4.3流式细胞仪进行细胞周期(DNA)分析将1×10 个/ml的人肝癌细胞HepG2接种于25ml的培养瓶中常规培养 24h.设田基黄提取物组(终浓度分别80,4JD,20,lOmg/m1),田 基黄含药血清组(终浓度为10%),空白血清对照组(终浓度为 10%)和对照组(直接加等体积的培养液)并加药.以上各组
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