RGDTNFα对肿瘤血管通透性及化疗药作用的影响(可编辑)

RGDTNFα对肿瘤血管通透性及化疗药作用的影响(可编辑) RGDTNFα对肿瘤血管通透性及化疗药作用的影响 兰州大学 硕士学位论文 RGD-TNF-α对肿瘤血管通透性及化疗药作用的影响 姓名:臧凯宏 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:高明堂;吴勇杰 20050501原 创性声明 本人郑重声明 本人所呈交的学位论文,是在导师的指导下独立进行 研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人己经发表或未发表的成果、 数据、观点等,均己明确注明出处。除文中已经注明引用的外,不 包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成 果做出重要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名叔机 , 日期关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属兰 州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定,同意学 校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版,允许论文被 查阅和借阅 本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索,可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本 人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时, 第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名 导师签藕拯咋期二兰州大学硕士学位论文 缩 略 词 表 缩写 英文名称 中文名称 肿瘤坏死因子人肿瘤坏死因子 新型重组人肿瘤坏死因子 肿瘤坏死因子受体 肿瘤坏死因子膜受体阿霉素 伊文思蓝 可溶性肿瘤坏死因子受体 肌肉注射 肿瘤增长率 抑瘤率 药物相互作用指数 兰州大学硕士学位论文 第一部分靶向肿瘤坏死因子 对肿瘤血管 通透性及化疗药物作用的影响 中 文摘 要 目的 探讨低剂量靶向肿瘤坏死因子 对血管通透性及化疗药作用的影 响。 方法 采用分光光度法测定肿瘤组织中伊文思蓝的含量,观察对肿瘤组织 血管通透性的影响 用荧光分光光度法测定肿瘤组织中阿霉素含量,观察对肿瘤组织中阿霉素含量的影响。用小鼠皮下移植瘤模型,初步评价。单用及与阿霉素合用的抗肿瘤作用。 结果 二对肿瘤组织血管通透性的影响 低剂 均可以增加肿瘤组织血管的通透性。与 对照组相比, 对肿瘤组织血管的通透性可分别增加 和 ,且实验组和对照组相比有显著性差异。在的 剂 范围内,对肿瘤组织血管通透性的增加有明显的量效关系。对肿瘤组织中阿霉素含量的影响 低剂量 可以增加肿瘤组织中阿霉素的含量。与对 照组相比, 对肿瘤组织中阿霉素含量可分别增加 ,且实验组和 对照组相比有显著性差异 。在的剂量范 围内, 对肿瘤组织中阿霉素的含量增加存在明显的量效关系。 低剂量 单用对小鼠移植瘤生长的影响 单用普通 和给药剂量为 ,有促进小鼠 移植瘤生长的作用。单用普通 和 肿瘤增长率分别 为和 单用 和 ,肿瘤兰州大学硕士学位论文 增长率分别为 和低剂量。对阿霉素抗小鼠 移植瘤作用的影响 普通 联合阿霉素,对小鼠 肿 瘤生长的抑瘤率分别为和 ,稍低于单用阿霉素 组的抑瘤 率 ,但差别无显著性 。 和与阿霉素合用的抑瘤率分别为和 两药相互作用指数 分别为 和 ,两药合用有明显 协同作用。 低剂量 单用对小鼠 移植瘤生长的影响 与对照组相比,单用普通和给药剂量为 可。 明显促进小鼠 移植瘤的生长。单用普通 和 ,肿瘤 增长率分别为和 。单用和肿瘤增长率分别为 和 低剂量 。对 阿霉素抗小鼠 移植瘤作用的影响 普通 联合阿霉素,对小鼠 肿瘤 生长抑瘤率分别为 ,与单用阿霉素组抑瘤率 接近, 差别无显著性 。 与阿霉素合用的抑瘤 率分别为值分别为和 ,两药有明显协同 作用,结论 低剂量能够增加血管通透性,提高肿瘤组织中阿霉素的含量,单用 低剂量可促进小鼠 移植瘤的生长,低剂量 与阿霉素合用 具有协同抗肿瘤作用。 关链词 肿瘤坏死因子阿霉素血管通透性抗肿瘤作用兰州大学硕士学位论文 一一 妙 七 纽 兰州大学硕士学位论文恤加 勿勿 兰州大学硕士学位论文仃 兰州大学硕士学位论文 研究内容 靶向肿瘤坏死因子 对肿瘤血管通透性及化疗药作用 的影响 对肿瘤组织血管通透性的影响对肿瘤组织中 含量的影响。 低剂量不同给药途径对 抗小鼠 皮下移植瘤生长的影响 低剂量单用对小鼠 移植瘤生长的影响 低剂量对 抗小鼠 肉瘤作用的影响 低剂最单用对小鼠 肝癌移植瘤生长的影响 低剂量 对 抗小鼠 肝癌作用的影响兰州大学硕士学位论文 研究背景 一、肿瘤坏死因子 的研究历史 对 的研究可追溯到多年前,当时发现,有些肿瘤患者在伴有细菌感染时, 可导致肿瘤的自发消退。这提示细菌感染和肿瘤的消退存在着一 定关系。许多学者试图 通过诱发机体感染来治疗肿瘤。 年 等人发现,给卡介苗感染的小鼠注射脂多 糖后,其血清中出现一种能使小鼠肉瘤细胞出血性坏死的因子,而这种因子不属于脂多 糖的成分。鉴于它的主要生物学活性是导致肿瘤细胞出血坏死,故称为肿瘤坏死因子 。自年肿瘤坏死因子这个概念提出以来,人们对 的结构、组成及作用等进 行了广泛的研究。 是一种生物学活性十分广泛的细胞因子,主要由巨噬细胞产生, 通过与细胞膜表面的相应受体结合发挥效应,其显著特征是能选择性地杀伤或抑制肿瘤 细胞根据来源不同可分为由单核细胞或巨噬细胞产生的 和由活化淋巴细 胞产生的 。目前研究认为, 在肿瘤治疗、病毒防御、免疫调节和炎症反应等 方面均具有广阔应用前景。由于发现早,抗肿瘤作用强,还参与各种生理和病 理过程的调节,是迄今为止研究最多的 家族成员。 二、 分子结构 基因位于人的第 对染色体上,含个外显子和 个内含 子,其基因产物是由 个氨基残基组成的前体,其中个氨基酸为信号肤。成熟的人 是肤, 分子量为 ,不带糖链。 。上两个半肮氨酸残基在单体间形成桥联,故天然是以双体或寡聚体形式存在。比较人与其它动物小鼠、兔、牛和猪等的发现,各 成熟型 一分子间的氨基酸排列约有 是相同的,其氨基酸组成相当保守,这 说明在种系发生过程中, 、在机体免疫防御体系中起着重要作用兰州大学硕士学位论文 三、。受体 有两种受体,分子量分别是和 在体内大多数细胞表面广泛分布, 主要分布于造血细胞和内皮细胞。两类受体胞外区同源性为 ,胞内区没 有同源性,提示两者介导了不同的信号转导途径。在不同细胞表面表达的数量差别 较大,但受体数量与细胞对 的敏感性不成比例关系。目前认为可能由于各种细胞 表达 存在着数目、亲和力、相对密度等方面的差异,使得 对各种细胞的作用 不同,由此表现出其功能的多样性。可介导不同的生物学活性,其中 可参与 活化 ,诱导凋亡,诱导 生成,介导炎症反应,促进成纤维细胞增 殖等 主要负责脚腺细胞的增殖,抑制造血和调节内皮细胞或中性粒细胞活性。 和 的生物学功能不是独立的,许多生物学活性是由二者共同完成的,如细胞毒性和肝脏毒 性等一经肿瘤细胞的识别、结合、内吞,然后进入细胞溶酶体。的 胞外区在特定的情况下可以脱落下来,形成可溶性受体不再介导信号转导,但仍能与结合。影响 形成的因素很多,如本身、和佛波脂等 对脱落的动力学研究表明【 脱落的起始阶段,脱落速度和数量与血清中 的浓度有线性关系,表明机体通过珍 制 的脱落来中和 但当 浓度高至一定水平时 ,血清中更 高的 一浓度不能再提高的脱落水平,从而使 和之间失去平衡 四、一主要生物学活性 一 的抗肿瘤作用 最明显的活性是可在体内或体外特异性杀伤肿瘤细胞。用提纯的天然或重 组对人或小鼠肿瘤细胞株和原代培养的人癌细胞进行体外攻击,结果 。对大 多数肿瘤细胞有细胞毒性或细胞生长抑制作用。的抗肿瘤作用没有明显的种属差兰州大学硕士学位论文 异性,一般认为与靶细胞的分化程度和组织来源无关一系一广谱 抗肿瘤生物制剂, 可用于肝瘤、肺癌、结肠瘤、直肠癌、子宫瘤、卵巢瘤、乳腺癌、骨髓瘤、成纤维细胞 肉瘤、白血病等的治疗的抗瘤机制十分复杂,目前认为 抗肿瘤机理可 能有以下几种 对肿瘤细胞的直接杀伤作用。 作用于瘤细胞表面的受体,通 过对细胞的识别、结合、内吞进入溶酶体,致溶酶体酶和蛋白酶类高度活化导致细胞死 亡。 引起肿瘤组织微血管损伤和抑制肿瘤血管形成,从而引起瘤组织出血、坏死。 除了对肿瘤细胞本身具有细胞毒性之外,它也能摧毁实体瘤周围的血管上皮组织, 并通过血栓形成,阻断肿瘤的血液营养供应,最终导致肿瘤出血性坏死、消退或消失。 目前,基因治疗肿瘤是十分活跃的研究领域。 二 一的抗病毒作用能抑制病毒复制,从而产生抗病毒活性。等研究发现,被人类免 疫缺陷病毒 感染的细胞能产生 。后者以一种自分泌方式来 调节或影响 在巨噬细胞内的表达和复制,其作用可能对爱滋病 的治疗有十分 重要意义。 三 对物质代谢的影响 作用于蛋白质、糖和脂肪代谢过程。使 蛋白质合成降低 促进组织细胞摄 取己糖,增加血糖浓度 同时通过抑制脂肪组织的低密度脂蛋白活性,减少脂肪合成。 但在急性期反应中, 作用于体外培养的肝细胞,可刺激大量急性期蛋白产生。 四 对心肌梗 缺血后再灌注的影响 心肌梗死是心脏性碎死的常见原因之一。近年来,国外学者发现。,在心肌梗死 病人的血清中 浓度显著升高,提示心肌梗死与浓度变化存在一定内在联系。 严重心肌梗死能导致单核细胞和巨噬细胞产生,并释放到血液中去。等 的实验证实, 。是心肌缺血再灌注损伤的重要调节因子。 兰州大学硕士学位论文 五 “在炎症反应中的作用与炎症反应密切相关,它与白细胞介素、白细胞介素被统称为“炎症细 胞因子” 不仅能诱发炎症反应,作用于多种炎性细胞, 而且对与炎症有关的凝血系统、纤溶系统也有重要调节作用。实验证明,人重组在体外能加强中性白细胞对脐静脉内皮细胞的粘附作用,并认为是诱发炎症反 应的主要细胞因子。 主要靶细胞之一是血管内皮细胞,它不仅能诱导改变内皮 细胞形态,促使血管内皮细胞释放一些细胞因子和炎症介质如前列腺素与白三烯等, 间接产生白细胞趋化活性,而且可增强多形核白细胞的吞噬作用,使之更易粘附、游走 和渗出。 六 毒副作用 的主要毒副作用 发热、寒战、无力、体重下降、低血压、消瘦等恶液质 表现,增加血管通透性引起血管渗出综合征,严重者可出现心律失常,肝肾衰蝎及中毒 性休克。所以,对肝、肾功能不全、低血压等患者要慎用。 五、展望 是具有较强细胞毒作用的细胞因子,对化疗不敏感的肿瘤仍具有一定的敏 感性,但由于全身应用抗肿瘤治疗时用量大、副作用多,限制了临床应用。目 前对的研究方向已集中于 一联合治疗、局部应用及制备突变体如导 向等方面。这些方法既可以增强的抗肿瘤作用,又能避免其毒副作用。兰州大学硕士学位论文 立论依据 早在世纪年代初,的基因工程产品就开始进行临床试验研究 但大量 临床资料表明,人一的毒副作用较大,在体内的半衰期短,低剂量 注射抗 肿瘤效果不显著 而给药剂量要达到治疗水平,已远远超过了人的耐受剂量。恶性肿瘤 的化疗药,由于其本身存在的药物毒性及抗药性问题等,限制了其疗效及应用 而肿瘤 的生物治疗又只能杀伤部分肿瘤细胞。因此,将化疗与生物治疗有效地结合起来,既能 提高生物治疗的效果,又可以降低化疗药物毒性。 “是迄今发现抗肿瘤活性最强 的细胞因子,所以 联合化疗药物进行抗肿瘤治疗是研究的热点之一。近年来, 以和为首的个临床研究小组分别对不能手术切除的级软组 织肉瘤病人和转移性黑色素瘤病人,用大剂量 联合抗肿瘤药物美法仑或者干扰 素,进行隔离性肢体灌流治疗,治疗效果分别达到了 和 。理论上,只要局部浓度达到一定水平,便可对肿瘤进行有效地治疗,而全身用药的最大耐受量为 有效剂量的尹。因此,在临床只能局部灌流给药。。对肿瘤血管 的损伤主要是作用于血管内皮细胞,由于 对正常内皮细胞的损伤,可引起低血 压等副作用,这也是全身给药出现严重毒性反应的原因之一。为了提高的 抗肿瘤活性,消除或降低其毒副作用,尽快将 应用于临床,国内外科学家进行 了不懈的努力,一方面是在对 结构与功能关系的研究基础上对分子进 行结构改造,获得一的衍生物 另一方面是将 、同另一个能与靶细胞专一 性结合的蛋白质或肤融合,构建融合蛋白,以增加其在靶细胞部位的浓度,从而起到增 强疗效、减少毒副作用的效果。 改造 的分子结构 分析 的空间结构是研究新型 一的前提。具有生物活性的其 空间结构是个单体以边对面形式形成的近似三角锥形的三聚体,结构与功能研 究表明,删去 端前 个氨基酸残基并不影响三聚体空间结构。相反,删去 端 个氨基酸残基的同时增加 端的碱性氨基酸,可以增强形成活性三聚体的能力,从而提 高的抗肿瘤活性。而 端的氨基酸具有高度的同源性,对该区域进行缺失改兰州大学硕士学位论文 造会引起的生物学活性明显下降。由于 端位于三聚体的内部,个单体巧位 的氨基酸相互靠得很近,这种空间结构的维持主要依赖于氢键和 疏水性相互作用,因此 增加端的疏水性氨基酸可以提高 的抗瘤活性仪 基于 结构与功能的关 系,对 端、 端的结构基因进行各种点突变,并获得了新型有效的衍 生物。新型 不仅可提高杀伤活性,扩大抗瘤范围,并能降低其毒副作用。 制备 融合蛋白 基于在体内半衰期较短、稳定性较差、对靶细胞的专一性不强等特点,许 多研究者将编码 基因与具有靶细胞专一性的蛋白基因通过中间接头或柔性手臂 连接成编码单一蛋白质的基因,构建融合蛋白表达载体并在大肠杆菌中表达,活性检测 证实这些融合蛋白既具有 。活性,又具有导向杀伤作用 根据肿瘤组织的生物学特性,肿瘤组织在生长过程中要不断形成新生血管以供给营 养,新生血管便成为抗肿瘤治疗的靶点。目前,利用噬菌体技术筛选出可针对肿瘤新生 血管内皮细胞的靶向肚有 与 两种多肤,分别称为和 可与新生血管的氨基肤酶亚基结合,可与新生血管的表达的整合素结合。研究 证明联合其他药物能在分子水平上抑制整合素 的活性整合素 在肿 瘤新生血管形成中起重要作用 ,进而引发肿瘤血管上皮细胞的解体和凋亡。本实 验所用的肿瘤坏死因子是通过蛋白质工程技术对天然人氨基末端和按基末端进 行缺失和置换,筛选并制备出的一种高活性、低毒性基因工程,命名为新型重组 人肿瘤坏死因子 简称,。在对 进行改造的基础上,采用重组技术将 的端与靶向肚进行融合,制备的靶向 可以特异性的与肿瘤 血管结合,降低的用量,减少毒副作用 本文将比较与普通 抗肿瘤活性。兰州大学硕士学位论文 研究方法与过程 一、 动物昆明种雌性小鼠,雌性小鼠,体重 ,由兰州大学实验动物中心 提供。 药物冻干重组新型导向肿瘤坏死因子, 支,比 活性为,由第四军医大学生物技术中心提供,?保存,临用前用生理盐水 稀释。伊文思蓝 为 公司产品,进口分装。阿霉素 深圳万乐药业有限公司生产,生产批号仪器 荧光分光光度计,上海精密科学仪器有限公司。 二、实验动物模型的制备 移植瘤模型的制备 昆明种小鼠,腹腔接种肿瘤细胞后 天时,无菌条件下,用注射器 针头 抽取腹水,加入 离心管内,加适量的生理盐水, 转分钟,离 心 分钟,倾去上清液,按一定比例加入 制成瘤细胞悬液细胞数, 接种于昆明种小鼠右前腋窝皮下,每只小鼠注射 ,即 个细脚鼠。 肝癌移植瘤模型的制备 。雌性小鼠,腹腔接种肿瘤细胞后 天时,无菌条件下,用 注射 器“针头 抽取腹水,加入 离心管内,加适量的生理盐水, 输 分钟,离心 分钟,倾去上清液,按一定比例加入 制成瘤细胞悬液细胞数 ,接种于 。小鼠右前腋窝皮下,每只小鼠注射 ,即个细胞 鼠。 三、实验方法 一 对肿瘤组织血管通透性的影响 伊文思蓝 是一种染料,静脉注射进入体内后和血浆白蛋白结合,形成大分子 物质,不易透过正常血管壁。但当血管通透性增大时,染料颗粒可以通过血管壁渗透兰州大学硕士学位论文 进入组织。根据组织中染料颗粒透过的量,可以间接判定组织血管的通透性。根据文 献报道,静注后,肿瘤组织中 的浓度最高。 动物分组荷瘤小鼠肿瘤生长至时随机进行分组,具体分组如下 组 阴性对照组 ?组?组 ?组十 ?组 十 ?组 组 ?组 ?组 荷瘤小鼠给药及肿瘤组织样品采集 取接种 的荷瘤小鼠,肌肉内注射 给药后 时,尾 静脉内注射鲍。给 后摘眼球充分放血,开胸,剪开右心房, 取 耐生理盐水经左心室进针,充分冲洗至肝脏呈灰白色、右心房 流出液无血色,迅 速剥取皮下瘤块。 肿瘤组织中 含量测定 取肿瘤组织,按肿瘤 提取液 丙酮 生理盐水 月 比例加入提取 液, 制备组织匀浆。匀浆 ?放置过夜。次日 转、离心 分钟,取上清 液,在分光光 度计 波长处测定吸收值。 二 一对肿瘤组织中含量的影响 动物分组荷瘤小鼠肿瘤长至 时进行随机分组,具体分组如下 ?组 阴性对照组 ?组?组叭 ?组 ?组?组 兰州大学硕士学位论文 ?组?组 ?组荷瘤小鼠给药及肿瘤组织样品采集 荷瘤小鼠肌肉内注射 ,给药后 ,腹腔注射。给 后 ,摘眼球充 分放血,开胸,剪开右心房,取生理盐水经左心室进针,充分冲洗至肝 脏呈灰白色、右心房流出液无血色,迅速剥取皮 下瘤块,?保存。 肿瘤组织中 含量侧定 ?肿瘤组织中 含量测定方法见论文第二部分。 ?肿瘤组织中 的含量测定 取肿瘤组织,按肿瘤 双蒸水比例加入双蒸水,制备组织匀浆,按 前述方法 测定肿瘤组织匀浆中 含量。 三 低剂量 不同给药途径对抗小鼠 皮下移植瘤生长的影 响 动物分组 动物接种后第二天进行随机分组,具体分组如下 ?组 阴性对照 ?组?组 ?组 ?组 十 ?组 ?组 ?组 十?组 十 组 十 组 十 组 给药方法兰州大学硕士学位论文 荷瘤小鼠 或 , 后隔日给 药 次,共给药 次。 观察指标 给药期间,定期测量肿瘤体积 ,按公式 长 宽 宽 计算瘤体 的近似体积,估计瘤重。阴性对照组肿瘤长至 以上,于给药后 处死动物,称 瘤重,按公式计算肿瘤生长抑制率 ,根据抑瘤率评价药物的抗 肿瘤活性。 阴性对照组平均瘤重 一给药组平均瘤重抑瘤率阴性对照组平均 瘤重 四 低剂量一对抗小鼠 移植瘤作用的影响 动物分组 动物接种后第二天进行随机分组,具体分组如下 ?组 阴性对照 ?组 ?组?组?组 ?组 ?组 ?组 口 ?组组组组 组 组 给药方法 动物接种后第二天进行给药,荷瘤小鼠或鲍 后 隔日给药 次,共给药 次。 观察指标 ?抑瘤率 测定和计算同前。兰州大学硕士学位论文 ?药物联合作用评价 联用抑瘤率 单用抑瘤率巩时,两药相互作 用指数 的计算公式为 体内治 疗实验, 为两药联用组与对照组瘤重的比值 或 是各药物单 用药组与对照组瘤重 的比值。当工 时,两药有协同作用 当 时,协同作用非常显著, 同时进行 检验。 五 。对抗小鼠 肝癌作用的影响 动物分组 动物接种后第二天进行随机分组,具体分组如下 ?组 阴性对照 ?组 ?组 ?组?组 ?组 ?组 ?组 组组组 组 十组 组给药方法 动物接种后第三天进行给药。荷瘤小鼠 或后 隔日给药 次,共给药 次。 观察指标 同实验四。 四、统计分析 用检验进行统计学处理。兰州大学硕上学位论文 研究结果与分析 一、结果 一。对肿瘤组织血管通透性的影响 肌肉内注射给药,随着一剂量的增加,可明显增加肿瘤组 织中 的含量见表 。统计结果显示,在 剂量范 围内,给药剂量与肿瘤组织中 的含量存在量效关系。可使肿瘤组织中 含量分别增加 和 ,差别有统计学意义 。 肌注 的剂量超过 吨,仍可提高肿瘤组织中 含量,但无明显的 量效关系。 表对肿溜组织血管通透性的影响 ,肿瘫组织提取上清液吸 肿瘤组织中含 组别 相对增加百分数 光值,士 斗 士士 士士士 士与对照组比 二 对肿瘤组织中含量的影响 实验各组肿瘤组织中含量测定结果见表。不同剂量的 与合用与单用组相比, 可不同程度增加肿瘤组织中的含量。在 的剂量范围内, 对肿瘤组织中 含量的增加存在明显 的量效关系。肌注可使肿瘤组织中 的含量分 别增加 、,差异有统计学意义。 给药剂量超过 兰州大学硕士学位论文也可增加肿瘤组织中含量,但不存在量效关系。 表 。对肿瘤组织中含 的影响士 ,组织组织中 组织提取上清液中 相对增加 组别 吸光值 含 浓度 士 士 土 士 土 士 与阿霉素组比, 三 低剂量 不同给药途径对抗小鼠 皮下移植溜作用的影响 结果见表 或 联合阿霉素隔 给 药 次,共 次,对 肿瘤生长的抑制百分率均比单用阿霉素组抑瘤率增加。 与单用阿霉素组比,和差别有 显著性 ,但不同途径给药作用强度无明显差别。 表 低剂 不同给药途径给药对抗小既皮下移植瘤生长的影响 动物数只 体重 组别 瘤重 抑瘤率 始 末 始 末 组阴性对照 组 肚 士 切之吕如刀 组 丰 组 , ,组助 组 士 牡组 , 甲 组 甲 组 甲士 士 组中 甲 士 组组 士和阴性对照比, 和阿霉素组,十才均为 切兰州大学硕 士学位论文 四 低剂量一对抗小鼠 移植瘤作用的影响 结果见表 ,单独给药时,剂量为的普通 和,均有明显促进 移 植瘤生长的作用。单用普通 和,肿瘤增长率分别为 和单用 和 ,肿瘤增长率分别为和 。随给药剂量的增 加, 促进肿瘤生长的作用也逐渐加强。 单用组的抑瘤率为 普通和 与合用的抑瘤率分别为和 ,两药无 协同作用。与合用的抑瘤率分别为 和 。两药协同作用显著,值分别为 和 表 低剂量对抗小鼠 移植瘤作用的影响 、。 , 动物数只 体重 瘤重 抑瘤率 。。 班力 刑互 , 、 ,。、 七 上, ‘户夕 姑 木 阳 木 士对照组士 名士 注士石士 士 土 土 士士 士 士土 土 士 士 土 士 土 石 】 士和对照组比, 和阿霉素组,均为 和 、均 五 对抗小鼠肝癌作用的影响 结果见表。单用 或 ,可明显促进小鼠 移植瘤的生长。单用普通和 肿瘤增长率分别为和 。单用 和,肿瘤增长率分别兰州大学硕士学位论文 为 和 低剂量对肿瘤生长无明显影响,高剂量 可明显促进肿瘤的生长。联合阿霉素 隔日 次肌肉内注射,共 次,对 肿瘤的抑瘤率分别为和 ,单用阿霉素组抑瘤率为 ,两药无协同作用。 联合阿霉素对 肿瘤生长的抑制百分率 分别为 和 ,两药协同作用显著, 值分别为 表 “对抗小鼠 肝癌作用的形响 动物数只 体重 抑瘤率 组别 荆 瘤重 始始 末末 始始 末末 二 对照组 士 士 士上 之 士 士 勺士 刃月 ”士月 } 士口 白 已 己 丹 土 台 功 丹 石 士而 西 士丹 士士 卞 石士 和对照组比 和阿祥素组, 均为 兰州大学硕士学位论文 二 分析讨论 化疗药物要到达实体瘤中的肿瘤细胞,必须先通过血管壁,进入肿瘤组织血管内, 最后扩散进入肿瘤组织间隙。然而,肿瘤血管组织是没有规则和不完善的,有些实体瘤 的发生本身就是在缺氧情况下选择性克隆产生,远离血管组织,所以化疗药物很难预期 到达肿瘤组织并发挥作用。因此,增加化疗药物渗透进入肿瘤组织,提高化疗药物的治 疗效果,减少化疗药物在临床应用的毒副作用,在临床治疗中具 有十分重要的意义。对。的研究证明,可以损伤血管内皮细胞,改变肿瘤血管的通透性以及组织间 隙压力,的这些作用有利于化疗药物渗透进入肿瘤组织。临床实践已证明, 大剂量 与化疗药 美法仑联合应用,对不能进行手术的肉瘤病人进行隔离 性肢体灌流治疗,取得了显著的治疗效果。但由于 药理作用广泛,全身用药的 最大耐受量是有效剂量的 ,故临床全身用药会引起严重的毒副反应。 外源性 可诱导机体产生负反馈机制,使细胞膜表面的脱落,形成可溶性 肿瘤坏死因子受体 。可以中和外源性。以防止 与细胞膜 表面的结合,从而保护机体免受外源性引起的毒副作用,但同时也降低 了的抗瘤活性。当给予大剂量时, 不能完全中和 ,因此只 有应用大剂量才能产生抗瘤效果。肿瘤靶向治疗是提高肿瘤治疗效果的一条重 要途径。利用可与肿瘤血管表面表达的整合素靶向性结合的特点,将 与血 管靶向肤结合形成一是应用进行抗肿瘤治疗的新策略。低剂量 与肿瘤血管特异结合,在发挥抗瘤活性同时可防止因大剂量应用 “引 起的毒性反应 其次,应用低剂量可以防止诱导机体产生负反馈机 为验证一是否具有预期的抗瘤活性,我们首先观察了 对肿 瘤血管通透性的影响。实验结果显示,低剂量 均可兰州大学硕士学位论文 增加肿瘤血管的通透性,最佳剂量为给药剂量超过,对肿瘤组织血管通透性增加的效果较差。此结果可能与在体内诱导产生负反馈机制有关,即,的剂量超过一定 剂量时可刺激机体产生 ,中和外源性 ,导致对血管通透性的作用 降低。给药剂量为 的 一对增加肿瘤组织血管通透性存在 量效关系。 为研究低剂量 是否可通过增加肿瘤血管的通透性,促进渗透进 入肿瘤组织,我们考察了低剂量 一对肿瘤组织中含量的影响。实验结 果显示,低剂量的与合用与单用相比, 可以明显 增加肿瘤组织中的含量,最佳剂量为 增加肿瘤组织血 管通透性的最佳剂量为。出现以上结果的原因是由于化疗药物渗透进入肿 瘤组织不仅要受到肿瘤组织血管通透性的影响,而且还会受肿瘤组织间隙压力、血流速 度、肿瘤血管表面积等其它因素的影响。 单用 或 可明显促进 与 肝癌移植瘤 的生长,证明低剂量 或对不同肿瘤的生长存在不同影响 低剂量 促进肿瘤生长的作用可能与增加肿瘤血管通透性有关。低剂 量可增加肿瘤组织血管通透性、降低肿瘤组织间隙压力,促进了肿瘤组织 的营养供应 另外,肿瘤血管通透性增加是肿瘤组织血管形成的条件之一,增加肿瘤血 管的通透性有利于肿瘤新生血管的形成,进而促进肿瘤的生长。有文献报道, 万 连续给药可抑制肿瘤的生长。说明 给药剂量不同、给药方 式不同,可以发挥不同的作用,低剂量 主要与肿瘤血管表面的受体结合, 而与肿瘤细胞表面受体结合相对较少,因此低剂量主要引起肿瘤血管内 皮的损伤,增加肿瘤血管的通透性,对肿瘤细胞无明显的杀伤作用。大剂量 既 兰州大学硕士学位论文 可以与肿瘤血管表面的 结合,又可以与肿瘤细胞表面的 结合。与 肿瘤细胞表面的 结合,可诱导肿瘤细胞的凋亡。因此低剂量可促进肿瘤 的生长,大剂量有抑制肿瘤生长的作用。 低剂量 与阿霉素合用有明显的协同抗肿瘤作用。其协同抗肿瘤机制有 以下几方面 低剂量 可选择性与肿瘤血管内皮细胞表达的整合素结合, 损伤肿瘤血管内皮,增加肿瘤血管通透,降低肿瘤组织间隙压力,促进化疗药物渗透进 入肿瘤组织间隙,从而增加肿瘤细胞中化疗药物的浓度。 。是一种细胞因子, 具有免疫调节作用,能够刺激和激活 细胞,从而加强机体自身的抗肿瘤作用。 与肿瘤细胞表面的 结合,诱导肿瘤细胞凋亡。但有文献报道 作用于内皮 细胞,可以诱导内皮源性白细胞粘附分子、炎性细胞因子、趋化因子、 类分子 及促凝血因子的释放,这些因子可以激活机体的炎症反应以及免疫反应,诱发血管内凝 血,引起血管闭塞和肿瘤灌流量减少,因而 反复给药后对肿瘤组织中化疗 药浓度的影响尚需阐明。 低剂量 抗肿瘤治疗存在的问题 单用低剂量不但不能抑 制肿瘤的生长,而且在一定程度上可以促进肿瘤的生长,这对于 肿瘤的治疗是不利因素。 利用低剂量 可增加血管通透性的特点,将低剂量 与化疗药物 合用才可以发挥协同抗肿瘤作用。实验证明,不同剂量的 与化疗药物合用, 显示出不同的抑瘤作用,因此,应选择的最佳剂量与化疗药物联合应用。兰州大学硕士学位论文 研究的结论与意义 一结论 低剂量可以增加肿瘤组织血管的通透性。 低剂量可以增加肿瘤组织中阿霉素的含量。 单用低剂量可以促进 移植瘤的生长 单用低剂量可以促进 移植瘤的生长。 低剂量 与阿霉素合用在体内有协同抗鼠移植瘤的作用。 低 剂量肌肉内注射与腹腔内注射给药,两种给药途径对阿霉素抗肿瘤作用的 影响无明显差别。 二意义 是一种具有特殊药理作用的药物,它既具有细胞毒作用,又有免疫调节作用。 在临床应用有一定的副反应,但与细胞毒类药物比较,其毒性反应通常在短时间 可以恢复。单用的临床疗效有限,但作用肯定。实验证明低剂量靶向肿瘤坏死 因子与阿霉素合用有明显协同抗肿瘤作用,这对于指导肿瘤的临 床治疗具有十分重要的 意义。 利用重组技术将 与靶向肤 融合形成 ,低剂量 既可以防止机体负反馈机制的产生,提高治疗指数,又可减少的全 身用药剂量,降低毒性反应。 联用化疗药为肿瘤的药物治疗提供了新的思 路。兰州大学硕士学位论文 参考文献 峭 二 明 勿 闭 风 阴兰州大学硕士学位论文 徐春晓,肿瘤坏死因子受体生物学功能及其临床应用研究进展 微生物学免疫 学进展, 二 明田一兰州大学硕士学位论文 口刀勿 阮 勿刀, 兰州大学硕士学位论文陈建军,孙苗,卢芳 融合蛋白的基因构建及表达生物化学与生物 物理学报咖习 闭 民 赵宁,张英起,王增禄 新型基因工程人肿瘤坏死因子一 的临床前研究 细胞与 分子免疫学杂志张英起,赵宁,李波,刘磊,王增禄,朱宝娥,颜真应用基因工程方法制备新型重组人 肿瘤坏死因子一 细胞与分子免疫学杂志 骨彬,许建华 与抗肿瘤药物的协同作用洲〕抗肿瘤药物与肿瘤化学治 疗进展兰州大学硕士学位论文 第二部分三种荧光光度法测定肿瘤组织中 阿霉素含量的研究 中文摘要 目的 通过比较测定肿瘤组织中阿霉素 含量的三种荧光分光光度法,建立简便、 快捷的用荧光分光光法测定肿瘤组织中阿霉素含量的方法。 方法 分别采用正丁醉法、硝酸银法、酸性异丙醇法测定水溶液及肿瘤组织匀浆中 的含量,比较荧光光谱曲线、回收率、灵敏度。 结果硝酸银法测定瘤组织匀浆中的含量,背景荧光值低,线性范围 最低检出量 加,回收率超过 以上。酸性异丙醇法与正丁醇法测定瘤组织 中的 含量,背景荧光值高,回收率分别 和 结论 硝酸银法适合肿瘤组织中的 的含量测定,该方法准确、灵敏、可靠。 关键词 阿霉素 荧光分光光度法 肿瘤组织 含量测定兰州大学硕士学位论文 讨 兰州大学硕士学位论文 研究背景 阿霉素是广谱抗肿瘤药,抗瘤活性强,临床应用广泛。但其心脏毒性较大, 临床应用受到限制。 等 的实验证明, 及其代谢产物阿霉素醇、 阿霉素酮 均有心脏毒性。 等报道 与其它化疗药联合应用时可产生交叉耐药 现象,耐药细胞对 的摄取减少。建立一种快速、准确、灵敏的肿瘤组织内 浓度 的测定方法,对于研究 在联合用药时的组织毒性、交叉耐药性、药效的协同作用有 重要意义。虽然对 含量测定的方法报道较多,包括荧光分光光度法、放射免疫法、 色谱法,但符合灵敏度高、回收率高、可测定肿瘤组织中 含量的方法甚少。由于缺 乏方法的比较研究,在选择方法时常不易掌握其灵敏度、回收率等,难以预测方法的可 行性。 本身具有天然荧光,用荧光分光光度法测定 的含量,操作简单、快速, 但存在灵敏度低、杂质千扰等问题。多数文献报道的荧光分光光度法只用于血清中 的含量测定,组织中 的含量测定多采用 法,但 法样品处理过程繁琐、费 时、成本高。本文通过对三种荧光分光光度法测定肿瘤组织中 含量方法的比较,证 实用硝酸银法测定瘤组织中 含量的方法稳定可靠、杂质干扰少, 适合于肿瘤组织样 品中 的含量测定。兰州大学硕士学位论文 研究方法与结果 一、材料 药物与试剂 注射用盐酸阿霉素支,深圳万乐药业有限公司生产。 硝酸银,分析纯,北京化工 一生产,临用前配制。异戊醉、异丙醉和正丁醇,均为国产 分析纯。 动物与仪器 小鼠, 级,由兰州医学院动物中心提供,合格证号医动字 第 荧光分光光度计,上海精密科学仪器有限公司生产。 二、小鼠皮下移植瘤接种及肿瘤组织匀浆样品制备 选取小鼠,皮下接种小鼠肝癌 细胞个细胞 只, 接种后 处死小鼠,迅速剥取皮下肿瘤,用生理盐水冲洗组织至无血液残留,滤纸 吸干后准确称取 左右。不能及时测定的样品置 ?保存。实验时取瘤块按 或 加双蒸水,用玻璃匀浆器制成匀浆。 三、 的荧光分光光度法测定 参照国内外应用荧光分光光度法测定 的方法,笔者比较了三种 含量的测定 方法,即报道的硝酸银法、赵刚采用的正丁醇法及 等【采用 的酸性异丙醇法,具体方法如下 一 硝酸银法 荧光分析条件选择 用含 瘤组织匀浆,分别选取激发波长 ,以 ,扫描激发光谱曲线。最佳荧光分析条件为 激发波长, 发射波长 兰州大学硕士学位论文 荧光光谱测定取 水溶液或肿瘤组织匀浆 ,加入 的 旋涡振荡,然后加入预冷的异戊醇,振荡 离心, 吸取上清液测定最大荧光强度 。测定条件上操作在避光、 ?低温下进行。 几 汽 口 介 荷瘤小鼠给药及肿瘤组织样品采集 取接种的荷瘤小鼠,腹腔注射 ,给药后 时,摘眼球充分放血,颈椎脱臼处死,开胸,剪开右心房,取生理盐水经左心室进针,充分冲洗至肝脏呈灰白色,右心房流出液无血色,迅速剥取皮 下瘤块制备匀浆 取肿瘤组织匀浆,按上述方法制样、测定 二 酸性异丙醉法 取空白肿瘤组织加不同最的 ,用酸性异丙醉异丙 醇双蒸水 制成匀浆 或直接用酸性异丙醉配成不同浓度的 标准 溶液,旋涡振荡 避光放置 以沉 淀蛋白。 次日 离心 取上清液测定荧光值。测定条件 二, 三 正丁醉法 取样品肿瘤组织匀浆或 水溶液 ,加饱和碳酸氢钠溶液,正丁 醇 ,旋涡振荡离心 吸取上清液至试管中,加入 无水硫酸钠,放置。吸取上清液,测定其 测定条件兰州人学硕」学位论文 四、结果 一 硝酸银法 荧光光谱曲线 测定体系中加入双蒸水或组织匀浆后扫描背景荧光,在发射波长处硝硝酸银法的 背景荧光值最低 图 和图 。 约为 左右, 在处,偏离 的 。水溶液及组织样品扣除背景值扫描,荧光吸收值均接近 值 图 和图 。水溶液及组织样品中各加入 加,扣除背景值扫描得到的荧光光谱 曲线分别见图 和图在水溶液及组织匀浆中的 基本相同,表明测定干扰 在可接受范围之内。 图 硝酸银法侧定肿瘤组织中阿霉素含 的荧光图谱水溶液样品。不扣本底扫描水溶液样品,扣本底扫描 水榕液样品,扣本 底扫描 肿瘤匀浆样品,不扣本底扫描 肿瘤匀浆样品,扣本底 扫描 含 的 肿瘤匀浆样品,扣本底扫描