转TNF-α基因大肠杆菌培养条件的优化

转TNF-α基因大肠杆菌培养条件的优化 转TNF-α基因大肠杆菌培养条件的优化 生物技术 率有明显的影响.在菌液浓度O为0.2,0.4的两组实验 中,侵染时间对转化率影响不明显,转化率基本持平;而0.6 组实验,现为先增加后降低,在侵染时间30rain时转化率达 到最大值6.00%;0.8组则表现出整体降低的趋势.在小麦幼 胚愈伤组织的遗传转化中也有类似的结果报道-l. 本实验得到的优化组合为菌液浓度O=0.6,侵染 3OriOn., 0l234 预培养时间~e-eultivationd~8Iion(d) 图1预培养时间对转化的影响 Figure1FAt?eetofpie—cultivationdlll?~onOHefficiencyoftnmffonmtion 注:相同字母表示在0.05概率水平上差异不显着. T0te:thesa?l~ter啊d两目6cantlyIlodifferenceat0.115plHtylevel 静 龉 搂 辖 l0304560 侵染时间(min)I~eefiondmtion(mi~) 图2接种菌液浓度及侵染时间对转化的影响 Figure2FAt?eetofA.~onefac/emcelldensityandinundationdurationoneffi- ci~eyofbnsMTr-aii? 3讨论 在遗传转化研究中,如何筛选出转化体是一个重要环节. 本研究所用植物表达载体质粒pBI121携带有筛选标记基因 NPTlI,导入,整合并充分表达NPTII基因的小麦转化细胞, 具有对氨基糖苷类抗生素的抗性,在筛选培养基上能够生存 增殖;未转化的细胞则因不含NPI1II基因而被抗生素抑制或 杀死.根据本实验研究结果(表1),小麦在发芽成苗期即对应 于组织培养中的分化成苗期,对?比较敏感.依据小麦不同 基因型,Km有效筛选浓度范围在40,60ng/1,筛选培养时间为 20,30d.在实验过程中观察到,筛选培养10d,非转化苗就有 明显的白化表现或生长不良;筛选培养30d后仍为绿色生根正 常苗者,几乎不存在转化假阳性问题.但有些文献研究结果 显示,Km不适合作为小麦遗传转化的选择剂,与本实验结 果不一致.笔者认为,出现这一差异可能是由于小麦基因型, 实验起始外植体和操作细节,选择培养时期等各方面不同造 成的,其中基因型的不同是主要原因. 2008年18(2) 预培养培养基中加入适量的AS并进行一定时间的预培 养,能提高转化效率,可能因为AS是农杆菌介导遗传转化的 有效诱导物质,随着预培养时间的适当延长,外植体中AS含 量增加,侵染后AS诱导侵入愈伤组织的农杆菌Vir基因的表 达,进而增强了农杆菌对细胞的转化能力,提高了转化率;但 同时AS是一种酚类化合物,具有氧化作用,与愈伤组织长时 间直接接触,可使愈伤组织老化褐变,影响组织细胞活性,降 低转化效率. 农杆菌接种侵染的过程是农杆菌侵入植物组织并吸附在 植物细胞上的过程.菌浓度越高,侵染时间越长,农杆菌侵入 植物组织并吸附在细胞上的数量越多;但同时,植物材料浸没 在农杆菌菌液里,菌液环境(pH值,渗透压,氧气,菌的代谢物 等)对植物造成的伤害越严重,愈伤组织的存活率也越低.因 此寻找适宜的菌液浓度和侵染时间组合,是成功转化所必需 的.本实验得到的优化组合为菌液浓度O=0.6,侵染 30rain,认为采用此菌浓度和侵染时间对于外植体的转化及抗 性芽的存活都比较有利. 根据实验研究结果,农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤组织 遗传转化的主要因子,如筛选抗生素的选择压,外植体预培养 时间,接种菌液浓度及侵染时间等得到了优化,优化后的转化 条件是:胚性愈伤组织在附加AS200pmol/1的分化培养基上预 培养3d,在O=0.6的菌液中侵染30rain,在附加Km40, 6o,~1的分化培养基上筛选培养30d.小麦成熟胚愈伤组织 遗传转化主要因子的优化,为提高小麦遗传转化效率,建立高 效的转化体系奠定了基础. 参考文献: [1]IH,BeekerD,I~ttickeS.Molecularwheatbreedingbydirectgene tran~r[J].bca,1998,100:219—222. 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(1.SchoolofMarineScienceandEngineering,~snjin.UniversityofScience, a~jin300457一;2.SchoolofBioe~eeri.g, TianjinUniversityofScienceandTechnology,ri.m300457;InstituteofBotnny,(~aineeeAeMemyofSe ietaees,-喵100093,China) Abstract:Objeeave:InordertostimulatethegrowthandtheexpressionofTumorNecrosisFaet~一a(INF—a)in明胁co/i.fermentation conditionsofwansgenicE.co/iwereoptimized.Method:Singlefactorexperimentandoltll90nalexperi ment懈eonduet~tostudyfermentation conditiomsuchascompositionofculture,concentrationsofIVrGandfermentationtemperatureete.whi chaffectthegrowthofE.co/iandeXpl-eS- sionofTNF—a.Result:Byrangeanalysisandvarianceanalysis,theoptimumfemaentationconditionsw ereobtaineda8followed:the叠l 3%,thetryptone2%,theyeast4%,theNI-I4C11%,theconcentrationof?rFrGo.5mmol/L,l-evul~?vetime4h.initialpI-I7.0.fermentation temperature37?.Conclusion~Byoptimizatingfemaentationconditiom.thevieldofE.co/iandtheexpr essionettleieneyofTNF—acouldbe raised1.34foldand4.11foldrespectively,theyieldofINF—aincreased粕0.113%toO.479%,thathadbeenraised324%a8co,npal,=1 withthegiyeild. Keywords:TumorNecrosisFactor—a(TNF—a);Esdler/ch/acoli;ootlmizqtionofcultivation;geneen ~aeering TNF—cx(TumorNecrosisFactor—a)对肿瘤细胞有特异的杀司产品;酶联免疫试剂盒来自北京晶美生物有限公司. 伤作用,是迄今为止唯一能够直接杀死肿瘤细胞的天然因子,1.1.3仪器 可能成为极有前景的抗癌药.目前国内外大多从转TNF—aI4_ZQ—C空气浴振荡器,PHS一3D型酸度计,750紫外一 大肠杆菌中提取TNF—a纯蛋白以制备针剂.2001年,中国科可见分光光度计,眦一C台式高速冷冻离心机,/,ow~aeTMB&. 学院植物研究所的张芄芄等将plVID一489一IM穿梭表达载sicBIO—RAD电泳仪,江苏捷达凝胶成像仪,酶标仪(美国)等. 体转入蓝藻,提高了TNF在蓝藻中的表达效率”】,准备制成口1.1.4培养基” 服剂,减缓静脉注射引起的毒副作用.转化蓝藻时,大肠杆菌?LB培养基(1L):10g蛋白胨;10gNaCI~5g酵母提取物, 是中间宿主.然而,plVID一489一INF重组质粒在大肠杆菌中pH调至7.5左右. 表达量较低,只有3%左右,本研究试图从培养条件优化方面,?M9培养基(1L): 提高菌体量和TNF—a的表达率,以便制备TNF—a单克隆抗_(1)5*?溶液配制(1L):64gl~la2I--]PO4;2.5gNaC1;15g 体用于后续的检测工作. 优化转基因大肠杆菌的培养条件一般包括:不同的质粒, 培养液的成分,培养液初始pH值,培养温度等.异丙基一b— d一硫代半乳糖苷简称诱导剂IVrG,它对外源基因的表达有促 进作用,所以IVrG浓度也是优化培养转基因大肠杆菌的一个 重要条件J.但是针对不同的转基因菌种,最优的培养条件 会有所不同.对某些转基因大肠杆菌的优化培养已有相关报 道J,但是对转plVID一489一TNF大肠杆菌的培养条件的优 化还未见报道,本文选择了不同培养液,培养液初始DH,发酵 温度及诱导剂四个条件对转TNF—a大肠杆菌的培养进行了 优化,提高了菌体量及TNF—a的产率.此外,本文首次采用 了酶联免疫的检测方法精确地测定了TNF—a在转基因大肠 杆菌中的表达率. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1实验材料 重组大肠杆菌(含有质粒plVID一489一TNF,携带lcrI抗性基 因)和转空质粒大肠杆菌为本研究集体构建和保存,携带lcrI 抗性基因. 野生菌株:大肠杆菌(Escher~h/aco/i)DH5a购自TaKalta宝 生物有限公司. 1.1.2试剂 蛋白胨,酵母,琼脂等购自英国OXOID公司;葡萄糖, KI-I2PO4,MgSO,?7H20,NaC1等试剂均为分析纯,购白天津北方 天医化学试剂厂;抗生素(Sigma分装),福林酚试剂,SDS一聚 丙烯酰胺凝胶电泳(SOS—PACE)所用试剂为北京鼎国生物公 收稿日期:2Oo7—12一l9;修回日期:2008一Ol—lO 基金项目:天津市科委重点攻关项目(“蓝藻基因工程制备TNF—a口 服剂的研究和开发?,043l827l1) 作者简介:李丹(1982一),女,天津人,硕士生;通讯作者:施定基(1939 一 ),男,教授,博士生导师,研究方向:蓝藻基因工程,E—mail:cyano. shl@yahoo.corn.cn. KI”I2PO4;5gNI-I4C1; (2)侈培养基(1L):200ml5*M9溶液;2mllmol/LMgS04 溶液;2oIId20%葡萄糖溶液;0.1mllmol/Lca溶液,pH调 至7.5左右. ?侈+LB培养基(1L):10g胰蛋白胨;5g酵母提取物;5g NaC1;12gN啦}玎;3gKI-I2P04;lgNI-I4Q;lmllmol/LMgS04溶 液;lOml20%葡萄糖溶液,pH调至7.5左右. 1.2方法 1.2.1种子液的培养:选择LB作为种子培养液,初始pH为 7.5,加入kn(Ka.amycinSulfate,卡那霉素),使终浓度为25m# mL,20Of/rain,37?培养12h后即可用作种子液. 1.2.2基本培养基的筛选:转TNF大肠杆菌种子液在LB, M9,M9+LB三种不同培养液中进行培养,接种量为1%,37?, 20Of/rain培养12h,每组实验重复3次. 1.2.3正交实验优化培养基成分:采用正交实验表()对 培养液的碳氮比进行优化,对葡萄糖,蛋白胨,酵母粉和Na~ca 的质量百分比进行4因素4水平的正交实验,每个实验处理进 行3次重复,取平均值.通过对结果的极差分析,确定培养液 碳氮比的最优组合. 1.2.4单因素实验选择发酵条件:选用M9+LB培养液,采用 单因素实验测定不同诱导剂(ierc)浓度,不同诱导时间,培养 温度和DH值下菌的生长情况和TNF—a的表达情况,以菌体 产量高,TNF—a表达率高为原则确定最适培养条件,每组实验 重复3次,取平均值. 1.2.5细胞破碎:采用冻融法.破碎的菌体在12O00r/min离 心lOmin,沉淀菌体.菌细胞与缓冲液比率为每克加lOral缓冲 液.缓冲液组成:Tris—HC1(pH7.5)50mmol/L,ED?rA3.724o# L.NaC10.2mol/Lo冻融法破碎细胞,即在一18?冷冻,室温下 溶化.菌细胞破碎后在12O00r/min~心lOmin,收集上清. 1.2.6总可溶性蛋白测定:l~olin酚试剂法【s】,以牛血清白蛋 白为基准. 62生物技术 1.2.7SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳分析:收集菌体,裂解变性 后经SDS—PAGE(17%分离胶),考马斯亮蓝染色J. 1.2.8TNF蛋白含量检测:用双抗体夹心酶联免疫法 (ELISA)定量检测IINF—蛋白的含量.每孔(96孑L板)加入 已稀释的蛋白样品100d,按照hTNF—ELISA试剂盒说明书 再依次加入生物素化抗体和酶标抗体,用酶标仪测定0D的 值,按TNF—a含量占总可溶性蛋白的百分数来表示TNF— 基因表达率(%). 2结果与分析 2.1培养转基因大肠杆菌时三种培养液的比较 250ml摇瓶内分别装50mlLB,M9,LB+M9培养液,温度 37”12,初始pH为7.5,摇床转速200r/min,接种量1%.定时取 发酵培养液,测其.菌体生长情况如下图所示: 1?6 l_4 1.2 1 .8 0.6 0.4 0.2 eher/ehiacoli 结果表明,IB与M9+LB所收的菌体干重远远大于M9, 此结果与测得的大肠杆菌生长曲线一致,再一次说明了这两 种培养液更适于菌体生长.冻融法破碎细胞后,测得的蛋白 浓度是LB>M9+LB>M9,这是由于在M9培养液中含有大量 的无机盐,冻融破碎时,无机盐使得冰点下降,结冰慢,降低了 破碎效率.虽然LB培养的大肠杆菌总可溶性蛋白含量最高, 但是TNF—a的表达率却是最低的,因此,将LB与M9培养液 混合使用,与单独使用LB和M9培养液相比,既有利于菌种的 生长又促进了外源基因的表达. 2008年18(2) 将蛋白经SDS—PAGE电泳,结果如图2所示:在野生菌和 空质粒菌17kD的位置没有明显条带,而三种转基因大肠杆菌 在17kD位置上出现了目的条带,证明在17kD位置出现的三 条明显条带皆为TNF—蛋白条带.由图2可以看出,在点样 量相同的情况下,LB和M9+LB培养的大肠杆菌中含有的总 可溶性蛋白较M9培养的要多,TNF—量也相对较多.这是 由于LB和M9+LB培养的大肠杆菌的生长情况和细胞破碎情 况比M9培养的大肠杆菌的要好. 23456 图2不同培养液中转TNF—n大肠杆菌蛋白的电泳图谱 Fig.2ProteinelectmphoretogramoftransgenicEscherichiacolicultivatedin differentmedia Lane1:IJR培养转基因大肠杆菌蛋白(PmteinoftransgenicE.co/icu1. turedbyLB);”Lane2:M9+LB培养转基因大肠杆菌蛋白(Proteinoftrails. genieE.co/iculturedbyM9+IJR);Laile3:M9培养转基因大肠杆菌蛋白 PmteinoftrmmgenicE.co/iculturedbyM9;Lane4:MarkProteinmark;Lane 5:LB野生菌蛋白(PmteinofwildE.co/iculturedLB);lane6:LBpRL一 489蛋白(ProteinofemptyplasmidE.co/iculturedbyLB). 2.3M9+LB培养基的优化 采用()正交实验考察培养基碳,氮源组成对菌体生 长及TNF—a表达的综合影响,选出最优的培养基配方.正交 实验因素水平见表2,实验结果和极差分析实验因素对指标的 影响结果见表3. 表2优化培养基碳氮比实验的因素水平设计 „Fable2DesibmasofcarbonandnitrogenSOtlreelevelsinoptimummedia 由表3可以看出,各种营养源的组合对菌体干重和TNF— a表达量的影响是基本一致的,因此我们只需选择一种指标对 正交实验进行直观分析即可.本实验选择TNF—a的表达率 (%)进行直观分析,由极差分析可知,酵母粉对目的产物表达 影响最大,且确定第10组实验为最优的碳氮比,即3%葡萄 糖,2%蛋白胨,4%酵母粉和1%N}{4C1,在此配比下,细胞干重 达到1.288g/L,TNF—a产率为0.274g/L,TNF—a表达率为 8.15%.一 2.4诱导剂IPFG对大肠杆菌生长的影响 2.4.1诱导剂WIG浓度对大肠杆菌生长的影响 选用优化后的M9+LB培养液,培养至‰=0.6时,即 培养5h后,加入诱导剂I1,分别使其终浓度为0mmol/L, 0.3mmol/L,0.4mmol/L,0.5mmol/L,0.6mmol/L,0.7mmoYL,再培 养7h,分别测菌体干重和F—a的表达率. 图3表明,增加IVFG后对大肠杆菌的生长有一定抑制作 用,但是可以提高TNF—a的表达率,这是由于在促进外源基 因表达的同时,会影响菌体对营养元素的吸收,进而对菌体自 身的生长会造成影响.IPI?C浓度过高对表达的促进作用反而 下降,这是由于过高浓度的IVFG产生的细胞毒性严重抑制了 大肠杆菌的生长,从而抑制了蛋白的表达.因此,诱导剂的 2OO8正18(2)生物技术 最适浓度为0.5mmol/L.这时,TNF的表达率最高,是不加诱导 剂的1.29倍. 表3优化培养基碳氮比对大肠杆菌生长及1iF—a表达的影响 Table3Effectsofcarbonandnitmge~8OLlreelevelsorlBd1.co/iglll 竺二!竺 ABc. 菌率TNF- ( a % 3j~ ) 胖 IPTC浓度(tool/L) 图3IFrG浓度对菌体量及1iF—a表达率的影响 Fig.3EffectsofdifferentconcentmtlortsofIFrGorlaryweightsandthe- presslonofTNF—aofEacher/ch/aco/i 2.4.2诱导时间对TNF—a在大肠杆菌中表达量的影响 当菌体培养至=0.6时,加入I?G的终浓度为 0.5mmol/L,每隔1h取样,用ELISA测定TNF—a的表达量.结 果表明诱导4h后,TNF—a的表达量最高,为13.53%. 表4诱导时间对TNF—a表达率的影响 Table4Effectsofinductivetimeonexpressionof1—aofEs~/aeoli 诱导时间(h)1234567 1iF—a产率(L)O.268O.322O.395O.462O.415O.402O.385 TNF—a表达率(%)6.557.959.2313.5311.8611.0710.45 2.5温度对大肠杆茵生长的影响 温度影响基因工程细菌的生长速率和代谢途径,而且与 质粒的稳定性也密切相关,不同的宿主细胞和不同的质粒都 有不同的最佳表达温度和最佳生长温度.选取优化后的M9 +LB培养基,分别在32?,37?,42?培养12h.表5表明过低 的温度,如25?细菌几乎无法生长,温度较高对细菌的生长影 响不大,但是会使整个发酵体系变得不稳定,影响对数据的检 测,而且高温还会抑制质粒的表达.一般3o?,42?培养大 肠杆菌为宜,本研究结果指出,常用温度37?为培养大肠杆菌 的最适温度.这温度下TNF的表达率是32?的2倍. 63 表5不同温度对大肠杆菌生长及1iF—a表达的影响 Table5Effe~oftel婶IhI】resondIyweightsandthee】q商onofI—a of??ff 2.6培养液初始pH值对大肠杆茵生长的影响 选取优化后的M9+LB培养液,在不同DH的条件下测定 TNF—a的表达情况.表6表明偏酸偏碱均不利于大肠杆菌 的生长和外源基因的表达.特别是pH偏低更是如此,因为偏 酸不但影响菌体的生长,而且限制蛋白质的合成与表达,我们 的数据表明最佳pH为7.0左右,此时的菌体量和TNF含量均 是最高的. 表6不同pH对转基因大肠杆菌生长及1iF—a表达的影响 Table6Effe~ofpHinrrdia0ndrywelghtsandtheexpressionofTNF—a of?eo/i pH6.06.57.07.58.0 菌体量(L)0.9231.2041.2951.2881.201 1iF产率(L)O.242O.262O.295O.274O.262 TNF—a表达率(%)5.646.898.678.157.22 3讨论 重组DNA技术和规模培养技术的有机结合,使得原来无 法大量获得的重组蛋白可以大量生产,并成功地应用于科研 和医疗事业等[1.近些年,随着重组TNF—a针剂在临床上应 用的增加,对重组TNF—a的制备工艺日趋成熟,有关转TNF— a大肠杆菌培养的研究已有很多相关报道【4-6,但是,只是对 培养的一些基本条件如摇床转速,培养温度,初始pH值等进 行优化,而对培养液成分的优化尚未见相关报道.本实验首 次优化培养了含穿梭表达载体pND一489一TNF的大肠杆菌, 包括了对转基因大肠杆菌生长及TNF—a表达可能产生影响 的各个因素.此外,本实验首次采用酶联免疫的方法对大肠 杆菌中含有的TNF—a蛋白量进行了测定,准确地计算出TNF — a在大肠杆菌中的表达率,比起传统的凝胶成像仪的检测方 法更为准确,可信,并且此方法的建立也为TNF—a蛋白的分 离纯化提供了检测方法.在实验过程中发现,加入葡萄糖会 使大肠杆菌的发酵产生一定量的乙酸,乙酸对重组菌的外源 基因表达有一定的抑制作用,不利于重组大肠杆菌的培养,甘 油和葡萄糖一样可以起到碳源的作用?,若用甘油代替葡萄 糖,预期可以进一步提高TNF—a的产率. 通过单因素和正交实验的结果分析,确定了转pND一489 一 TNF的大肠杆菌的培养条件:M9+LB培养基成分的最优配 比为3%葡萄糖,2%蛋白胨,4%酵母粉和1%N-~cJ,诱导剂 I?G浓度为0.5m-~l/L,诱导时间为4h,培养液初始pH是7.0, 最优发酵温度为37?.采用此优化的条件进行了验证实验, 得到菌体干重是1.255?L,TNF—a的表达率为14.26%,TNF— a产率是0.479g/L,得到的菌体干重和TNF—a的表达率是没 有经过优化时的2.34倍和5.11倍,TNF—a产率提高了 324%. 参考文献: [1]张苋苋.1iF—a在鱼腥藻7120中的高效表达和对宿主光和作用 的影响[D].北京:中国科学院植物研究所,2001:37—40. 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DBP降解菌株?1的分离鉴定及其降解特性 周洪波,胡培磊,刘飞飞,谢英剑,李莹,任洪强 (1.中南大学资源加工与生物工程学院,湖南长沙410083; 2.南京大学污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏南京21oo93) 摘要:目的:从湘江底泥筛选分离出能够高效降解邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的菌株.对其进行鉴定和降解特性研究.方法: 采用DBP为唯一碳源和能源的无机盐培养基,通过富集培养,平板划线分离得到一株优势菌, 编号为XJ1.采用形态学,生理生 化,(G+C)too1%和16SrDNA序列分析进行鉴定.采用高效液相色谱测定菌株XJ1在摇瓶中 对DBP的降解能力,并进行DBP代 谢产物的分析和底物广谱性测试.结果:鉴定该菌株为胁加般-sp..摇瓶实验结果表明:最佳降 解条件为温度35?,初始 DH为7.O,转速15Of/rain;在最佳的降解条件下.40h之内DBP可完全降解.HPLC—Uv检测 出的中间代谢产物为邻苯二甲酸单丁 酯(MBP)和邻苯二甲酸(PA).底物广谱性实验表明菌株XJ1能够利用邻苯二甲酸二甲酯,邻 苯二甲酸二乙酯等邻苯二甲酸酯类 化合物.结论:菌株XJ1对DBP具有高效的降解能力,在处理含有邻苯二甲酸酯类化合物污 染的生物修复方面具有独特的应用 潜力. 关键词:邻苯二甲酸二丁酯;鞘氨醇单胞菌;分离鉴定;生物降解;生化途径;底物广谱性 中图分类号:Q93—331文献标识码:A文章编号:1004—311X(2008)02一OO64—04 IsolationandIdentificationofDBP—Degrad~StrainXJ1and Its~dationCharacters ZHOUHong—bo,HUPei—lei,LIUFei—fei,XIEYiI一iian?,LIYing?,RENHong—qi~g? (1.SchoolofMineralsProcessingandBioengineering,CentralSouthUniversity,0?410083,China; 2.StateKeyLaboratoryofPollutionControlandRe~amesReuseofChina,I)elmrtrm~tofEnvironmentSciences,NanjingUniversity,Nanjing210093,China) Al~ract:Objective:Adi—n—butylphthalate—dqadiI1唔 ba~eritanwasisolatedfromXian~iangRiversediment,thenthebactetltunwa8 identifiedanditsdc训 iIcapabili~wa8studied.Method:UtilizingDBPasthesolecarbonandenergy$OD_rO~,apredominatedbacterium,des- it~ated88strainXJ1,wasisolatedbyenrichmentcultureandstl~kplatemethod.ThesnXJ1wasidentifiedbasedon16SrDNA:quel1ce analysis,(G+C)mol%anditsmorphologicalandphysiologicalctmmcteristics..nlebiodegradationexperimentsDBPw黜performedinshake flasksanditsDBPdegradationcapabili~wa8measuredbyhigh~rformanceliquidchromatography,diversitydegradablesubstrateswasalso tested.1~mlt:StrainXJ1wasidentifiedasSph/ngomonassp.optimumconditionsforDBPdegradationbystrain?1wereinitialpH7.0,35 oCand~tatlonratebeing150dmin.In40h,DBPwasd1completelyundertheoptimumconditions,theDBPmetabolit~sdetectedby HPLC—UVwerleinono—butylphthalate(r~mP)andohth~teacid(PA).Diversityofdegradablesubstratesshowedthatphthalateeaterssuch88 dimethylphthalate,diethylphth~te,ete.couldbeusedbystain? 1.Conclusion:DBPcouldbedeeffectivelybysnXJ1,andthe strainXJ1hadspecialapplicationpotentialonbioremedlafionforphesterscontaminatedsite. Keywords:di一,l—butylphthalate;go,加n珊.p.xJ1;isolationandidentification;biodegradation 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是一种重要的增塑剂,在塑料制1材料与方法 品的生产,使用以及作为垃圾处理过程中很容易释放出来,从 而造成环境污染J.美国环保局,欧盟以及中国国家环境监 测中心均将DBP列为优先污染控制物0J.研究表明,邻苯二 甲酸二丁酯在自然环境中的完全矿化主要依赖于微生物的降 解l4】.目前以纯培养物进行DBP降解研究涉及到的微生物 包括R/udoeoccmrubber,Pseudomonassp.,M/crococcus sp.[7J ,DBsp.等,但尚未多见能高效利用和降解DBP的 鞘氨醇单胞菌属(.峨彻o?sp.)的细菌.本实验室从湖南 湘江底泥中分离到一株能以DBP为唯一碳源和能源生长的, 对DBP有较强降解能力的菌株XJ1,经初步鉴定为鞘氨醇单胞 菌属(Sp/ango,nonassp.)的细菌,并对该菌株降解DBP能力和 特性的进行了研究,以期为利用这种微生物处理含DBP的污 染物提供依据. 收穆日期:2啷一12—31;修回日期:200~一01—16 基金项目:国家自然科学基金项目资助(406460CI29);南京大学污染控 制与资源化研究国家重点实验室开放基金课题(Pcl6002) 作者简介:周洪波(19~9一),男,博士,教授,从事资源和环境微生物研 究,发表论文4o多篇,E—mall:zh~hb@mail.cst1.edu.?. 1.1材料 1.1.1实验材料 泥样来自我国湖南省长沙段湘江底泥,降解菌分离来自 所采泥样. 1.1.2试剂 D