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心肌肌钙蛋白I——心肌细胞损伤的特异性标志物

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心肌肌钙蛋白I——心肌细胞损伤的特异性标志物心肌肌钙蛋白I——心肌细胞损伤的特异性标志物 心肌肌钙蛋白I——心肌细胞损伤的特异性 标志物 198国外医学临床生物化学与植鞋芈舟册—塑99年弟生鲞箜—呈 r 心肌肌钙蛋白I——心肌细胞损伤的特异性标志物 ,, 吉林省临床检验中心(130021)魏景艳综述罗贵民丁家华审校'?, ———一tb 摘要奉文从生轴学噩竞疲学方面综逑心肌肌钙蛋白I的特性.井讨论算分离提地方法,单克隆抗体 的.I备,血清学检洲法及临床意义.二^ 关蕾饲心肌肌钎蛋白It单克隆抗体},心肌梗塞}骨骼肌损饬?钞H— ——,——, ————,一...
心肌肌钙蛋白I——心肌细胞损伤的特异性标志物
心肌肌钙蛋白I——心肌细胞损伤的特异性标志物 心肌肌钙蛋白I——心肌细胞损伤的特异性 标志物 198国外医学临床生物化学与植鞋芈舟册—塑99年弟生鲞箜—呈 r 心肌肌钙蛋白I——心肌细胞损伤的特异性标志物 ,, 吉林省临床检验中心(130021)魏景艳综述罗贵民丁家华审校'?, ———一tb 摘要奉文从生轴学噩竞疲学方面综逑心肌肌钙蛋白I的特性.井讨论算分离提地方法,单克隆抗体 的.I备,血清学检洲法及临床意义.二^ 关蕾饲心肌肌钎蛋白It单克隆抗体},心肌梗塞}骨骼肌损饬?钞H— ——,——, ————,一'Jl l 肌岛蛋白I(troponinI.Tn1)是肌蝣蛋白复合体TnI为单一多肚链1分子量随各亚型不同而异. 的亚单位之一,该复合体存在于心肌和横绒肌细胞Tnl有三种亚型.由不同基因编码.舟别定位于骨骼 的肌丝中,参与岛高子诱导的肌内收缩.6o年代,E一肌快肌,幔肌及心肌中.两种骨髂肌TnI(sTnI)舟子 ba8lIi和Kodama将这个由三种成舟组成的蛋白复量为2OkD.eTnI与sTnI的氨基睦序列有4o不 合体帝名为肌舒蛋白,随后人们从人及动物心脏厦同.此外,cTnl氨基末端有31个额井的氨基酸残 肌内中分离纯化出每种肌《蛋白亚单位,并对其性基.日此其分子量为24kDCcTnI在船儿及健康或 质皿氯基嚷序列进行分析.8o年代,Cummins等人疾病状态的成人骨骼肌中不达,目此具有高度心 甘次建立了人血清Tnl检测方法[1],90年代,巳研肌特异性啪.为cTnI作为心肌细胞损伤的特异性标 .I出抗心肌Tnl(cTnI)单克JiI抗体.使植测方法曼志物奠定了基础. 加完善并广泛用于墟床.对诊断心肌梗塞具有高度cTnI以两种形式存在于心肌细胞内,小部分 特异性.(约3)游商于胞浆中.为可洛性.大部分以结构蛋 的生铀学特性桨誉 肌岛蛋白复合体由三种亚单位组成,舟别为损伤时,游商的eTnl先释放入血.随着报傍加重,结 TnITnT,TnC.其中Tnl是肌原纤维ATP戽的抑合部舟的cTnI被降解而不断释放入血,导致血中 19i性亚单位.TnT是与原肌球蛋白结合的亚单位.cTnI持续升高. TnC是与岛离子结合的亚单位.舟剐以其各自的功早期,认为血中cTnl以游离形式存在.然而.近 抱调节肌细胞的收缩.来的研究表明.目心肌细胞损伤而释放八血的cTnI 5SDA的应用前量 如前所迹,对SDA植剥技术的研究巳取得可喜 的成绩.嗜热SDA的建立并与FP结合.使高曼数 虔,快速特异的DNA检测成为现实.最近. Mehspouyan辱人用SDA植测HIV.IRNA获得成 琦[I",速说明SDA可用于所有按嚷的控澜.总之, 虽热SDA尚有不如人意的地方.但随着其不断迅速 发晨-可I;c相信.SDA将成为临床疾病曲诤治和科 学研究的有用手段. 参考文献 1WalkerGT.FrmserMS.&hramJL.eta1.Nu— deicAddsRe8.199220(7):1691-6 2WalkerGT,N耐eaoJG.sDelaZ~,PA,eta1.Nude— icAci凼Res.1994'22(13):2670-7 3WalkerGT.NadeauIG.LirmCP.eta1.Clln Chem,1996~42(1),9-13 4WaIkerGT,NadeauJGamdLinnCP.MoiCell— Pr0b皓,1998t9(6)399-403 ?吉#大学群国家重点实验宣 5WaIterNG.JMolBiol,l995|254(5)856—68 6LittleMC,SearsPAandShankDD.M0jCelI Probes,1994|8(5)375—84 7ZwadykP.DownJA.MyersN,etal,JCIin Microbio1.1994|32(9)8140-6 8WalkerGT,IAnnCPandNadeauIG.Nucleic AcidsRes.1996|24(2)348.53 9WalkerGTandLinncP.dir-Chem.1996'4Z (10):1604—8 10SpearsPA.LinnCP.WOOdardDL.eta1.AriaI Bioehem,1997j247(1):130-7 1】SpargoCA,FralserMS.VanCIeveM+eta1. MolCel1Pr0be8,1996j10(4)l247—56 12DownJA,0'Conne[1MA.DeyMS+etaI_JClin Microbio1.1996|34(4)860.5 13IchiyamaS,ItoY,SugiuraF,eta1.JClinMi— crobiol,l997}35(12):3082—5 l4MehrpouyanM.BishopJE.OstrerovaN,etaI_ MolCellProbes,1997i11(5):337—47 (1998一lo_20收稿) 国外医学临床生物化学与检验堂!!!生整垫堑. 仅少量以游离形式存在,大部分以复合物形式(可能 为cTnI--cTnC)存在,最高峰时,血中总cTn2'癜度 可达游离cTnI5--12倍. 2cTnl的分离提纯 蕞初,人们制奋肌钙蛋白各亚单位主要分两步, 即先用硫酸铵盐折法提纯肌钙蛋自复合体,拈后再 用离子挂层析舟离纯化备亚基.这种方法所得产品 纯度欠佳,而且提取期长,易使各亚基被酶粪分解, 尤其是TnI反应蕞明显,利用TnI和TnC闽的钙离 子依赣性,sysh等人建立了亲和屉析法直接从组 织中分离纯化TnI,操作筒单,快速,产率高.Cure— rains在此基础上加以改良,使cTnI产串更高【90 年代,肌钙蛋白复合物的提纯方法又有了新的进展. 将抗cTnI的单克隆抗体与溴化氰活化好的 Sepharose癌结合制备亲和层析桂,用于提纯肌钙 蛋白复合袖,在曲内即可完成,然后再用常规的斑 或阳离子变换层析法纯化各亚单位],丰法所得 cTnI产率低于Perry及Cummins法,但其最大特点 是在操作简单,快速的前提下,葡时纯化出eTrLI及 cTnT两种甚至三种(包括cTnC)亚单位,优于常 规的两步法.这些都为研究cTnI的性质及检测方法 提供T有荆条件. 3eTnI免疫学特性 用cTnI免疫Balb/c小鼠.经细胞融畚可翩得 单克隆抗体(MAb),最多曾产生40株MAbs,经小 鼠腹腔接种后,仅28株于腹水中得到了相应的 MAbs,L~arue等人用这28株MAbs组成784个抗 体对,首次对cTnI的抗原图谱进行了研究,结果发 现这些MAbs至少识别cTn1分子上6个不周的抗 厚捷定簇.每个捷定簇都有各自的肽序列.其中8株 MAbs识别人eToI和sTnI两者,其抗原位点位于 eTnI羧基墙m,利用这一特性有人建立了阿时测定 eTnI和sTnI的酶免疫植测法,井所采用的两 个MAb8识别8TnI上位于121—129和16o一167 号氪基酸上的两十位点].当cTn1与其它两个亚单 位形成复合物时,其与相应MAbs的反应明显改 变.Katrukha等人用如对MAbs进行实驻,结果7 对困cTnC的加入而明显减弱与eTnI的反应.这主 要是由于游离cTnI的结构与复合橱(尤其与cTnC 形成的复合物)中的cTnI的结构不同.已经证明,纯 化后的cTn1分子中的--SH群的反应性与整个肌钙 蛋白复合曲中的不阿;TnC明显影响不同蛋白嫩酶 对TnI的磷馥化作用;TnC和TnT能够影响TnI 中Lys残基的化学修饰,结果导致TnI上的某些抗 原捷定簇缺乏或明显被修饰,使之不能与相应的 MAbs结合.阿时.由于TnC和TnT覆盖了TnI表 面的某些部分.也能阻止MAbs与TnI的结合嘲.园 此,在选择单克隆抗体时应特别注意.Katrukha等 人的实验也表明,EDTA的加入能先垒或部分解除 抑制作用,改善某些MAbs与eTnI的结合,甚至恢 复到最佳状态.这是由于EDAT能与ca蚪结合,从 而减弱了肌钙蛋自复合曲的结合强度,在缺乏c8蚪 对.cTnI—cTnc的表观解商常数可增如1000倍以 上啪.可见,EDTA的加入,可使某些抗原捷定簇恢 复到正常状杰,井与相应的抗体结合,园此,对于某 些MAbs,我们可在反应体系或标奉中加入EDAT 束达到挂测相应抗原的目的. 4血清cTnI检秘方法 1987年,Cummins首次建立7血清eTnI检 法,但由于其采用乡克隆抗体.园此敏感度及特异性 稍差,通常与sTnI有2的交叉反应,cTnI的最低 挂出量lOgg/L,而且检测时闽达24~36h_1J为了克 服这些缺点,Laru~等人用单克隆抗体建立了eTnI 酶免疫检测法,在30ram内即可完成.本法不仅操作 简单,快速,而且敏感度及特异性明显优于Cure mins法.其最低检出量力0.2~g/L,与sTnI无交叉 反应].也有人呆用盘的整合袖标记二抗.然后用荧 光嵌植测荧光信号的强弱,从而测定eTnI的音 量嘲.同样具有敏赙,快速,特异等优点.随着科学技 术的发展,高度敏博,特异的检测方法不断推出,采 用单克隆抗体与自动荧光酶分析法(Fluoroenzy- mometriemethod)相结奎,在10min内即可完成cT nI的定t挂剥叫由于惠性心梗(ANt1)精人常常需 及时抢救,囱此,许多学者用盎或 要尽快做出谬断, 硒标记单克隆抗体,与免疫层析技术相结合,用纸条 法定量或半定量控测eTnI.该法快速,敏晦,在精人 床前检剥,十几分钟即可完成. 当然,任何先进的检剥方法都必须建立在可靠 的抗一cTnI单克隆抗体选择的基础上.正如Ka— trukha所说,只有当血中的cTnI被难确测定时,cT nI做为AMI的标志物才是成功的.研究表明, AMI病人血中的cTnI大部分以复合橱(可能与cT— nC形成的复合物)形式存在,仅少量以游离形式存 在,而cTM的单克隆抗体多数不能与cTnI--eTnC 复合物结合或在高浓度EDTA存在时方可结合,这 可能就是以往文献所的eTnI正常值从0.2, 3.Igg/L不等的原园之一].园此,无论多幺先进曲 裣测方法,MAbs的选箨是至关重要的,当检测血清 总cTnI时,所用MAbs应既能与游离eTnI结音,兄 能与复合物形式存在的cTnl结合;而检测游离c n1时,所选择的MAbs应只与游离cTnI结合,而不 与复合物形式的cTnI结合. 8eTnI与AMI厦其它生化指标 AMI后平均4.5(士2.)h,血清cTnI开始升 高,5,9天后消失,无再灌注治疗病人,峰值出现在 12.2(士4.6)h,接璺再灌注治疗的病人,峰值出现在 290国外医学临床生曲化学与检验学舟册1999年第2殳鲞第5魍 15.8(士9.O)h.对于接受再灌注治疗的病人的第一 份标本,cTn1的敏感度明显高于肌硅激戽同功戽 (cK—MR)活力,舟剐为61和22}对于肾衰和 肌冉损伤病人,无一捌cTnl阳性,特异性送 190%]. 渗断AMI有许多生化指标,肌醺激酶(cK)与 CK—MB,肌红蛋白(Mb),cTnI等,当心肌细胞损 惰时,这些指标可于不同时阃呈不同程度的改变,由 于Mb,CK,CK--MB也存在于非心肌组织中,当骨 骼肌细胞受到损伤时,也呈不同程度的阳性结果,因 此.特异性不及cTn1.在慢性好误病人,cTnT骷呈 不同程度的阳性,而cTnI却不然,因此,在复杂的临 床情况下,cTnl的特异性仍优于cTnTI1I]. 为了证实cTn1特异性,Adams等人对215恻 研究对象进行舟祈.结果发现,CK升高较为普遍, 其中59的惠性骨骼肌损伤病人,78的慢性骨骼 肌损伤和马拉植运动员,38的慢性肾衰精人CK — MB升高,而cTnl无一啻i阳性,倪在AMI病人中 出现阳性结果,可见,cTnI对诊断AMI具有高度特 异性,是一个理想曲指标埘.WuAhn等人对Mb, CK--MB及cTnI的持续时阐进行了比较,结果发 现.Mb在AMI发病后o,6h敏感度最高,在6, 24h.三者敏感度接近.在48h,CK--MB仍有鞍高敏 感度.直到发病后72h,cTnl仍有高度敏感性,在72 ~150h,cTnI,Mb,CK—MB的敏感度舟别为70, 21和l8,可见cTnI具有较长的持续时闻,船床 诊断卑明显优于Mb,CKMB及cTnI具有较长的持 续时闻,临床谤断卑明显优于Mb,CK--MB及cT, nT各项指标,显示出独特的特异性,他们认为cTnI 对于AMI的回顾性谤断是一个有效的指标,应该考 虑用其取代CK--MB?l.Johannes等人的研究结果 也显示出无论在AMI早期,还是晚期,cTnl部是一 个高度敏婚面特异的指标[】. 6 在临床实践中,不但在心胜痰患,而且在骨骼肌 损伤或肾衰病人,排除AMI是非常必要的.cTn1以 外的其它生化指标,在骨骼肌损伤或肾衰时常伴有 不同程度的阳性结果,因此,很难实现这一目的 Ad~mm苷人的进一步研究表明,在挫伤性胸外伤的 病人,cTnI检测能及早鉴别是否伴有心肌损伤,对 伴随骨骼肌损伤的术中心梗病人,cTnI检囊i增加了 诊断的特异性,同时兄未降低敏感度CK—MB与 总CK的比值测定虽然也提高了诊断的特异性,但 却是以降低敏感度为代价曲,可见,cTnl是用于诊 断心肌挫伤的敏感而特异性的指标5=. cTnl的优越特异性是由于它的心肌特异性.大 多数存在于心肌的蛋白(包括CK--MB)存在于胎 儿骨骼肌中,而在胎儿时期表达的蛋白质,在对损伤 作出反应时常重新表达,迄夸为止,cTnI是在再生 的骨骼肌中不重斯表达曲唯一心肌损伤标记曲m]. 因此,对心脏手术的病人检孽icTnI能及时发现术中 发生的AMI. 参考文献 1CumminsB.AucMandML,CumminsP,eta1. AmHcartJ,1987;】】3:i333 2ZaninottoM,AltinierS,hchinM,eta【_Ciin Chem,i996;42:146O 3BoliorGS,PorterfineldD,VOSSEM,eta【.Clln Chem,】995I41:1710 4AdamsJEIII,SchechtmanKB,LandtY,etal CtinChem,l994{4l:l710 5KatrukhaAG,BereznlkovaAV,EsakovaTV, etaI.C1inChem,1997|43:1379 6KatrukhaAG,BereznikovaAV,Esakor&TV, eta1.&ochemMo}BiolTnt,1995;36:195 7LarueC,Defacque—LacqaementH.CalzolarlC. etal_MolImmunol,1992I29:271 8RamaD,CalzolariC,GrankerC,etaIhybrido ma,lg97:16l53 9LarueC.CalzoariC,BbrtinchantJP.eta1.Clin Chem,1993I39:972 l0BertinchantJP,LarueC,PerneI,eta1.Arch— MalCoeurVaiss(French),1996{89:63 11LiD.JiabJ,KefferJ.ClibChem.19g6I4Z1l4 l2AdamsJE.m,BodorGS,Davila,RomanVG, eta1.cfrculation,1993I88:l01 13WuAlanHB,FengYue]in.JohnHC.etal_ AnnCIinLabSci,1996}26}291 14JohannesM,NorhertG,BorisM,eta1.Cltn ChemActa.1996{245;19 15AdamsJE.III,Davila—RotrmnVG,BesseyPQ, etaI.AmHcartJ,1996;131:308 (1998—10—28收稿1999,Ol,15谚回)
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