【doc】海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗

【doc】海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗 海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗 2f/一z/叶, 植物1994,36(增刊)211--214 ActaBotanicaSiniea 4} 海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗 K+一ATPase活性和TTC还原的影 裴炎墅堑叠/王瑜宁 (西南农业大学,重庆630716> 关键词海藻糖一绿豆;ATP酶;冷冻}冷冻干燥 ,—一一——, 结. Mg抖, 响 夏玉先22, EFFECTSOFTREHALOSEONMg抖.K一 .l ANDTTCREDUCTIoNINFRoZENANDFREEZEDRIED SEEDL?GSoFMUNGBEAN PeiYan.DengRu-Fu,WangYu—ningandXiaYu—xian tsh?Agricult~a[Us4Chongqing630716) Abstract MungBean(Pkaseolusaureus)seedlinkstreatedwithtrehalosewerefrozenandfreeze— dried.MgK一ATPaseactivitiesfromthepurifiedprotoplasmicmembranesandthetetra- zolium(TTC)reductionfromthefreeze—driedseedlingswereinvestigated.Thefreeze-dried seedlingstreatedwithtrehaloseshowedhigherenzymeactivitiesthanthoseofthecontro1. Astheconcentrationoftrehaloseincreased,Mg?,K一ATPaseactivitiesandtheTTCre_ ductionwereincreasedtoo.At,30C.theMg,K一ATPaseactivitiesinfrozenseedlings wereabouttwicehigherthanthoseofthecontro1.TheresultsindicatedthattrehalOSeisa goodprotectantforthefrozenorfreeze—driedplantmaterials. KeywordsTrehaloze:Mungbean:ATPase:Freeze;Freeze—drying 海藻糖对稳定生物膜的结构与功能,提高生物对低温,脱水或盐碱等逆境因子的抗性 有特殊的作用.但前人的研究多以微生物,藻类和动物为对象,有关海藻糖对高等植 收稿日期t1993—05—03接受日期;19930728 *国家自然科学基盘资助课题. 镁 植物36卷 物保护作用的报道较少.本文研究在低温和脱水条件下,海藻糖对绿豆幼苗Mg",K ATP酶的保护作用和对其生活力的影响. 材料和方法 (一)绿豆幼苗的培养 绿豆(Plua~eolud")种子用0.1HgC1灭菌10rain无菌水冲洗后在灭菌珍珠岩 上发芽.取均匀一致的幼苗备用. (二)低温处理 将绿豆幼苗予叶节以下部分(2cm左右)放人海藻糖溶液中,从5,1o,20到 40糖溶液.由低浓度到高浓度逐次转移,在每个浓度中停留15rain,然后将材料置0., 一 10.,一20.和30下冷冻24h. (三)低温干燥处理 将经上述方法处理后的绿豆抽苗子叶节下部分放人真空干燥器中,以P.os为干燥 剂,抽气速度约60I.?rain,.真空度抽至15mmHg左右,立即将真空干燥器阀门关 闭, 置一10C下处理24h.上述处理均以未经海藻糖处理的为对照. (四)细胞质膜的纯化 主要参照Itellergren等"的方法进行.匀浆液为0.25mol/L山梨酵,5mmol/LMg- SO,1mmol/LEDTA—Na2,2Ommol/ITrisHCIpH7.2两相分离系统为DextranTS00 (Pharmacia产):PEG4000(日本产品)一6.3:6.3(w/w).以上相液u为提纯的质 膜组分,置一20c下保存. (五)Mg,KATPase活性测定 参照Hodges等的方法稍加修改取5O.经稀释后的质膜组分液,加入1mL ATPase活性测定液(3mmol/IATP30millol/LKC1,5mmol/LMgC12,40mtool/LTris— HCI,pH6.5).35?下反应30rain,加1mL20的三氯乙酸溶液中止反应,然后加1mL 2.5钼酸铵溶液(含1的抗坏血酸),35?保温40rain,640nm比色,测定反应液中的 无机磷含量. (六)TTC还原的擦4定 经低温脱水处理后的绿豆幼苗材料1O株,放入15mm×150ifflm平底试管中,加3 mL0.2的氯化三苯四氮唑(2,3,5triphenyltetrazoliumchloride,TTC,用50mmol/L 磷酸缓冲液pH7.5配制),黑暗下30?保温4h,蒸馏水冲洗后用滤纸吸干,加8mL乙酸 乙酯研磨.残渣再加8mL乙酸乙酯冲洗,合并两次乙酸乙酯抽提液,定溶至2OmL,530 nm处比色,每处理设3个重复. (七)蛋白质的测定 按Lowry等一的方法进行. 结果和分析 (一)海藻糖对冷冻处理后的绿豆幼苗细胞质膜Mg",K一ATPase活性的影响 经40海藻糖处理后的绿豆幼苗子叶节以下部分置于0.一10.--20.和--30.下冷 增刊裴炎等:海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗Mg,KATPase活性和TTc还原的影响213 冻24h,再分别纯化细胞质膜,测定质膜组分液中的Mg,K—ATPase活性(表1).从表 中可以看出.经海藻糖处理后.质膜上的MgK一ATPase活性均显着高于对照.一20C 处理时,对照和海藻糖处理的酶活性均比对应0c和一1O?处理的活性高.但一30C处理 时,酶活性均明显降低.这一结果和Hellergren等-9]的结果相近.一3OC处理后,经海藻糖 处理后的酶活性比对照高1.1倍左右,说明海藻糖有提高细胞膜对低温的抗性,具保护低 温冷冻条件下的质膜及膜上蛋白的作用. 表1低温处理后绿豆质膜Mg",K一一ATPase活性变化 Table1ActivityofMg,K—ATPasefrompurifiedplasmamembranesofmungbean seedlingsfrozenatdifferenttempertures(UnitofATPaseactivity:ntoolpi/mgprotein?rain) 处理温度Temperature(C) Trtm一 2O30 对照 Cont?【Z7744653.815.2 40海藻糖 40tt-ehaIo搴e464532645325 (--)海藻糖对冷冻干燥处理后的绿豆幼苗细胞质膜Mg,K十_ATPase活性的影响 绿豆幼苗子叶节下部分经海藻糖处理后,真空干燥并置于一10C下冷冻24h,然 后分别纯化各处理的细胞质膜,测定Mg",K一ATPase活性.从表2中可看出,低温干 燥后,不同海藻糖浓度处理的酶活性均明显高于对照.并且,随着糖液浓度的增加酶活性 也相应提高.当海藻糖浓度超过20后,酶活性提高的幅度减小.经4o海藻糖处理,冷 冻干燥后的绿豆幼苗其Mg,K—ATPase活性显着低于对应只进行冷冻处理的.但 与对 照相比,降低的幅度比较小. 表2海藻糖对冷冻干燥及冷冻处理的绿豆幼苗质晨Mg2,K-ATPase活性的彰响 Table2Effects0ftrehaloseontheactivitiesofMg".K一ATPaseinprotoplasm[cmembraneof freeze-driedandfrozenmungbeanseedlingsunder—l0? 处理一10C下冷冻干燥一10C冷陈 Tatt-oefttFreezedryingunder一10CF—under一10C 海藻糖淮度 CorJ~ntrationoftreIlarose()152040 一 酶活 bnmeactmty39.545.648.2463 (nmolpi/mgprotein?min) (--)海藻糖对低温干燥处理的绿豆幼苗ITC还原力的影响 用不同浓度的海藻糖处理绿豆幼苗子叶节以下部分,然后在一IO'C下真空脱水千燥, 24h后测定各处理的TTC还原力.以对照为100计算相对还原力.从表3可见,随着海 藻糖浓度的增加,幼苗的TTC还原力迅速提高,10的海藻糖处理,其TTc还原力是对 照的24倍左右.糖液浓度超过10后,TTC还原力增加速度减慢.TTC还原力广泛用于 植物细胞生活力的测定.表明海藻糖可明显提高低温干燥处理后的绿豆幼苗的生活力. 植物36卷 表3不同海藻糖浓度处理后冻干绿豆幼苗的TIC相对还原力 Table3TTCrelativereductionpower.ffreeze—driedmungbeanseedhng treate3Tlthdifferenttrehalo~econcentrations 海藻糖滩度TreMlv~seconeentrarian() 1551O TTC相对还原力-- TTCrelative1802 483们241325132661 power()_ 1)对照的OD铷=O023为l0OThex'alueofOD53=0083inthecontrolaslO0 讨论 Crowe等.认为,在冷冻干燥条件下,海藻糖对膜的ATPase活性和钙的转移功能 具有保护作用.Bhanda!等的实验结果表明.海藻糖是一种无毒而有效的抗冻保护剂.海 藻糖的抗冻机理主要是防止膜脱水破坏.MgK一ATPase是细胞质膜上的跨膜蛋白. Hellergren等认为冻害的原初作用位点很可能是质膜上的Mg,KtATPase.我们的试 验结果表明,海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗的Mg,K一ATPase有明显保护作 用,使冻干后的材料保持较高的活力,说明海藻糖是一种很有前途的抗冻抗脱水保护剂. 在卒试验中,一20"C下冷冻,膜上Mg,K~-ATPase活性高于0?和,10?的处理这一 现象也在Hellergren等的试验中出现.Hellergren等认为可能的原因之一是较高温度下非 离子激活的ATPase活性较高,导致本底增高带来的干扰. 参考文献 1BhandalISHauptmannRMWidholmJM.Trehatoseascryoprotectant/orfreezeprvati.?ofcarrotandtob8c一 ?髓PlatoPhysid1985.78:{3O一432 2CroweJHCroweLMJacksonSA.Preservationof~tructura]andfunctionalactivityi?lyophilizedsatcoplasmJc reticulum.ArchBixhemBdophys.1983.220:477--484 8CroweJHCrow~LM?PreServation.fmembranesinanhydrobiotic0rgasn】:Theroleoftreh幽se.Science1984. 4CroweLMCroweJH—ChapmannInteractionofcarbohydratesdrydipelmitophosphatidylcfl.u他^ B^BbophS,s1.98.5236289--298 5cr.eLMCroweJH,RudolphAat.Preservationoffrdriedlipo~ccnesbytretm]ose.ArchBioc hemBdophys 6HellergrertJ-Wlde,1]SLundborgTeto2,Frosthardine*sdeve~pmentinmsMvestrls. Theiwo[vementofaK tlm~tedMgdependentATPasefromputifie4pkT【皿 membrane~.fpine.Phy~fvlPlant1983.5矗:7,12 7HodgesTK,LeonardRT?Puciflcationofplasmamerabraneboundade~oslnetdph~sph 黼邶tafro山nttoo. Metk~sm1974.32392—4O5 8LowryOH—Rc~ebroushNJFarrALeg"ProteinmeasureH埘】 1withfoilnreagent.B/o/Chem.1851.】"孙5— 0竺~Ade]l苎LundborgT-狰锻炼和未锻炼的苏倍兰松树针叶纯化质膜的冰冻伤害一一结台有离子促进型ATP酶的厦膜是冻害的 最初部位吗?觅:刘祖祺王洪春犏.植物耐寒性及防寒技术.北学术书苗1990.1O8—113