电针对局灶性脑缺血成年大鼠神经干细胞增殖、分化的影响

电针对局灶性脑缺血成年大鼠神经干细胞增殖、分化的影响 电针对局灶性脑缺血成年大鼠神经干细胞增殖、分化的 影响 中国康复医学杂志, 年,第 卷,第 期 . 基础研究? 电针对局灶性脑缺血成年大鼠神经干细胞增殖、 分化的影响 陶 静 陈立典 薛偕华。 杨珊莉。 摘要 目的:观察电针对成年大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞增殖、分化的影响,探讨其治疗脑梗死的可能机制。方 法:采用线栓法制备大鼠 模型.应用/ 、/ 免疫荧光双标法观察再灌注损伤后第 、 、 天 时大鼠神经干细胞增殖、分化情况。结果: 缺血后第 、 、 天 个时间点室管膜下区、缺血边缘区均有阳性 细胞达,阳性细胞数在第 天达高峰;电针组第 天阳性细胞数高于相同时间段模型组 .;电针 组/ 双标阳性细胞数在 天高于相同时间段模型组.;电针组和模型组/ 双标阳性细胞 数在缺血后第 、 和 天差异无显著性.。结论:缺血损伤可诱发室管膜下区、缺血边缘区神经干细胞的增 殖,少量的新增殖细胞可以向神经元和星型胶质细胞分化:电针可以促进脑缺血后细胞增殖作用并可激发新增殖细 胞向星型胶质细胞分化,而对向神经元细胞分化则影响不明显。 关键词 大鼠;局灶性脑缺血;电针:神经干细胞 中图分类号: . , . , 文献标识码: 文章编号:?一 ? ? / ,,,.//, , : : , . :. 、 、 . ?// . : . . ? . . . /?尸? . . / . . :. ? . . , ; ; ; 有一定的调节作用 ,近几年逐渐成为研究的热点。 脑血管疾病是目前危害人类健康的主要疾病之 一 ,给家庭、社会带来沉重的负担。其中缺血性脑血 本研究通过观察电针对成年大鼠局灶性脑缺血后神 管疾病的发病率约占脑血管病 %】。因此,积极寻 经干细胞增殖、分化的影响。探讨其治疗脑梗死的可 找其有效的防治手段一直是现阶段医学界亟待解决 能机制。 的课题。有研究表明,针灸在缺血性脑血管疾病的 基金项目:国家自然科学基金治疗中占有重要的地位。以往这方面的研究主要集 福建中医学院 级博士,中在针灸对神经的保护机制上引。文献表明,局灶 福建中医学院附属第二人民医院 性脑缺血诱发内源性神经干细胞的增殖、分化,具有 通讯作者:陈立典福建中医学院附属第二人民医院, 修复损伤组织的作用 。有研究显示针灸在局灶性 作者简介:陶静,女,在读博士,主治医师 脑缺血后内源性神经干细胞的增殖、分化、修复方面 收稿日期:? ? ,. , . , . 材料与方法 . . 神经干细胞增殖的观察:采用标记的 . 主要试剂及仪器 办法。 模型合格的大鼠,给予/ ,每日 次,在 天、 天和 天 个时间点,相 溴脱氧尿嘧啶, 公司 ,兔抗 抗体 北京中衫生物有限公司 ,小鼠抗抗体 继以 . 、 %多聚甲醛 心脏灌 公司 、大鼠抗抗体 公司 , 注,取出大脑. %多聚甲醛固定 ? ,置于 ? 和 标记的二抗 北京中衫生物有限公%蔗糖溶液直至下沉,冰冻切片机切成切 司 、共聚焦显微镜公司 。 片。 . 实验动物分组及处理 脑组织切片以 .清洗, %室温 ,去除内源性过氧化物酶。为使变性,将 健康雄性 ?大鼠,清洁级,体重由上海斯莱克公司提供 。 只大鼠随 切片置 %甲酰胺/. , .枸橼酸 机分为 组:假手术组、模型组、电针组。每组各 钠 中, ?孵育 。洗涤后置, ?孵育 。以 .洗涤后,置 %正常血清中孵育 只。动物在造模成功第 、 、 、 、 、 、 天腹腔注射 / ,每天 次,问隔 ,最后一次注射 ,抗抗体 ?过夜。随后加入 标记 后处死动物:各组动物于再灌注第 天、 天和 的二抗,室温孵育 , . 洗涤后甘油缓冲 天 个时间点心脏灌注取脑。电针组穴位取患侧 液封片以共聚焦显微镜观 察、拍照。 . . 神经干细胞分化的观察:采用免疫双标荧光 曲池、足三里大鼠穴位定位参考《实验针灸学》 中 之定位方法 ,在局部消毒后,针具用华佗牌 号 技术。将经变性的组织切片, .洗涤, . 寸毫针,斜刺 . ? . ,应用 电针仪, .枸橼酸钠. 热修复 ,然后正常羊 电压峰值为 ,以肢体轻轻抖动为度,疏密波,频率 血清封闭 ,加人/: 或 / 一,每次电针次/ ,手术后第 天开 : , 孵育, .洗涤后加入 始治疗,至动物处死。 和 标记的二抗.室温孵育 , . . 模型制作方法 洗涤后甘油缓冲液封片以共聚焦显微镜观察、 在室温 ?条件下 大鼠称重后。参考拍照。方法【,行左侧 手术.制备急性脑缺血 . 图像及统计学分析 动物模型。具体方法为所有大鼠均选择左侧大脑中 切片在放大倍数 下,于室管膜下区 动脉 区作为梗死侧, %水合氯醛 / ,、梗死区周围随机选 个视 腹腔麻醉成功后,正中切开颈部皮肤,暴露颈总动脉 野,输入图像分析系统,记取不同时间点阳性细胞 并向上分离出颈内动脉和颈外动脉主干及其分支, 数。所得数据用 软件进行方差分析和组间比较 用双极射频电凝器电凝并剪断颈外动脉分出的枕动 统计学处理,. 为差异有显著性意义。 脉和甲状腺上动脉,在舌动脉和颌动脉分叉处结扎结果 颈外动脉,用动脉夹夹闭颈外动脉和颈内动脉的分 叉处;然后在颈外动脉远端结扎处附近剪一小口。插 . 电针引起 模型大鼠区发生明显的 入预先烧成圆头的尼龙线并疏松结扎:剪断颈外动 细胞增殖现象 脉并将其拉直,使之与颈内动脉成一直线:缓慢推动 阳性标记物为圆形、卵圆形或椭圆形、呈 尼龙线使之进入颈内动脉,直至感觉有少许阻力为 深褐色、境界清晰。假手术组阳性细胞主要分 止从颈外动脉与颈内动脉分叉处起约插入约 ? 布在,且数目少、分散。模型组 阳性细胞,松开颈总动脉。 后缓慢退出尼龙线。试验 主要分布在、缺血边缘区:缺血损伤后 天, 过程和动物苏醒期间注意保温。假手术组只分离动 阳性细胞逐渐增多 在呈簇状分布,缺血 脉,不结扎、插线。动物苏醒后观察其体态及行为,按 边缘区呈散在分布;再灌注 阳性细胞数目 评分评价动物的行为变化,以判断 急剧增多并达高峰,同时可见到梗死灶对侧区 模型是否成功。具体评分标准为 分:正常; 阳性细胞。电针组阳性细胞数在第 天 分:对侧肢体屈曲; 分:拖住尾巴后拉时,对侧肢体 显著高于相同时问段模型组.,见图 见前 无力; 分:拉住鼠尾,向病侧转圈; 分:自发向病侧 置彩色插页 ,表 。 转圈; 分:不能自发运动。将 、 分的动物剔除。 . 电针对 模型大鼠的内源性神经前体细 . 检测指标及方法 胞的分化影响中国康复医学杂志,年,第 卷,第 期 表 免疫荧光标记阳性细胞计数结果 ? 标阳性 图 ? ,见前置彩色插页 ;区发现少 量的新增殖神经干细胞分化为成熟神经元细胞 / 双标阳性图 ? ,见前置彩色插页。 电针组/ 双标阳性细胞数在第 天高于 ?与其他两组比较. 相同时间段模型组 .;电针组和模型组的 在本实验中我们观察到局灶性脑缺血后,出现 /双标阳性细胞数在第 、 和 天差异 大量的新增殖细胞。缺血灶周围发生增殖的细胞绝 无显著性. ,见表 。 大多数是星形胶质细胞反应性增生/ 双 表 各组不同时间 / 、/ 阳性细胞计数结果 ?与其它两组比较.讨论 在新增殖的神经干细胞分化的方面,我们观察 到局灶性脑缺血后诱生大量的新增殖细胞。缺血灶 目前国内外大量的文献表明哺乳动物脑内侧脑 周围发生增殖的细胞绝大多数是星形胶质细胞反应 室的、海马齿状回 , 存在神经 干细胞,这些干细胞在生理状态下保持低水平增殖 性增生/ 双标阳性 ,胞体变大,以缺血损 并不断更新:在局部和全脑缺血损伤中,这些神经干 伤后第 天最为明显,其中电针进行干预后/ 双标阳性细胞较模型组明显增加:在区 细胞能增殖并分化成各种类型的神经元和胶质细 胞.这对脑损伤后的修复和神经可塑性中起着重要 见少量的新增殖神经干细胞分化为神经元细胞 作用 。“。脑缺血在引起神经元损伤的同时,脑的内 / 双标阳性 ,但在电针组和模型组无显 著性差异。近来有研究表明在脑损伤后星型胶质细 环境也出现了促使内源性神经干细胞增殖、分化和 修复神经元损伤的因素。 和等 胞不仅起着修复损伤的作用。还可以在局部分泌神 研究发现脑缺血后诱导内源性生长因子一 、 经营养因子作用,支持和营养局部神经细胞的作用。 因此 本课题组认为电针可以促进新增殖的内源性 、 、和 等表达增加,这些生长 因子正是神经干细胞增殖、分化所必需;在分子水 神经细胞向星形胶质细胞分化,并通过星形胶质细 平. 等研究发现脑缺血诱导控制区神经干 胞分泌神经营养因子等作用发挥对脑损伤的保护作 用,这可能是电针治疗脑缺血损伤的重要机制之一。 细胞增殖、分化的基因表达增加,如? 超家族 本研究中发现缺血灶周围区见部分阳性 基因、 家族受体基因、转录因子基因等,从而 促进内源性神经前体细胞和血管内皮细胞增殖四。 细胞未标记上 和 ,这些细胞可能是巨 噬/炎症细胞或血管内皮细胞增殖所致。由于本研究 在我们的研究中也证实脑缺血后能够诱发内源性神 未进行/提示增殖细胞为迁移的尚未成 经细胞增殖,其中少量的新增殖细胞可以分化为神 经元细胞和 或星形胶质细胞。 熟的神经元细胞 、/ ? 增殖细胞分化为小等研究表明成年沙土鼠短暂全脑缺血 胶质细胞或吞噬细胞方面的研究,对阳性的 增殖细胞迁移、分化的过程不能进行深入的跟踪,所 后齿状回神经元再生水平升高,且于缺血后 】 达 到最高峰。在本研究中发现 大鼠细胞增殖主 以相关问题尚待研究。 要分布在、缺血边缘区,齿状回细胞增殖较少 参考文献 见:缺血损伤后第 ? 天 阳性细胞逐渐增孙怡,杨任民主编.实用中西医结合神经病学 .第 版.北京:人 多.在呈簇状分布,缺血边缘区呈散在分布;缺 民卫生出版社,.. 血损伤后 增殖细胞增长幅度有所下降;同时梗 『 刘玉珍,蒋戈利,韩景献,等.电针对局灶性脑缺血大鼠细胞问黏附 分子一 表达和白细胞浸润的影响 .中国康复医学杂志,, 死灶对侧区亦可见阳性细胞。在对:. 模型 大鼠进行电针干预后发现在第 天张慧敏.头穴针刺对局灶性脑缺血大鼠脑微血管内皮第八因子 相关抗原影响的动态观察?.中国康复医学杂志, , :. 时阳性细胞数明显高于相同时间段模型组,, ,,. 其机制可能与电针、功能训练等外界刺激使. 模型大鼠缺血脑组织神经营养因子表达增多 ”,, ,: . 从而促进神经前体细胞的增殖。叫。 下转 页中国康复医学杂志. 年.第 卷,第 期 . 重复出现;某些年龄段测试内容的难度相对过大,如 , , :.周大运动的俯卧位两前臂伸直。重量落在双手 ,, , . 上,胸部抬起等等。虽然,目前已将 一 量表翻译成中文出版发行,但此量表的常模人群是美国儿 童,因而针对其他年龄段儿童及不同人群的相关研. ,, :? . 究有待继续进行,并在条件成熟时应进行 一 , ,, . 量表的中国常模研究 参考文献 ? .台湾医学, ,: ?. 李明,黄真. 运动发育量表 .北京:北京大学医学出, . 版社, . ? ., , . . , 一 【 . , ,: , 】】 ?.? .张秀玲,李寄平,秦明镜,等.发育量表 . ? 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