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一株疫病拮抗青霉P.st10菌株的抗菌活性及其对辣椒疫病的盆栽防效

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一株疫病拮抗青霉P.st10菌株的抗菌活性及其对辣椒疫病的盆栽防效一株疫病拮抗青霉P.st10菌株的抗菌活性及其对辣椒疫病的盆栽防效 一株疫病拮抗青霉P(st10菌株的抗菌活性 及其对辣椒疫病的盆栽防效 22(3)239—243中国生物防治ChineseJournalofBiologicalControl2006年8月 一 株疫病拮抗青霉P.stl0菌株的抗菌活性及 其对辣椒疫病的盆栽防效 马艳,常志州卜,赵江涛,黄红英,叶小梅,张建英 (1.江苏省农科院农业资源与环境研究所,南京210014;2.江苏省农科院科研处) 摘要:筛选得到一株疫霉菌的拮抗青霉Penicilliumst...
一株疫病拮抗青霉P.st10菌株的抗菌活性及其对辣椒疫病的盆栽防效
一株疫病拮抗青霉P.st10菌株的抗菌活性及其对辣椒疫病的盆栽防效 一株疫病拮抗青霉P(st10菌株的抗菌活性 及其对辣椒疫病的盆栽防效 22(3)239—243中国生物防治ChineseJournalofBiologicalControl2006年8月 一 株疫病拮抗青霉P.stl0菌株的抗菌活性及 其对辣椒疫病的盆栽防效 马艳,常志州卜,赵江涛,黄红英,叶小梅,张建英 (1.江苏省农科院农业资源与环境研究所,南京210014;2.江苏省农科院科研处) 摘要:筛选得到一株疫霉菌的拮抗青霉PenicilliumstriatisporumP.stl0.该菌株强烈抑制疫霉 菌及核盘菌的菌丝生长.无菌滤液抑制辣椒疫霉孢子囊的形成及孢子囊,游动孢子的萌发,且 能杀死菌丝细胞.该菌株在辣椒根际有很强的定殖能力,有机肥对其定殖有增强作用,接种后 40d在根际的青霉菌数量,青霉处理为0.76×104cfu/g,而青霉菌肥处理为2.55×104cfu/g.盆 栽试验显示:处理7d后,土壤只接种辣椒疫霉对照发病率为93%;同时接种青霉培养滤液和 辣椒疫霉处理为16%;接种青霉培养滤液,新鲜菌丝和辣椒疫霉处理为l5%. 关键词:青霉;疫霉;拮抗作用;防效 中图分类号:$436.418.19;$476文献码:A文章编号:1005.9261(2006)03.0239.05 AntifungalActivityofPeniciUiumstriatisporumStrainP.stlOandItsInhibition againstPepperBlightCausedbyPhytophthoraspp. MAYan,CHANGZhi-zhou,ZHAOJiang-tao, HUANGHong-ying,YEXiao-mei,ZHANGJian-ying (InstituteofAgriculturalResourcesandEnvironments,JiangsuAcademyofAgriculturalSci ences,Nanjing210014,China) Abstract:PenicilliumstriatisporumstminP.st10wasshowedtobehighlyantagonisticagainstmycelial growthofPhytophthoraspp.andSclerotiniasclerotiorum,whilenotantagonistictoothertestedplant pathogensinplatetests.Investigationofantagonisticmechanismunderlightmicroscopeshowedthatthe dilutionoffiltratefromliquidfermentationofthefungusinhibitedpathogenbyleadingtohyphalabnor- mality,inhibitinggerminationofspores,andsuppressingformationandgerminationofsporangiumofP. capsici.P.striatisporumcouldcolonizeinpepperrhizosphere.Organicfertilizercouldimprovethecolo- nizationability.TherateofpepperblightdiseasereducednotablywhensoilWastreatedththemyceh- amofthestrainanditsfiltrateinpottest. Keywords:Penicilliumstriatisporum;Phytophthoracapsici;antagonisticfungi;biocontroleffect 收稿日期:2005.09.13 基金项目:科技部863项目(2002AA601012一o2);江苏省自然基金(BK2003118); 江苏省农科院基金(6110546) 作者简介:马艳(1971一),女,助研,博士研究生;*通讯作者. 239 中国生物防治第22卷 疫霉菌(Phytophthoraspp.)为害多种经济植物,引起严重病害『l.由于该属病原菌特 殊的 细胞壁结构以及能在短时间内形成大量孢子囊并释放游动孢子直接侵染植物,导 致疫病在蔬 菜作物上的暴发.在一些重茬大棚中,辣椒疫病,番茄晚疫病及大豆疫病等使得许 多大棚地块 绝产,直接影响作物产量,造成严重的经济损失.长期以来,对疫霉菌导致的病害控制一直较 为困难.在疫病的生物防治方面,国内外学者已作了许多研究『2,所用的生防微生物主要有 放线菌,假单胞菌,哈茨木霉,芽孢杆菌和内生芽孢杆菌.对于青霉在生物防治领域的研究应 用,国内开展较少,但国外在20世纪80年代已开展研究,并发现了许多有生防价值的菌株,特 别是对草酸青霉(Penicilliumoxalicum)的研究【9.但目前国内外还未见到有关青霉Penicilli. ttmstriatisporum防治植物病害特别是疫病的报道.本文主要对分离自土壤的青霉菌株P.stl0 的抗菌特性及对辣椒疫病的防治效果进行研究.现将研究结果报道如下. l与方法 1.1供试材料 青霉PenicilliumstriatispoFItm菌株P.stl0由江苏省农科院农业资源与环境研究所提供.辣 椒疫霉菌(P.capsici),致病疫霉(P.infestans),掘氏疫霉(P.tucker),烟草疫霉(P.nico— tianae),大豆疫霉(P.megasperma),番茄灰霉菌(Botrytiscinea)由本实验室保存,油菜菌核病菌 (Sclerotiniasclerotiorum),立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani),小麦赤霉(Fusariumgraminearum),瓜 果腐霉(Pythiumaphanidermatum),稻瘟菌(Magnaporthegrisea),西瓜枯萎菌(Fusariumoxyspo. Firm),番茄早疫菌(Alternariasolani)由南京农业大学提供.辣椒品种为苏椒2号;培养基为 PDA和番茄汁培养基_1;青霉根际定殖试验所用的抗性标记培养基为:含有0.08mg/n~的多 菌灵和20mg/ml五氯硝基苯的马丁氏培养基;有机肥为经无害化处理的纯猪粪. 1.2拮抗青霉,病原菌的制备 挑取在PDA斜面培养的青霉孢子划线接种到PDA平板,28cc培养5,7d,制成菌饼(直径 4mm)备用.疫霉属病原菌接种到番茄汁平板,其他病原菌接种到PDA平板,28c【=培养. 1.3拮抗青霉抗菌谱的测定 采用平板对峙培养法:挑取生长旺盛的病原真菌菌丝块(直径4mm,下同)于PDA平板一 侧的中央,同时在相对一侧的中间放置青霉菌饼,两者相距约4.5cm,每个病原菌5次重复, 28c【=恒温培养7—10d,观察拮抗带的有无或大小. 1.4青霉培养滤液的制备 在PDA液体培养基中,28c【=,160r/rain培养7d的培养液经6000r/rain离心15rain,将离心 所得新鲜菌丝匀浆配制至lo5,lo6cfu/ml备用.收集上清液经细菌过滤器过滤,获得无菌培 养滤液.将无菌培养滤液与乙酸乙酯以1:3(体积分数)比例混合萃取3次,收集无机相即为 不含拮抗物质的培养滤液,备用. 1.5青霉培养滤液对辣椒疫霉的抑制作用. 1.5.1青霉培养滤液对辣椒疫霉菌丝生长的影响分别将0,2,0.67,0.4,0.2,0.1,0.067, 0.05ml青霉无菌培养滤液加入到溶化的20?d番茄汁培养基中混合倒平板,稀释倍数分别为 0,10,30,50,100,200,300,400倍;将病原菌菌丝块于平板中央接种,稀释倍数为0即为培养滤 液直接滴在菌丝块上,28c【=培养24,48,120h后测量菌落直径,每处理5次重复.7d后将未生 240 第3期马艳等:一株疫病拮抗青霉P.stlO菌株的抗菌活性及其对辣椒疫病的盆栽防效 长的菌丝块于不含拮抗物质的番茄汁平板中培养,观察其是否生长. 1.5.2青霉培养滤液对菌丝细胞结构的影响将15个病原菌菌丝块置于含有2ml青霉培养 滤液20ml无菌水中,黑暗中放置12h后,除去培养滤液,加入20ml无菌生理盐水再浸泡12h, 显微观察病原菌菌丝细胞结构. 1.5.3青霉培养滤液对孢子囊及孢子的影响将病原菌菌丝块置于含有2ml青霉培养滤液 20ml无菌水中,25?,Et光灯光照24,48,72h后,镜检观察病原菌孢子囊的形成情况.每处理5 次重复,以无菌水为对照.将孢子囊或孢子悬浮液lOOtfl涂在含有2ml培养滤液的20ml番茄 汁平板上,28?培养24,72,120h.随机镜检100个孢子囊或孢子,计算萌发率. 1.6有机肥对青霉在根际定殖的影响 在塑料大棚中进行,每个塑料盆钵装自然风干菜园土0.5kg,移栽4叶期健壮辣椒苗3棵. 设:?土壤不接种任何微生物;?土壤接种新鲜青霉菌丝;?土壤中加入1%的有机肥;?土 壤加入青霉菌丝与有机肥.青霉菌丝加入量为8g/kg土,有机肥添加量为l0g/kg,分别在第3, 10,20,40d取辣椒根际土,对根际真菌进行分离,计数,同时用选择性培养基进行青霉菌的数量 分析,测定其在根际的定殖能力.每处理测定3盆,试验重复两次. 1.7盆栽防效试验 盆栽试验在塑料大棚中进行.每个塑料盆钵装自然风干菜园土0.5kg,移栽4叶期健壮辣 椒苗5棵.设:?对照1,土壤不接种任何微生物;?对照2,土壤接种辣椒疫霉菌;?对 照3, 土壤同时加入不含拮抗物质的青霉培养滤液和辣椒疫霉菌;?处理1,土壤同时加入青霉培养 滤液(含拮抗物质)和辣椒疫霉菌;?处理2,土壤同时加入新鲜青霉菌丝和辣椒疫霉菌;?处 理3,土壤同时加入青霉培养滤液,新鲜菌丝和辣椒疫霉菌.辣椒疫霉菌接种量为1g风干土 500,800个孢子囊;青霉菌丝加入量为8r,&g土;不含拮抗物质的培养滤液在辣椒栽好时,从 根部均匀浇人lOml;青霉培养滤液在辣椒栽好时从根部均匀浇人lOml.每个处理6盆,试验 重复两次.所有对照及处理在移栽后7,12d调查,统计发病情况. 2结果与分析 2.1青霉P.stlO菌株的抗菌谱 结果表明,青霉P.stlO菌株对疫霉属的辣椒疫霉,致病疫霉,大豆疫霉,烟草疫霉,掘氏疫 霉及核盘菌属的油菜菌核病菌有很强的拮抗能力,抑菌带宽度分别为32,30,34,31,32,31mm; 而对其他病原菌无拮抗效果.说明该菌对疫霉属病菌表现出明显的专一抗性. 2.2青霉培养滤液对辣椒疫霉的抑制作用 2.2.1培养滤液对辣椒疫霉菌丝生长的影响表1结果表明,青霉培养滤液对辣椒疫霉菌丝 的生长有明显的抑制作用,但随稀释倍数的增大及培养时间的延长逐渐减弱.取滴加青霉培 养滤液原液及稀释l0倍的培养滤液平板上完全没有生长的疫霉菌丝块,用无菌生理盐水浸泡 12h后,转移至番茄汁平板上继续培养,发现菌丝不再生长,说明菌丝细胞已被杀死. 表1不同稀释倍数青霉培养液对辣椒疫霉菌丝生长的抑制率(%) 24l 中国生物防治第22卷 辣椒疫霉菌丝在稀释30,50,100倍青霉培养滤液的PDA平板上均能缓慢生长,但菌丝呈 现直径明显增粗,菌丝前端扭曲,菌丝分枝增加,分枝菌丝节间缩短等畸形症状.随稀释倍数 增加,其畸变程度明显降低.致使菌丝畸变的培养滤液最高稀释倍数为100倍. 2.2.2培养滤液对辣椒疫霉菌丝细胞结构的影响显微观察青霉培养滤液处理的菌丝块显 示:菌丝细胞壁仍保持完整,但细胞内原生质不再均匀透明,而是浓缩成许多颗粒状物质,可见 细胞内部结构已被破坏.将处理过的病原菌菌丝块接种在番茄汁平板上培养,未见菌丝生长. 可能培养滤液中的拮抗物质通过破坏细胞结构而杀死菌丝细胞. 2.2.3培养滤液对病原菌孢子囊及孢子的影响镜检结果表明:24h内,培养滤液处理的菌丝 块视野中未观察到孢子囊,而对照每个视野中孢子囊数为120个.可见培养滤液稀释10倍后 在24h内可完全抑制孢子囊的形成;72h后处理的每个视野内有8,10个孢子囊形成,而对照 每个视野中孢子囊数已大于300,且部分孢子囊已释放出游动孢子.可能随着处理时间延长, 拮抗物质的抗生活性减弱或菌丝对其产生适应性,有少数孢子囊形成.试验结果表明:培养 120h后,稀释10倍的培养滤液处理,孢子,孢子囊的萌发率均为0,而对照病原菌的孢子,孢子 囊在培养120h时均已萌发,且菌丝生长茂盛,已长满平板. 2.3有机肥对青霉在根际定殖的影响 青霉与有机肥(下称菌肥)共同施入土壤明显有利于其在根际的定殖(表2).盆钵栽 苗 10d后,青霉菌肥处理中辣椒根际青霉的数量是单独施加青霉处理的3倍;20d后上升为17 倍,且菌肥处理中青霉在根际真菌中所占的比例也远远高于单加青霉的处理,为真菌中的优势 菌群;接种后40d,青霉菌在根际的数量仍有2.55×10cfu/g干土,占根际真菌总数的53%,有 很强的定殖及保持优势种群的能力. 表2青霉在辣椒根际的定殖结果 2.4盆栽对辣椒疫霉病的防治效果 结果(表3)表明:辣椒苗移栽后7d,未做任何处理对照1的辣椒苗无一株发病;接种病原 菌孢子囊对照2的发病率达93%;对照3的发病率为90%,即不含拮抗物质的青霉培养滤液 对疫病没有防治效果.3个处理的发病率依次分别仅为16%,38%及15%,各处理与对照发病 率差异达显着水平.处理2发病率显着高于其它处理,可能是青霉还没有在根际定殖并形成 优势种群前,病原菌已经侵染植株.移栽后12d,所有处理植株发病率开始增加,但处理3发 病率增加最少,为31%,与其他处理差异达显着水平.可能此时处理1中培养滤液中的拮抗 物质已经被植株或土壤中的微生物代谢利用或者失活;而在处理3中,青霉培养滤液在移栽 后的5,7d内可以抑制病菌的侵入,青霉菌在此期间完成在根际的定殖从而能持续地发挥防 效.由此可见,青霉生长代谢产生的拮抗物质在病害的防治初期起重要作用,因此在实际应用 中要考虑代谢产物与活菌的协同作用以便更好地控制病害的发生. 242 第3期马艳等:一株疫病拮抗青霉P.stlO菌株的抗菌活性及其对辣椒疫病的盆栽防效 注:表中数据为两次试验发病率的平均值;l司一行不同小写字母表示差异达0.05显着水平. 3讨论 与细菌相比,青霉菌培养方式多样,对营养要求简单,培养基成分来源广泛,价格低廉,生 长,繁殖速度快,产孢能力强,有较好的环境适应性.这些特点对于将来的工业化生产和应用 十分有利.本文的青霉P.stl0菌株采用固体,液体培养均能产生抗菌物质.固体培养无论在 生产操作的简便性,生产成本,产品形式和抗菌物质的提取等方面都明显优于液体培养.该菌 株的最佳固体培养基配方及生产的研究工作正在进行. 青霉P.stl0菌株为何仅对疫霉菌和油菜菌核病菌这两个进化程度差距极大的病菌有很 强的拮抗作用,而对其他病原真菌无拮抗作用,明显不同于前人报道的其他青霉菌株的抗菌 谱,有必要对其产生的拮抗物质及抗菌机理进行深入研究.初步研究表明:在P.stl0产 生的拮抗物质中,对疫霉有效的活性成分有3种,均为不溶于水而溶于有机溶剂的非蛋白类物 质.青霉P.stl0菌株是否还产生对人和动物都有作用的抗菌物质以及在应用中的安全性,还 需要进行进一步研究和论证. 参考文献 邹学校.中国辣椒[M].北京:中国农业出版社,2002. 冯东听,李宝栋.辣椒疫病病原菌及抗病育种研究进展[J].中国蔬菜,1999,(2):48—52. 戴晓燕,关桂兰.两株对辣椒疫霉菌有拮抗作用的拮抗菌分泌蛋白的研究[J].中国 生物防治,1999,15(2):81—84. 朱宗源,周新根,宋荣浩,等.用生物制剂防治青椒疫病[J].上海农业,1995,11(1):64— 68. 刘任,卢兆金.哈茨木霉菌株对辣椒土传真菌病害的控制作用[J].仲恺农业技术学 院,2003,16(1):6—11. 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