宫颈脱落细胞DNA倍体分析用于宫颈内瘤变筛查的价值探讨

宫颈脱落细胞DNA倍体分析用于宫颈内瘤变筛查的价值探讨 宫颈脱落细胞DNA倍体分析用于宫颈内瘤变筛查的价值 探讨 暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用 中文摘要 宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用 摘 要 目的: 第一部分:以正常昆明小鼠肝组织内的三种(二、四、八倍体)肝细胞核 DNA 含量间的 比值为 2或 4的倍数关系为理论依据,再次探讨以正常小鼠单个完整体积肝细胞核为单位 测算肝细胞核 DNA含量的组织原位三维测算法的可靠性与准确性。 第二部分: (1)运用细胞图像分析系统对 487例常规宫颈脱落细胞涂片进行 DNA倍体分析,观察利 用细胞图像分析仪对宫颈脱落细胞核 DNA 倍体分析结果在宫颈上皮内瘤样变筛查 中的作用。 (2)运用 HPV 分型检测、宫颈脱落细胞核 DNA 倍体分析、宫颈脱落细胞学和活检组织 病理学诊断检测宫颈上皮内瘤变和早期宫颈癌的患者,将它们的检测结果进行比较 和分析,研判它们在宫颈上皮内瘤样变和早期宫颈癌筛查中的作用,为宫颈上皮内 瘤样变和早期宫颈癌筛查提供更有效辅助诊断方法的实验依据;同时分析宫颈癌发 病年轻化与 HPV感染的联系,为宫颈癌发病年轻化的原因提供一定的临床辅助信息。 (3)以宫颈活检组织病理学诊断结果为“评价标准”,对宫颈脱落细胞学级别的诊断存在 疑议的病例(ASCUS 及无法确诊的其它细胞学级别)且高度怀疑有癌变可能的高危 人群的真实病变程度进行进一步验证,并为相应疾病进展速度的判断、治疗措施、 疗效和病变转归的评价提供更多有价值的辅助信息。 方法: 第一部分:选取 10 只成年健康雄性昆明小鼠,每只小鼠各取一块肝组织。每块肝组织制 作 4μm和 11μm两种厚度的组织切片各一张,行改良 Feulgen染色,TIGER细胞图像分析 仪分别用组织原位三维测算法与以细胞核截面为单位的测量法测算肝组织内二、四、八倍 体单个肝细胞核的 DNA含量;计算三种倍体单个细胞核 DNA含量的比值,并与理论倍数 值进行比较。 第二部分:对在广东省妇幼保健院进行宫颈液基细胞学筛查结果有异常或疑议的 487例患 I暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用 中文摘要 者样品(487例患者均有宫颈活检组织病理诊断,其中高度怀疑具备 HPV 感染高危因 素的 210 例病例在患者知情的情况下行 HR-HPV 检测),再次进行液基细胞薄层(TCT) 制片,经改良 Feulgen 染色法染色后,进行宫颈脱落细胞核 DNA 含量测量与倍体分析。 分析比较常规脱落细胞学检查、HPV分型检测、细胞核 DNA倍体分析结果与活检组织病 理学诊断结果,并对 HPV感染率、ASCUS 的病理学级别与年龄是否相关进行分析。 结果: 第一部分:用组织原位三维测算法获得的每只小鼠肝组织内三种肝细胞核 DNA 含量的比 值 (4c/2c 、8c/4c、8c/2c): 呈接近 2 或 4 的倍数关系, 比值与理论倍数 2、4 的差异无 统计学意义。以薄切片上肝细胞核截面为单位计算的三种肝细胞核 DNA 含量及其均值的 比值的均值远小于相应理论倍数值,差异有统计学意义。 第二部分: (1) 487例病例经常规宫颈脱落细胞学检查后,474 例(97.33%)异常: HSIL占 10.1%; LSIL占 52.8%;ASCUS占 34.5%;DNA倍体分析结果显示,337 例异常;病理组织 学诊断结果:?CINIII占 11.3%;CINII占 14.8%;CINI占 45.2%。以活检组织病理组 织学检测结果为“评价标准”,宫颈脱落细胞核DNA倍体分析(DNA倍体分析参照 ? DNA倍体分析标准 )的灵敏度(Se)为 92.1%,常规宫颈脱落细胞学检测方法的灵 敏度(Se)为 75.6%。 (2)210 例患者有 HR-HPV 检测结果,HR-HPV 阳性者 97 例, HR-HPV 阳性率在两种 年龄组间的差异有统计学意义,年轻组的感染率高于中老年组。 (3)比较和分析高度怀疑具备 HR-HPV感染高危因素的 210例女性患者的 HR-HPV的检 测结果、常规细胞学检测与 DNA 倍体分析结果。DNA 倍体分析和 HR-HPV 检 测在 不同的病理学诊断级别的差异整体上均有统计学意义,以病理学检测结果为“评价 标准”,宫颈脱落细胞核 DNA 倍体分析的灵敏度(Se)为 86.0%,特异度(Sp)为 36.3%,HR-HPV 检测的灵敏度(Se)为 75.0%,特异度(Sp)为 66.4%。常规细胞 学检测的灵敏度(Se)为 81.3%,特异度(Sp)为 31.0%。 (4)在复查两次或以上常规脱落细胞学诊断为 ASCUS 的 140例患者中,以活检组织病理 学检测结果为“评价标准”, HR-HPV检测与 DNA倍体分析均阳性的病例数随着病 理级别的升高而升高( ?CINII 阳性率昀高) ,均阴性的病例中,病理学诊断级别为 ?CINI。II暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用 中文摘要 结论: 第一部分:本实验初步验证组织切片上运用组织原位三维测算法获得的以单个完整细胞核 体积为单位的细胞核内 DNA 总量的可靠性好。应用细胞图像分析仪在组织切片原位通过 合适的抽样和测量计算,可较准确地获得以单个完整细胞核体积为单位的细胞核内化学物 质总量。 第二部分: (1)常规宫颈脱落细胞学检测与 DNA倍体分析相结合可提高临床宫颈癌与癌前病变筛查 的阳性检出率的灵敏度。 (2)HR-HPV 感染率增加且年轻患者 HR-HPV 阳性率较高,可能是宫颈癌发病年轻化的 一项重要因素。 (3) HR-HPV检测结合宫颈脱落细胞核 DNA倍体分析可提高宫颈上皮内瘤样变筛查的灵 敏度和特异性。 (4)应用活检组织病理组织学检查、HR-HPV检测、细胞核 DNA 倍体分析三种方法,对 常规宫颈脱落细胞学诊断为 ASCUS病变的真实级别的重新诊断、治疗效果以及预后 提供较形态学更深层的辅助信息。 关键词: 组织原位;DNA 倍体;DNA 倍体分析;宫颈上皮内瘤样变;高危型人类乳头瘤状病 毒;图像分析仪 III暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用 英文摘要 The role of analyzing DNA ploidy of the cervical cast-off cells in Cervical Intraepithelial Neoplasia screeningABSTRCT Purposes: Part one: On the theoretical basis of the ratio of DNA content in volume unit of whole diploid, tetraploid and octoploid nuclei was 2 or 4, we re-estimate the reliability of measuring the DNA content in volume unit of whole hepatocyte nuclei on the liver tissue in situ by image analysisPart two: 1 487 cases of cervical smears were for DNA ploidy analysis by TIGER-cell image analysis system, and we compared the result of DNA polidy analysis to observe the stability and accuracy of the cell image analysis system2 The results of cytology, pathology diagnosis, nucleai DNA polidy analysis and cape medical nucleic acid molecules using rapid hybridization kits for detection of HPV genotyping had been compared to provide an effective and volant adjuvant diagnostic method for cervical cancer screening;and the factor caused the age of cervical cancer becoming younger 3 With biopsy results as the standard, we compared and anlysised the resuls of four kinds of testings to provide an effective identifying method for clinical borderline cases and uncertain cases on pathological diagnosis, and to provide much more evaluating information for prognosis, treatment and evaluation of therapeutic efficacyMethods: Part one: The 4 μm and 11 μm liver tissue slices were prepared respectively, from 10 healthy adult male Kunming mice, and then together stained with modified Feulgen stain. The DNA content in volume unit of whole diploid or tetraploid or octoploid nuclei were measured and calculated by TIGER-cell image analysis system respectively, with two methodsPart two: Each of cervical samples from the 487 women who accepted the convertional cytological screening was made into two smears by TCT. One sample stained byIV暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样 变筛查中的作用 英文摘要 papanicolaous stain was diagnosed by conventional cytology. The other sample stained by Feulgen method was analyzed by muclear DNA polidy anlysis. The uncertain cases were required to be deteced by biopsy. The samples which had the doubt of infecting with human papillomavirus should be tested by HR-HPV testing. Then we compared the results of the conventional cytology, biopsy, HR-HPV testing and those of DNA plidy analysis, and did the research and analysis of the age groups, and so with the results of HR-HPV testing and DNA polidy analysisResult: Part one: The ratio of DNA content in volume unit of whole diploid, tetraploid and octoploid nuclei were close to 2 or 4 in liver tissue of each Kunming mouse by the 3D testing, and the results had not statistically significant with the theoratic mupltiples Part two:1 487 cases of the appointment of women were tested by conventional cervical cytology, 97.33% were abnormal, including 168 cases of ASCUS, 257 cases of LSIL and 49 cases of HSIL, were diagnosed by conventional cytology examination. 220 CINI, 72 CINII and 55 cases of carcinoma in situ were detected by pathohistology examination. 337 abnormal cases were diagnosed by DNA image analysis. According to the criterion of pathohistology diagnosis, it could say that the sensitivity of DNA polidy analysis was 92.1%, and that of convertional cytology was 75.6%2 210 cases were detected by HR-HPV testing, in which 97 cases were infected. The difference of positive rate of the youth group and middle-age group had statistical significance. The positive rate of the youth group was more than that of the middle-age group3 According to the criterion of pathohistology diagnosis, we compared the results of the HR-HPV testing, conventional cytology and DNA polidy anlysis of 210 cases. The differences of results of DNA ploidy analysis and HR-HPV testing at different levels of pathological diagnosis had statistically significant in overall. The sensitivity of the cervical shedding nuclear DNA polidy analysis was 86.0% and the specificity of it was 36.3%. The sensitivity of the HR-HPV testing was 75.0% and the specificity of it was 66.4%. The sensitivity of the conventional cytology was 81.3% and the specificity of it was 31.0% V暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍 体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用 英文摘要 4 140 ASCUS were detected more than twice. The pathohistology diagnosis was to be as the criterion.With the increase at the levels of pathology, the positivity of the DNA polidy analysis combined with the HR-HPV testing increased. The level of the CINII is the highestWith the results of HR-HPV and DNA polidy analysis was negative, the highest rate of the pathological diagnosis is ? CINI, and ?CINII was 0. Conclusions: Part one: The 3D testing can obtain the total DNA content in volume unit of whole hepatocyte nuclei on the tissue slices stably. With using an image analysis system, we can obtain the content of chemical substances in volume unit of whole cells or nuclei on the tissue in situ by suitable sampling and calculationPart two:1 DNA polidy analysis combine with the conventional cytology can improve the sensitivity of the cervical intraeopthelial neoplasia screening2 The increase of HR-HPV infection and the higher positive of youth group’s HR-HPV infection were perhaps an important factor in making cervical cancer become younger3 HR-HPV testing combine with the DNA polidy analysis can improve the sensitivity and the specificity of the cervical intraeopthelial neoplasia screening4 Application of the biopsy, HR-HPV testing and DNA polidy analysis can make reference for the diagnosis and clinic treatments of the cytologic uncertain cases such as ASCUS, and we can obtain more information of the lesions than the morphologyKey words: Tissue in situ; DNA polidy; DNA polidy analysis; Cervical Intraepithelial Neoplasia CIN; high-risk Human papillomavirs HR-HPV; Image analysis systemVI暨南 大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用 目录 目 录 中文摘 要???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(?) 英文摘 要???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(?) 目 录??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(?) 第一部分:组织原位三维测算肝细胞核 DNA 倍体和含量 1 前 言?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(1) 2 材料与方 法?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(7) 3结 果?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(12) 4讨 论?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(16) 参考文 献??????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????????(19) 第二部分:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析用于宫颈内瘤样变筛查的作用 1 前 言???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(22) 2 材料和方 法???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(30) 3结 果?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(35) 4讨 论?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(44) 参考文 献???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(51) 结 论??????????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????????????(57) 附 录?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(58) 英文缩略词 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(59) 在校期间发表的论文及科研成果清 单???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(60) 致 谢???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????(61)VII暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样 变筛查中的作用前言第一部分:组织原位三维测算完整肝细胞核的 DNA 含量 1前 言 目前,用图像分析系统测量细胞(核)内的化学物质含量的样品主要有两种: 细胞学 样品和组织学切片。其中细胞涂片内的大多数细胞(核)是完整的,运用细胞 图像分析仪 只需测得单个细胞(核)面积内的目标化学物质的积分光密度(IOD),即可准确地获得 单个细胞(核)内目标化学物质的含量,因此已成为用图像分析系统准确测量器官、组织、 细胞(核)内化学物质的主要实验样品,并在国内外得到了广泛的运用。但组织的细胞涂 片会因样品制作因素导致一定的缺陷,主要表现为下列三个方面:?失去原组织形态结构 和周围组织的毗邻关系,从而导致判断细胞是否癌变时出现异议,使疑似病例数量增加。 ?样品制作过程中损失大量相关细胞,在诊断早期恶性肿瘤患者可能因此出现漏诊。?某 些组织或细胞(如脑组织内某类细胞)的细胞涂片制成过程中因难以获得高浓度的目标细 胞而导致制片失败。因此,细胞学样品在某些实验领域使用图像分析系统对组织、细胞(核) 内外化学物质进行定性、定位、及定量分析时受到一定的限制。组织切片中运用较广泛的 主要有石蜡包埋组织切片、冰冻切片,其中石蜡包埋组织切片因制作价格便宜、过程简单、 不破坏原有组织三维形态结构与毗邻关系,且可以长期保存备档。具备细胞学样品及其他 种类组织切片无法拥有的优点,因此逐渐成为图像分析系统对组织、细胞(核)内外化学 [1-5] 物质进行定性、定位、定量分析常用的实验样品类型 。 国内外大多数科研工作者对组织、细胞(核)内化学物质进行定性与定量时多采用以 下两种方法:?对目的细胞(核)染色后,以镜下观察阳性细胞(核)的有无来定性判断 被检测化学物质(包含抗原和抗体)的存在与否,根据被染细胞(核)颜色的深浅来定性 被检化学物质的多少;?采用与细胞学样品一样的方法,只测量薄组织切片中的目标细胞 (核) 和参考细胞(核)截面面积内的积分光密度值(IOD)作为它们完整个体的化学成 份含量。其实上述两种定性定量的方法存在较大的缺陷,因为在对组织、细胞(核)内化 学物质进行定性定量分析时未考虑到以下影响因素:(?)切片机上的预设切片厚度值并 [6] 非真实切片的厚度 。实验过程中,我们也观察到同一组织薄组织切片的颜色深度较厚组 织切片浅,且组织切片颜色的深浅还与染色时的染液性能是否稳定有关。若 仅仅以镜下组 1暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用前言织切片的深浅或有无对被检组织内的化学物质进行定量判断会出现一定的差错。(?)只 测量薄组织切片内以细胞(核)截面为单位的面积积分光密度(AIOD)作为化学物质的 总含量。面积积分光密度受平均光密度(AOD)与细胞(核)截面面积(At)两者的大小 影响,其中细胞(核)截面面积与完整细胞(核)个体的体积、形状、细胞极性分布和截 面的细胞(核)本身的位置有关,而平均光密度与切片厚度和单位细胞(核)体积内化学 [7] 物质的密度有关 。薄组织切片内的细胞(核)只是其完整细胞(核)个体的一部分。综 上所述,采用上述两种测量方法不能准确获得组织切片内以单个完整细胞(核)内的化学 物质含量的真实信息,存在不可估量的缺陷和局限性。 1.1 显微图像分析系统技术 计算机图像分析技术的发展和普及日新月异,采用显微图像分析仪检测组织、细胞(核) 内外化学物质含量,尤其是对细胞核DNA含量测定的实验研究越来越多。然 而,多数测量 结果存在着不同程度的可比性和重复性差的问题。分析原因,主要应从显微图像分析仪本 身和生物样品制备两方面对细胞定量的影响进行分析。另外,迄今为止图像分析系统的标 准还未得到统一。早期的图像分析仪和不少厂家生产的图像分析仪根本不具备测量光密度 的功能,或者不能达到测量检测细胞图像光密度的功能,且许多研究工作者往往只注重生 物学样品制备的准确性却忽略图像分析系统本身的在实验领域的适用性与稳定性。 1.1.1 显微图像分析仪的基本结构 显微图像分析系统(microscope image analysis system)主要八十年代后期至今用于细 胞图像光度术的主要工具,由显微镜、图像采集装置、计算机和图像处理分析软件四大关 键部分组成。经图像采集装置输入计算机的数字图像同一般模拟图像一样,含有位置、灰 度、色彩三大信息,它们是图像处理和分析软件进行图像处理与定量分析的基础。 数字图像是由众多离散的图像元素(即象素,pixel)按图像显示器的 x与 y方向排列 成的阵列构成,因此,可用(x, y)表示图像中的任一像素在此二维阵列中的位置。现在, 一般的图像分析仪其象素的二维阵列不少于 512×512,可高达 1024×1024 至 4096×4096, 二维阵列的象素越多,图像空间分辨率越高,显示的图像越细腻,越接近被摄图像的真实 2暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用前言清晰程度。 灰度信息显示图像每一个象素的明暗程度,即该象素的图像由黑变白变化程度的量化 等级。现在,一般的图像分析系仪的灰度等级不少于 256,可高达 1024 至 2048,图像的 灰度量化等级越多,图像分析仪的灰度量化分辨率越高,显示的图像明暗层次越丰富,越 接近被摄图像的真实颜色深浅层次。 依据图像的颜色分黑白与彩色图像。黑白图像只有灰度信息没有色彩信息。图像分析 仪的真彩色图像采集装置将每一象素图像的真实色彩分解成红、绿、蓝三种色信号,每一 种色信号又按其强弱量化分不少于 256个灰度等级,分别输入图像分析仪的计算机后再将 它们按同一色度坐标重新编码还原成彩色图像,所以,彩色图像不单含有灰 度信息,还拥 有颜色种类、颜色纯度、色彩亮度的信息,因此,可分别测量得到的每一种色信号的灰度、 色度、色饱和度和亮度的值。但彩色图像的颜色鲜艳程度与明暗程度与照明光的强弱、被 摄图像的色彩深浅以及观察者的主观意志密切相关。 理论上,数字图像的空间分辨率越高,灰度量化等级越多,图像分析仪的分析结果的 准确性越高,但同时会大大减慢计算机的处理和分析速度。当数字图像的空间分辨率和灰 度量化等级超出计算机显示器空间分辨率和灰度分辨率以及人眼的辨别能力后,再提高数 字图像的空间分辨率与灰度量化等级,不会显著提高图像分析仪显示图像的质量和分析结 果的准确性。因此,鉴于人眼对灰度的分辨率不大 30 和生物组织细胞的形态与染色特点, 空间分辨率为 512×512,灰度量化等级为 256 的图像分析仪,已经满足大多数组织、细胞 [32] 形态和化学物质计量分析的要求 。 1.1.2 显微图像分析系统对对组织细胞化学物质定量分析的影响 对组织内细胞(核)的化学成分进行定量测定,其目的就是要客观、准确、可 重复地 分析测量结果。显微图像分析仪可测量细胞的形态特征,还可通过测量细胞的某些化学成 分的吸光度确定其含量。显微图像分析系统根据光吸收定律即朗伯-比尔定律可表述呈下 式: ALog[I / I ]K C L ; A: 吸光度 I : 出射光强度 I: 入射光强度 K: 吸 0x, y x, y x, y x, y x, y 0 光系数 C: 被测物质浓度 L: 被测物质厚度。式中的x, y指显微图像帧存体内测量像素点 的空间位置。显然;等号右边的每一变量对所测细胞(核)内化学物质含量的影响作用如 下所述:3暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用前言1 根据摄像机与显微镜处理分析图像的原理,摄像机与图像卡的固有噪声、显微镜光强 度的变化都成为导致测量结果是否准确的影响因素。系统噪声干扰At和AOD的准确 性,给IOD带来误差;而只有目标细胞的大小和密度达到一定程度以上,系统噪声才 [11] 不会明显影响目标细胞的测量值的分布 。 [8-10,11] 2 被测物质的厚度主要与目标细胞的厚度和显微镜的聚焦深度有关。 Sheppard等 都 [11] 证实聚焦变化导致IOD的测量误差昀大,而面积昀小。夏潮涌等 认为尽管显微镜聚 焦改变可引起较大的测量误差,但人眼调焦图像的测量误差仍可以接受。 3 闪光误差和衍射误差: 图像分析仪测量组织内某一化学成份的图像时,光的衍射特性 使入射光强度不变的情况下,出射光强度增加,导致该组织成份的面积积分光密度值 减小。由于衍射宽度(即光线绕过组织边缘的宽度)与入射光的强度、物镜的倍数、 待测物的实际面积与平均光密度无关。因此,光衍射现象导致待测物面积积分光密度 [12] 随其实际面积和周长的增大而减小 。 4 物镜的数值孔径和不同光谱与不同亮度的入射光都可改变同一目标细胞的吸光系数, [11] 导致测量误差。夏潮涌 等认为536/70nm干涉光的光谱范围比520-550nm带通滤光片 为宽,是使用白光照射样品细胞具有较小测量误差的原因。 5 制样误差: 在测量之前,组织细胞需要经过固定、脱水、包埋或冰冻切片、 染色等多 种处理过程,这些处理都可能使细胞内待测成分量或质发生变化,从而影响测量结果。 因此,实验所需的染料要具有对目的细胞(核)内的化学物质选择特异性强的特点, 与所要测量的化学物质的结合具有化学剂量关系。目前用于图像分析仪测量细胞核 [13] DNA含量的染色法多采用Feulgen染色法,且该方法的稳定性已得到证实 。 [14] 6 根据轴外像点照度公式可知 ,显微镜光源即使被调整到视场昀中心,图像分析仪靶 面上的投影图像的背景光强度分布仍不均匀。背景光强度分布不均匀会导致不同密度 和大小的细胞的测量误差值不同,测量误差与细胞大小和密度呈反比,因此夏潮涌等 建议需根据待测细胞的密度和大小选择恰当的物镜倍率,尽力使细胞的AOD值达到一 [11] 定数值以上 。 1.1.3 运用组织原位三维测算法与以细胞核截面面积为单位的测量组织切片 内肝细胞核DNA含量的比较 4暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用前言组织原位三维测算法:将在薄组织切片上测量的目标细胞核的AOD值,与运用体 视学方法在厚组织切片上测量的单个完整肝细胞核的体积volume相结合,计算获得 体积积分光密度VIOD,即组织原位三维测算法获得的单个完整肝细胞核DNA含量。 而以细胞核截面面积为单位的测量方法(简称二维法):只测量薄组织切片内以肝细 胞核截面为单位获得的积分光密度IOD,此种方法未考虑薄组织切片因切片厚度的 影响导致切片内大多数细胞核不完整,而组织三维测算法则是以单个体积完整的细胞 核为基础测量肝细胞核内DNA含量。 1.2 组织切片上测量细胞(核)内化学物质含量的现状 采用图像分析仪测量与分析组织切片上正常细胞核或肿瘤细胞核内DNA含量与倍体 能使组织细胞(核)内对某化学物质的定位、定性和定量分析成为整体。以细胞核切面为 单位测得的积分吸光度,取决于细胞核平均光密度AOD和细胞核切面面积(At)的大小, 前者与切片厚度和单位细胞核体积有关,后者与完整细胞核的体积、形状、大小、细胞极 [7] 性等有关 。薄组织切片内的细胞核只是完整细胞核的一部分,其体积占完整细胞核的比 例主要由其在组织切片内的位置与组织切片的厚度决定,因此,?细胞(核)可因形状、 倍体、体积而致使不是同类的完整细胞(核)在同一薄组织切片上测量得出相同的IOD, 从而被误认为是相同倍体的细胞(核);?倍体相同、而形状与体积不同或相同的完整的 细胞(核)在同一薄组织切片上测量得出不同的IOD,而被误认为是不同倍体的细胞(核); 综上所述,采用与测量细胞学样品DNA含量相同的方法测量薄组织切片上的细胞核DNA [33] [15] [16] 的含量与倍体,严重影响分析结果的可靠性 。Poel 与Sklarew 等已运用体视学方法 在组织切片上测量组织切片内细胞核内化学物质含量,使得测量细胞(核)内化学物质含 量的方法得到初步改善。但上述两种方法仍受切片厚度的影响,只能校正群体细胞核的 DNA含量或倍体,无法提供肿瘤细胞DNA含量和倍体的分布信息及DNA恶性度等指标标 准化的结论。体视学的发展为从事组织学与病理学的研究工作者从肿瘤细胞二维切片的形 态特征推断为三维特征提供了良好的测量工具,相信它与ICM的有机结合,必将加速在组 [33] 织切片上测定肿瘤细胞DNA含量与进行倍体分析方法的改进和完善 。 1.3 肝组织自身的结构特点5暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用前言(1)正常细胞核内的染色质主要分为异染色质和常染色质,染色质结构的紧密程度可因 [17-18] 细胞核的类型和功能状态不同而不同 ,进而导致染色时不同结构状态的染色质 的着色强度也不同。异染色质的结构紧密,不易被盐酸水解,因而在进行DNA含量 [18-20] 测量与倍体分析时会产生一定的“比例性误差Proportionality error” ,将异染色 质比例高的细胞核如淋巴细胞核、精子细胞核作为实验对象进行分析,会增加生物 学因素对图像分析测量结果的影响。肝组织具有细胞类型单一,间质细胞所 占比例 小等特点,与睾丸组织相比,可大大减少非目的细胞对实验的干扰。 [21-22] (2)Carriere R 等研究者早已证实小鼠肝细胞具有多倍体共存且不同倍体细胞核DNA 含量间的比值呈2、4、8等倍数关系。 [23] (3)魏清柱 等提出2~20天的小鼠以二倍体肝细胞为主,35天小鼠具有四种不同倍体的 肝细胞,60天以后小鼠偶见三十二倍体,我们在实验中也发现了年龄越大的小鼠的 八倍体肝细胞也越多。 (4)肝细胞核本身近似球形,运用体视学公式计算其细胞核体积时,与其它形状不 的细胞核相比,其测量误差相对较小。 因此,肝组织是探索组织切片原位三维测算和分析以单个完整细胞(核)体积为单位 的化学物质含量方法的良好模型。 1.4 研究目的 以正常昆明小鼠肝组织内的三种(二、四、八倍体)肝细胞核DNA含量间的比值呈2 或4的倍数关系为理论依据,再次运用探讨组织原位三维测算法测算的以单 个完整小鼠肝细 胞核体积为单位的正常小鼠肝细胞核的DNA含量的可靠性与准确性。 6暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用材料与方法2 材料和方法 2.1 实验材料 2.1.1 实验动物 正常成年(5个月鼠龄)雄性昆明小鼠10只。广东省实验动物中心提供。许可证号: SCXK(粤)2005-0002粤监证字2006AO21。 2.1.2 实验试剂 碱性品红fuchsin basin:美国 Amresco 生物公司 乙醇ethyl alcohol:分析纯,广州化学试剂厂 二甲苯xylene:分析纯,广州化学试剂厂 盐酸hydrochloric acid:分析纯,广州东方红化工厂 磷酸氢二钠disodium hydregenphosphate dodecahydrate:化学纯,汕头化学试剂厂 磷酸二氢钠sosium phosphate monobasic:化学纯,浙江省温州东升化学厂 活性炭carbox active:化学纯,广东台山化工厂 氯化钠sodium phosophate monobasic:分析纯,广州化学试剂厂番禺分厂 2.1.3 主要试剂的配置方法 11N 盐酸 36.7%盐酸 8.4ml蒸馏水 91.6ml 25N 盐酸 36.7%盐酸 40.0ml蒸馏水 60.0ml 3Schiff’s液 碱性品红 1.0g 1N 盐酸 20.0ml 偏重亚硫酸钠 1.5g 活性炭 1.5g7暨南大学硕士学位论文:宫颈脱落细胞 DNA倍体分析在宫颈内瘤样变筛查中的作用材料与方法 蒸馏水 200.0ml 4PH7.4磷酸氢二钠缓冲液Phosphatic Buff, PB?储备液 0.2M 磷酸氢二钠 Na HPO ?2H O 31.2g 蒸馏水 1000ml 2 4 2 0.2M 磷酸氢二钠 NaH PO ?12H O 71.6g蒸馏水 1000ml 2 4 2 ?磷酸盐缓冲液配制 0.2M 磷酸氢二钠19ml 0.2M 磷酸氢二钠81ml 2.1.4 主要试验设备、仪器 图像分析系统 TIGER细胞图像分析仪:重庆大学ICT研究所 NIKON55i显微镜:日本NIKON光学仪器公司 535/35nm带通滤光片:美国光学 Ω仪器公司 CCD黑白摄像头:Mitron1881