猪沙门氏菌病疫苗研究进展

猪沙门氏菌病疫苗研究进展 猪沙门氏菌病疫苗研究进展 苏丹萍,张艳萍,贺东生 (华南农业大学兽医学院,广东广州510642) 沙门氏菌是最常见的多种动物和人的重要病原菌,呈全 球性分布.猪可受到多种沙门氏菌的感染,成为许多猪肉产 品的感染源.因此,猪的沙门氏菌病备受关注. 沙门氏菌为革兰阴性杆菌,无芽孢,无荚膜,具有鞭毛, 能运动.在普通培养基中易生长繁殖.对外界的抵抗力较强, 在水,乳类及肉类食物中能生存数月.加热60?30rain可 灭活,5%石炭酸或1:500升汞于5min内即可将其杀灭. 沙门氏菌菌型繁多,迄今已发现2500个以上的血清型. 沙门氏菌有菌体抗原”0”和鞭毛抗原”H”.根据菌体抗原 结构分为A,B,C,D,E等34个组,再根据鞭毛抗原的 不同鉴别组内的各菌种或血清型.有些仅对动物有致病性如 鸡痢沙门氏菌,鸡伤寒沙门氏菌等;有些是人兽共患病病原, 如乙型副伤寒沙门氏菌,鼠伤寒杆菌,肠炎杆菌,猪霍乱杆 菌等;在沙门氏菌中,有些仅对人类有致病性,如伤寒杆菌, 副伤寒杆菌(甲和丙型)等;引起人类疾病的沙门氏菌主要 属于A,B,c,D,E5组,其中除伤寒沙门氏菌和副伤寒 沙门氏菌外,以B组的鼠伤寒沙门氏菌,C组的猪霍乱沙门 氏菌,D组的畅炎沙门氏菌及E组的鸭沙门氏菌等10多个 型最为常见. 猪沙门氏菌病又称猪副伤寒.各国从猪群中分离的沙门 氏菌的血清型相当复杂,主要有猪霍乱沙门氏菌,猪霍乱沙 门氏菌Kunzendorf变型,猪伤寒沙门氏菌,猪伤寒沙门氏 菌Voldagsen变型,鼠伤寒沙门氏菌,肠炎沙门氏菌等.仔 猪副伤寒是一种侵害仔猪,严重影响养猪业发展的传染病. 其传播快,死亡率高,不仅造成了严重的经济损失,给防疫 工作带来一定困难,也严重影响养猪业的发展.疫苗免疫按 种是防控猪副伤寒的重要手段之一,研究保护力强的的疫苗 提高猪群特异性抵抗猪沙门氏菌病对养猪业的发展和保障公 共卫生安全方面有重要的价值. 1国内猪沙门氏杆菌疫苗的研究 20世纪60年代,中国兽医药品监察所的房晓文等选 用抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌强毒株在含有醋酸铊的普 通肉汤中传代培养,经传数百代后,筛选出一株毒力弱而 通讯作者:贺东生(1968一),男,博士,副教授,华南农 业大学兽医学院,兽医传染病学研究方向. 42猪业科学SWINEINDUSTRYSCIENCE2009年第l2期 免疫原性良好的弱毒菌株,命名为猪霍乱沙门氏杆菌C500 (.CYO0)弱毒株.用免疫原性良好的s.C500弱毒株的培 养物加适宜稳定剂,经冷冻真空干燥制成仔猪副伤寒活疫苗 (ParatyphusVaccineforPiglets,Living),疫苗为灰白色 海绵状疏松团块,易与瓶壁脱离,加20%铝胶生理盐水稀 释液后迅速溶解,呈均匀乳状混悬液.用S.C500弱毒菌株 制成仔猪副伤寒活疫苗,经田间试验和区域试验证明疫苗安 全有效.仔猪副伤寒活疫苗于1965年开始试用,l976年被 批准列入兽医生物制品规程,已在全国许多生物制品厂生产, 对控制仔猪副伤寒病起到很大作用.资料显示,山西省生物 制品厂的仔猪副伤寒活疫苗生产已有30多年的历史,从大 扁瓶固体表层生产,到20000瓶液体通气培养,直至现在的 反应缸液体通气培养,生产量不断增大,生产趋于稳定. 2001年l0月至l1月,通过改进大种的生产工艺,即 改进二级种子制备工艺.改进前:取,?级种子数支,用 少量肉汤将斜面上菌苔洗下,按人装有2000mL肉汤的 10000mL瓶中,37?静止培养24h,期间摇56次.培 养结束后,取样进行纯检和活菌计数,置2,8?保存.改 进后:取一级种子数支,用少量肉汤将斜面上菌苔洗下,接 人装有2000mL肉汤的10000mL瓶中,37?摇床培养适 当时间.培养结束后,取样进行纯检和活菌计数,置2,8.C 保存.这样使菌液冻干前菌数和冻干后活菌数明显提高,在 其他条件不变的前提下,每瓶产品由原来的平均22.6头 份增加到32.4头份.该厂于2001年ll_7月份生产的仔猪 副伤寒活疫苗,冻干前菌数平均为3.19x10CFU/mL, 2001年1011月份改进大种生产工艺后,冻千前菌数平均 为4.48×10…CFU/mL,其结果同辽宁益康生物制品厂马 振字等的试验结果有相同之处,即相同的培养基在培养同样 长的时间下,在一定范围内,终末菌浓度随初始菌浓度的增 高而增高;也有不同之处,即初始菌的最佳浓度不同.这可 能与生产条件及培养基质量不同有关,也叮能与培养大种的 生产工艺不同有关.目前仔猪副伤寒活疫苗是养殖场预防仔 猪副伤寒传染病的主要手段,疫苗生产工艺的改进使活菌数 明显提高,为生产质量可靠的疫苗提供了保证. 仔猪副伤寒活疫苗在我国推广使用20多年来,尤其是 疫苗口服法的采用,使疫苗的使用更加方便和安全,使我国 猪霍乱沙门氏菌病得到了有效控制,取得了可观的经济效益 和社会效益.我国现在有十几家兽用生物制品生产企业生产 仔猪副伤寒活疫苗,全国统计数字显示,年总产量几年来一 直保持在1.5亿头份左右. 猪副伤寒多价苗的研发.随着养猪业向规模化发展,在 大型猪场中,由大肠杆菌引起的仔猪黄痢,仔猪白痢及由沙 门氏菌引起的仔猪副伤寒等仔猪腹泻性疾病引起的仔猪大量 死亡,严重制约了养猪生产的发展.由四川农业大学动物科 技学院王红宁教授等对四川省规模化养猪场常见病原菌的药 敏区系进行了调查,由此研制成功的新型地方株针对性疫苗 有猪沙门氏菌(地方株)多价灭活苗;猪大肠杆菌一沙门氏 菌二联多价灭活苗.以上疫苗目前已在四川绵阳,乐山,南充, 温江,成都,内江等6个重点种猪场及四川温江,德阳,广 汉,蒲江,彭州,自贡等地8个规模化猪场中示范应用,对 仔猪腹泻控制率达95%以上. 2国外猪沙门氏杆菌疫苗的研究 如其他兼性细胞内寄生菌一样,可激发细胞免疫的活 疫苗最有可能预防猪沙门氏菌病.历史上,从1968年英国 的Smith研究的猪霍乱沙门氏菌弱毒株V3和V6菌株获得 美国专利局专利起,已有多种仔猪副伤寒弱毒活疫苗成为商 品苗,欧洲药典收载了仔猪副伤寒活疫苗的质量.仔猪 副伤寒活疫苗在英国曾广泛地应用了许多年,使仔猪副伤寒 减少到可忽略的水平,现已停止使用.最近北美洲引进了猪 霍乱沙门氏菌弱毒疫苗,对控制猪沙门氏菌病的发生起了主 要作用.这些疫苗所用的菌株是本身无毒力的猪霍乱沙门氏 菌,或毒力强的菌株经在猪中性粒细胞中多次传代后获得的 菌株.这些传代的菌株已经丧失了其50kb的有毒力的质粒, 而该质粒是细菌在细胞间生存所必需的.猪在断奶时免疫, 疫苗可保护猪不受同型沙门氏菌感染至少20周.对异型菌 株,此疫苗也有一定的交叉保护作用…. 3疫苗佐剂及其他影响因素 疫苗免疫是人类防治传染性疾病最经济有效的,提 高动物疫苗的免疫应答反应和保护水平是生物医学研究的核 心问之一.除获得免疫保护性抗原外,应用免疫佐剂也是 免疫学研究的焦点所在,目前人类和动物传染性疾病的免疫 防治中急需高效安全和廉价的免疫佐剂,这对现代畜牧业规 模化,集约化养殖动物保健尤为重要. 早在上世纪80年代之前国外就有研究表明,对抗猪副 伤寒TC—l77菌株弱毒菌苗使用了30%硫代硫酸钠溶液作 为溶剂,这种溶剂对鸽和兔的初步试验表明,同佐剂氢氧化 铝,皂素,MKsn和MC一20矿物油相比较,具有较好的 免疫刺激的性质.30%硫代硫酸钠溶液稀释抗猪副伤寒冰干 弱毒菌苗经12h的观察,对沙门氏菌没有杀菌的作用.在 使用30%硫代硫酸钠溶液作为稀释猪副伤寒冰干弱毒菌苗 的溶液是一种良好的佐剂.它能增强菌苗接种后免疫力的产 生.接种菌苗的局部组织出现小吞噬和巨噬细胞反应增强, 淋巴器官中浆细胞数量增多,外周血液B淋巴细胞数量及 其血清中特异性凝集素,和按规程用等渗溶液稀释的同样菌 苗免疫的仔猪相比有较大的增加. CpG序列为近来发现的以非甲基化的CG为核心的特 定寡聚脱氧核苷酸序列(CpGODN),主要激发Thl特征的 体液和细胞免疫反应,促进B淋巴细胞的增殖及其抗体分 泌,激活单核细胞分泌细胞因子和增强细胞毒性杀伤作用. 纳米颗粒是指粒径为l0,100nm的固状胶态聚合物粒子, 可作为活性组分(药物,活性分子,基因,疫苗等)的载体, 通过缓释,靶向输送,提高组分稳定性等方式,延长活性组 分在体内的半衰期,并增强其活性;已用于运载多肽蛋白类 药物,输送免疫调节剂,输送疫苗,初步结果表明纳米颗粒 能够显着提高各类药物的药效作用,具有良好的应用前景. 目前在动物传染性疾病的防治研究中,已有研究应用阳离 子PLG纳米颗粒包裹pUC18一CpG,探索了阳离子纳米颗 粒和阳离子脂质体包裹后的DUC18CpG对猪副伤寒疫苗 接种小鼠免疫系统的体液和细胞免疫应答反应的影响.结果 表明:在pUC18一CpG分子的注射剂量仅为未包裹处理组 的l/5时,阳离子PLG纳米颗粒能明显增强CpG分子对小 鼠的副伤寒疫苗的特异性免疫激活作用;与阳离子脂质体相 比,其免疫刺激作用较强一些.PLG纳米颗粒可能经由提 高pUC18CpG分子进入免疫细胞的效率或保护pUC18, CpG免受体内核酸酶的快速降解等途径,在大幅度减少 DUCl8一CpG剂量的情况下仍能显着增强小鼠的特异性体液 和细胞免疫应答水平,同时接种部位未出现任何损伤和变化, 说明阳离子PLG纳米颗粒具有良好的生物相容性和安全性, 作为质粒的包装分子在动物传染性疾病防治中有很好的应用 潜力[21. 仔猪副伤寒活疫苗生产中存在培养后菌液菌数和冻干后 活菌率不高的问题.原因,可能是培养基营养成分不足 所致.中华人民共和国兽用生物制品规程规定,仔副苗 的使用方法需根据冻干后的活菌率而定,活菌率在50%以 上的,可用于注射或口服;低于50%的,仅限于口服.因 此提高活菌率,既增加了单位疫苗的头份数,又方便了用户 使用,使生产厂获得社会和经济双重效益.在仔猪副伤寒疫 苗的生产中,使用不同的蛋白胨,培养菌液的菌数和疫苗冻 干后活菌率差异明显.从结果看,以际蛋白胨效果最好l3】. 有些仔猪副伤寒活疫苗中出现菌落形态大小不一的两种 菌落,个别批次大小菌落量的比例接近1:l.1992版中 华人民共和国兽用生物制品规程规定,S.C500弱毒株的 2oo9~第12期SWINEINDUSTRYSCIENCE猪业科学43 免疫效力的标准是:”对照家兔应全部死亡,免疫免应保护 4只以上”.本试验结果表明,大菌落免疫组家兔保护5/5, 符合规定;小菌落免疫组家免保护2/5,不符合规定.同时 用1967年冻干的S.C.:O0基本种子做免疫效力试验的结果 为家兔保护4/5,符合规定川. 4沙门氏菌载体疫苗的研发 以侵袭性胞内细菌作为兽用基因疫苗的载体是基因疫苗 研究的一个新热点,减毒猪霍乱沙门氏菌作为潜在猪群口服 活疫苗携带者,已引起了研究人员的巨大兴趣.沙门氏菌是 一 种可产生局部或全身感染的侵袭性胞内菌,通过自然或人 工的方法减毒可降低其对宿主的致病性,但仍然保持良好的 侵袭力,并对黏膜组织有很强嗜性.减毒沙门氏菌被试验性 地用作外源抗原基因载体,证明能直接将外源表达质粒带入 动物机体细胞内,表达相应的蛋白而诱导免疫反应. 目前我国仔猪副伤寒弱毒活疫苗包括口服和注射两种剂 型,使用40余年来使我国仔猪副伤寒得到有效控制,取得 了相当可观的经济效益和社会效益.因此,研究采用S.C:O0 疫苗株运送猪的重要疾病的基因疫苗是较大的实际应用价 值.此外,沙门氏菌作为基因疫苗运载体还有一个优势,那 就是沙门氏菌本身具有免疫佐剂作用,其菌体脂多糖(LPS) 作为一种内在的免疫佐剂,可以有效刺激宿主细胞释放各种 细胞因子,增强免疫力. DorafnguezBerna1等最近研究了缺失rpoS,phoP 调节基因的减毒霍乱沙门氏菌可以在猪肠巨噬细胞与成纤 维细胞中存留并繁殖,对刺激诱导机体免疫细胞很有益处. Shiau等利用减毒猪霍乱沙门氏菌传递伪狂犬病病毒gD基 因疫苗,获得较高的特异性中和抗体,他们进一步研究发现, 减毒猪霍乱沙门氏菌在运载免疫佐剂疫苗时,可以提高自身 的体液与细胞免疫效应.S.COO菌株系我国房晓文在20世 纪60年代初将抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌接种到含有醋 酸砣的普通肉汤培养基中,经数百代传代培养后,于1964 年选育出的一株毒力弱,遗传稳定,免疫原性好的弱毒株; l9761978年对S.C.500菌苗进行了口服免疫研究,结果显 示,口服免疫比注射免疫更加安全方便,在不提高剂量的情 况下免疫效果同样好.刘明秋等将FMDV基因疫苗pBO1 转化S.C#O0后口服免疫家兔,其T细胞在FMDV刺激下 有明显的增殖反应,口服免疫后第2周和8周血清中产生了 针对FM-DV的特异性抗体.乔红伟等构建了CSFV基因 疫苗的工程菌株S.C.500-pI~:AXE2,S.C500t9VAXF2保 持了猪霍乱沙门氏菌原有的形态特征,培养特性和生化特性, 免疫鼠和家兔都产生了抗CSFV和猪霍乱沙门氏菌的中和 抗体,免疫家兔能抵抗猪瘟兔化弱毒株和猪霍乱沙门氏菌强 毒株的攻击.研究结果提示,以猪霍乱沙门氏菌作为基因疫 44猪业科学SWINEINDUSTRYSCIENCE2009年第l2期 苗运载体构建二联或多联猪用疫苗是可行的. 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的纤突糖蛋白(S蛋白) 是唯一能诱导机体产生保护性中和抗体的结构蛋白,其诱导 中和抗体产生的主要区域是N端的4个主要抗原位点.猪 白细胞介素15(IL一15)是一种很好的基因疫苗细胞因子型 免疫佐剂,将二者融合表达可以提高TGEVS基因疫苗的 免疫保护效果.若以S.C500运载融合基因疫苗,则可以起 到双重免疫效果,同时能防制仔猪副伤寒与猪传染性胃肠炎 病,而且口服免疫便于规模化养猪企业操作.为此,有研究 将含有TGEVS蛋白N端主要抗原位点基因与IL一15基因 的融合表达质粒DCC…S,IL15,DCI-SIL15及空载体 质粒pCC—lqeo,pCI—FleO转化S.C500,运用细菌体外传 代培养试验研究不同质粒在运载菌中的稳定性;用携带质粒 的S.C500对哺乳动物ST细胞的黏附,侵袭力和增殖试验 研究不同类型质粒对运载体生物学特性的影响;用BALB/c 小鼠口服免疫试验研究表达质粒在体内的稳定性和运载菌对 小鼠的安全性.结果表明,以S.C:O0菌株为运载体传递融 合表达质粒pCC—SIL一15,pCI—S一1Ll5免疫BALB/c 小鼠具有良好的稳定性和免疫安全性1. 目前,国内外对沙门氏菌疫苗及其免疫技术.已进行了 大量的研究并成功应用于生产实践,S.C500菌株作为一种 新型基因工程载体疫苗用于猪群重要传染病的防控具有广阔 的前景. 参考文献 [1]赵德明,张仲秋,沈建忠.猪病学[M].第9版.北京:中国农 业大学出版社,2008:853854. 【2]武梅,石林,刘世贵,等.纳米颗粒包裹CpG序列对猪副伤寒 疫苗接种小鼠免疫应答的影响【JJ.生物医学工程学杂志,2005, 22(5):975979. 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