丹参川芎嗪注射液对脑缺血缺氧损伤的保护作用及其机制研究（可编辑）

丹参川芎嗪注射液对脑缺血缺氧损伤的保护作用及其机制研究（可编辑） 丹参川芎嗪注射液对脑缺血缺氧损伤的保护作用及其 机制研究 密级: 分类号: 墅丝: 公珏 : 编号:必?革雏旦 同力人员硕士学位论文 ?~’ 论文题目:丹参川芎嗪注射液对脑缺血缺氧损伤的保护作 用及其机制研究 学科专业: 厶笠鲣剖皇组织胚脸堂 作者姓名: 盗塑盎 多小导 指导教师:密级 . 公珏 分类号 编号??. 硕士学位论文 丹参川芎嗪注射液对脑缺血缺氧损伤的 保护作用及其机制研究 凌大林 作者姓名: 卢小东副教授 指导教师: 邵启祥教授 陈永昌教授 小组成员: 狄荣科教授 朱海青教授 张志坚教授 金洁教授 申请学位: 同等学力申请硕士学位 学科专业: 入体解剖与组织胚胎学 年月 论文答辩期: 学位授予单位: 江苏大学 学位授予同期: 年月 陈永昌 答辩委员会主席:独创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工 作所 取得的成果。除文中已注明引用的内容以外,本论文不包含任何其他个人或 集体已经发 表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确 方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 褫非 ?口;年月厂日 日期:学位论文版权使用授权 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权江 苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ,在 年解密后适用本授权书。口 本学位论文属于 口 不保密。? 副 捌名 学位论文作者签名: 雏刻 夕吞大珠 步.. 导 , 汐 乙 彩 , 年 ,明 】】 ?弓年月同 配/江苏大学硕士学位论文 摘 要 目的: 通过建立新生大鼠的原代皮层神经元低氧损伤模型,探讨丹参川芎嗪注射液 对缺血缺氧条件下对神经细胞的保护作用及其相关机制;利用.谷氨酸 ,刺激.神经细胞,模拟脑缺血早期的兴奋性神经毒性损伤,造 成神经细胞凋亡的模型,初步丹参川芎嗪注射液的保护作用及抗凋亡机 制。 方法: 选用新生大鼠,分离出双侧大脑皮层,培养原代皮层神经细胞,利 用与细胞共孵育制备神经细胞低氧损伤模型。分四组进行分析:?正常对 照组;?低氧损伤组;?丹参川芎嗪处理组;?川芎嗪处理组; 观察各组之间原代皮层神经细胞的一般形态学及凋亡相关形态学的改变; 法分析神经元存活率;测定各组神经细胞乳酸脱氢酶释放 ? 率、活性氧簇水平;荧光倒置显微镜分析线粒体膜电位的变化: 分析,、的表达 测定各组神经细胞.的活性, 水平。 利用.诱导?细胞的凋亡,观察.、丹参川芎嗪及川芎嗪 对.细胞的形态学变化;各组细胞存活率和神经细胞外液活性; 利用.检测各组凋亡相关基因.幂 的表达水平。 结果: 成功培养原代皮层神经细胞,低氧损伤后,神经细胞数量减少,突起明 显缩短,细胞核固缩、碎裂,呈现凋亡样改变:丹参川芎嗪注射液较川芎嗪更 能 明显改善神经细胞损伤和细胞核的凋亡现象; 低氧损伤后,神经细胞存活率显著降低,神经细胞释放率明显增加, 神经细胞内水平显著增加,线粒体膜电位增高,而丹参川芎嗪较川芎嗪能够 更好地提高神经细胞存活率,降低释放率和水平,抑制损伤后线粒体 膜电位的增高:江苏大学硕士学位论文 低氧损伤后,丹参川芎嗪较川芎嗪能够更明显地抑制的活化, 使其活性降低;显著降低蛋白水平,但未改变.蛋白的表达,进而降低 /一比值。改善神经细胞的凋亡状态; 丹参川芎嗪注射液较川芎嗪能够更显著地减轻.导致的神经细胞的 形态损伤,提高细胞的存活率,降低细胞活性; 丹参川芎嗪注射液和川芎嗪均能明显减少引起的神经细胞的凋亡 率,显著降低基因的表达,但未明显改变.基因的表达,从而降低了 /.比值。 结论: 在体外,丹参川芎嗪注射液通过抑制低氧损伤的神经细胞内.的活化, 降低蛋白表达水平,从而降低损伤的细胞内氧自由基水平和胞内的释放 率,抑制线粒体膜电位的增高,对缺血低氧损伤的神经细胞起到良好的保护 作用; 关键词:丹参川芎嗪;川芎嗪:凋亡;.;神经细胞;.细胞株江苏大学硕士学位 论文 ; ? 嬲. ? . . : /. , . ,., . . ,,., . ? , . . ., . ?. :, , . . , ,江苏大学硕士学位论文 ,. . , , /. 一, , . , ? . /.. . , . : ;;;;; ? 江苏大学硕士学位论文 目 录 一 务 章 绪论? ? 本论文研究的目的、方法、实验设计及研究意义? 研究目的: ? 研究方法和技术: ? 实验的设计: 研究意义: 二 ?粒 章 丹参川芎嗪注射液对低氧损伤大鼠皮层神经元的保护作用研究 ? 材料与方法 ?? 实验材料? ? ? 实验动物 ? 药品与试剂 ? 实验方法? ? 原代皮层神经细胞培养? ? 原代皮层神经细胞低氧损伤模型的制备 ? 低氧损伤后神经细胞一般形态学变化? ? .“ 低氧损伤后神经细胞突起及细胞核的变化? 检测低氧损伤后的神经细胞活性一 ? 石 释放率的测定??一 ? 的测定? 召 线粒体膜电位的荧光检测 ? .活性分析? 川 小 检测.、表达变化勉 结果勉 低氧损伤后神经细胞突起及细胞核的变 化勉 低氧损伤后神经细胞存活率的变化拉 低氧损伤后神经细胞释放率的变化勉 低氧损伤后神经细胞的变化毖 低氧损伤后神经细胞线粒体膜电位的变化江苏大学硕士学位论文石 低氧损伤后神经细胞.的变化?一一 低氧损伤后神经细胞.、的表达变化讨论?一 三 第 章 丹参川芎秦注射液对致小胶质细胞激活的影响 王 材料和方法 蔓 实验材料? 王 仪器与设备 王 实验方法? 支 大鼠原代小胶质细胞的培养王 大鼠原代皮层神经元.胶质细胞共培养 王细胞的免疫鉴定 王细胞培养液中含量的检测 王细胞培养上清中.的检测? 王 石 统计学分析 王 结果王 一般形态学观察? 王 细胞免疫鉴定王 含量测定王 .含量测定 王 讨论第弭四立早 丹参川芎嗪注射液对谷氨酸致.神经细胞凋亡的保护作用 禾 材料和方法 禾 材料??。禾 方法今 细胞培养. 禾 丹参川芎嗪对.细胞的毒性作用禾 丹参川芎嗪对谷氨酸致.细胞形态损伤的作用禾 丹参川芎嗪对谷氨酸处理的?细胞存活率的影响? 禾 丹参川芎嗪对细胞释放的影响? 江苏大学硕士学位论文 ... 丹参川芎嗪对谷氨酸所致神经细胞凋亡的保护作用? .... /荧光双染观察丹参川芎嗪的抗凋亡作用 .... 丹参川芎嗪对凋亡相关基因和表达的影响 ... 统计学分析 . 结果.. 丹参川芎嗪对.细胞的毒性作用分析 .. 丹参川芎嗪对.损伤.细胞形态的保护作用? .. 丹参川芎嗪对致.细胞存活率的影响 .. 丹参川芎嗪对细胞培养上清中活性的影响? ........ .. 丹参川芎嗪对所致神经细胞凋亡的保护作用 ... 聊荧光双染观察丹参川芎嗪的抗凋亡作用 ... 丹参川芎嗪对凋亡相关基因表达的影响??” . 讨论 第五章 主要结论和展望 . 结论. 展望 参考文献 中英文对照及缩略语? 攻读硕士学位期间发表的文章 江苏大学硕士学位论文江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 脑缺血、缺氧引起的脑损伤是一大类脑部疾病的病理改变基础,如脑卒中、 中风、癫痫、新生儿脑瘫等等【圳。近年来,医药研究领域对于中风发生后脑 细胞不可逆损伤的机制进行了大量的研究,如导致神经元死亡的原因以及使神经 元抵御死亡的策略。在缺血脑组织中至少有三种基本的细胞死亡机制:兴奋性毒 、 性损伤和离子稳态失衡钙超载、氧化/硝基化应激/ 细胞凋亡性死亡【卅。这些机制相互交错,介导神经元、胶质细胞和血管成分的损 伤;在亚细胞水平,影响线粒体、细胞核、细胞膜、内质网和溶酶体的功甜孓】。 细胞体和突起以及突触末梢均受累,细胞死亡通过多种机制促使细胞破裂、溶解、 吞噬或皱缩发生【铀】。内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞、基底膜、小胶质细胞、 神经元以及细胞外基质之间的动态相互作用在脑血管疾病的发生发展中起着重要 的作用,有人将这一动态的结构复合体称为神经血管单元【叫。神经血管单元的提 出为我们进一步研究脑血管病的机制,以及寻找最佳的治疗方案提供了新的机遇。 脑是机体代谢最为活跃的器官,其正常的功能活动必然依赖足够的氧气和 葡。 萄糖。脑缺血的极早期,在几分钟内可导致神经细胞氧化磷酸化能力减弱, 合成减少,离子泵功能部分失效,特别是..酶功能减弱,使大量 内流,外流,细胞膜电位下降,产生去极化【】。细胞膜去极化导致神经细胞 突触前释放兴奋性氨基酸,兴奋性氨基酸主要通过受体活化方式而起兴奋性介质 作用,受体活化效应主要引发大量的内流,同时激活细胞内库的释放, 导致细胞内游离超载,激活了各种降解酶如酶、钙调神经磷酸酶、 蛋白酶和磷脂酶,引起、蛋白质和磷脂降解,细胞代谢、结构与功能多方面 的异常改变,神经细胞逐步死亡【’。?。同时过量沉积于线粒体,使线粒体氧 化磷酸化失偶联进一步加重,膜电位丧失,呼吸链解体,导致细胞能量的严重丢 失,同时致使经单电子还原生成超氧阴离子增多,产生的大量自由基与 脂质、蛋白质及核酸发生反应,引起膜脂质过氧化,导致膜损伤,线粒体功能障 碍,细胞溶解和组织水肿等一系列损害作用,称之为自由基连锁反应【?。此外, ,开放,定位于线粒体 线粒体通透性转运通道 的一些因子,如细胞色素、.家族和前体等释放到细胞质中,引发 蛋白水解激活的级联反应,最终导致依赖 和途径的细胞凋亡 【.。 .是一种重要的炎症介质,参与机体免疫应答和炎性反应。大鼠大脑中动 ,后 脉闭塞 即可诱导一仅表 江苏大学硕士学位论文 达忽】。.能通过促进凝血、增加内皮细胞通透性及诱导粘附分子或其他炎性 介质表达,增加血脑屏障 ,的通透性,加重缺血性脑损 伤心。在脑损伤后. 的过度表达对组织损伤机制主要有以下几个方 ,. 面【:刺激细胞间粘附分子. 表达增高,致使白细胞滚动、贴壁,阻塞微血管,导致微血管迟发性低灌注, 破 坏基底膜。浸润到组织发挥细胞毒性作用,继之形成脑水肿。损伤血管内皮 细胞,使血管通透性增加,还可诱导血管内皮细胞产生凝血活性,使血栓烷 ,、 ,、血小板激活因子 凝血因子?增加,同时抑制内皮细胞对抗凝血蛋白旁路辅助因子的活性,从 而使 内皮细胞表面成为促凝状态,引发血栓和出血。影响血管舒缩活性物质的表 达。有学者经脑内给予.后发现,前列环素,、的产 生增多,这些因子除了影响凝血过程之外,还可促成血管舒张因子下降和内 毒素 增加,使血管收缩,增加局部卒中的危险性和脑缺血损害。 触发细胞凋亡。 另外一【对毛细血管有直接毒性作用,如可导致微小动脉痉挛,增加毛细血管通 透性,进而开放,加重外周白细胞浸润和脑水肿。.【还可激活多形核白细胞,增加白细胞.内皮细胞粘附分子 ,的表达,促使白细胞粘附于毛细血管,并逐渐渗透到脑组织 邺引。另外,?也可促使星形胶质细胞中的一、.等因子的表达, 起协同致炎作用【弼。?【除具有对毛细血管直接毒性作用外,还可诱导血管活 性物质释放,导致血管收缩,减少局部脑血流量,并可增加毛细血管通透性,进 一步加重的损害,促进脑缺血及水肿的发型】。 是由存在于内皮细胞或神经元胞浆中的一氧化氮合酶 ,催化左旋精氨酸.产生的,在维持正常细胞的功能以及 介导某些病理损伤过程中都具有重要作用【.】。脑缺血炎症级联反应发生后, 水平上调,在缺血后. 至最高点。蛋白水平的增加伴随 活性的增加和以及的衍生物过氧亚硝酸盐产生增加。由血管中的以及 侵入到缺血脑组织中的中性粒细胞诱导表达,在缺血脑组织中也有表达【。研 究表明,缺失的小鼠在后神经症状减轻,梗塞面积减小。而在中风 个月后的病人脑脊液中代谢产物硝酸盐的量仍然是增加的,表明以及 的增加是伴随脑缺血的长期过程【叫。及其衍生物的毒性作用包括抑若合 成酶,损伤,过氧亚硝酸盐的氧化损伤等途径 。由上可知,炎症级联反 应贯穿于脑缺血损伤的整个过程,炎性因子在介导脑缺血后损伤以及脑水肿 过程中起着重要作用。江苏大学硕士学位论文 ,是中枢神经系统内含量最高的兴奋性氨基酸, 谷氨酸 在维持神经细胞正常信号传导中起着重要的作用。但过量的释放,激活受 体,继而引起一系列病理反应,导致神经细胞变性坏死。研究表明,脑缺血时 细 胞膜通透性增高,释放增加、摄取减少,胞夕大量积聚,过量作用于 受体,离子通道开放,引起大量外流, 、、’和内流,胞内 钙超载。细胞内浓度升高是神经元损伤的机制之一,其后果是多方面的,除 可激活一系列依赖性酶,包括蛋白激酶、一氧化氮合酶、 核酸内切酶、磷脂酶等,触发花生四烯酸代谢瀑布、黄嘌呤氧化酶系 活化产生自由基,造成细胞损害外,亦可由激活弓起的继发性损伤。神经 细胞和胶质细胞的细胞膜上存在谷氨酸/胱氨酸转运体/ ,其作用是将胞内转运出胞,同时将胱氨酸,从胞 外转运入胞【.。在胞内还原为半胱氨酸,,后者是谷胱甘 肽的合成原料,也是其合成的限速因素。当细胞夕过多时可抑制谷氨 酸/胱氨酸转运体的功能,使胞减少,从而导致合成减少【卜】。是 脑内重要的活性氧清除剂,故胞夕过多使细胞内氧自由基堆积,从而对细胞 产 生毒性作用。神经细胞缺血性损伤与信号转导异常所导致的胞内浓度升高 密切相关,细胞信号转导异常是神经细胞变性的“最后共同通道。因 而在缺血过程中,兴奋性氨基酸与氧化应激以及细胞内钙超载相互偶联在神 经细 胞的损伤中具有重要作用。 缺血过程中,兴奋性氨基酸与氧化应激以及细胞内钙超载相互偶联对神经细 胞产生损伤,会破坏线粒体膜,最终导致线粒体膜电位的下降和钙离子动态 平衡 。。通道是由 ,的开放研。 的崩溃,线粒体孔 线粒体一些内膜外膜蛋白组成的,定位于内外膜接触点,并可以无选择性地 允许 ?.分子通过。这个通道的开放通常由于线粒体基质内的高渗透压使线粒体 内、外梯度消失,呼吸链脱偶联,能量产生中断。线粒体孔不放不只降低了 膜电位而且释放出小的基质分子,导致呼吸链功能终止。另外,孔的开放还会 由于水和溶质的进入使基质肿胀并导致外膜破裂,释放出包括细胞色素 ? ,.在内的各种活性蛋削’。引。 虽然至今人们仍在研究致神经细胞死亡的确切机制,但是所导致的细 胞内钙超载是重要的机制之一。束激导致细胞内、外的池释放大量的 聚积在胞浆【。活化受体 ,和受体 【一一一一一一 ,导致 内流。代谢性谷氨酸受体 ,的激活导致活江苏大学硕士学位论文 化,产生,使细胞内钙池释放。其它可能的途径包括雷诺定受体 的激活和/交换体的逆转导致内质网释放【。 一蛋白家族是多种病理生理过程中一组重要的内源性细胞活性调节因子。 其活性的发挥主要直接依赖于【表达的上调及其向线粒体膜的转位【】。当 转位至线粒体膜时,即发生同源二聚化,并可通过改变线粒体功能引发凋亡级 联下游天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 ,,同时促使线粒体释放多种凋亡相关因子至胞浆。相反地, ./异源二聚体的形成会抑制凋亡级联反应【,,因而./在细胞凋 亡过程中具有重要意义。 丹参川芎嗪注射液是在丹参注射液与盐酸川芎嗪注射液的基础上研制出的中 西药复方制剂,其组分为丹参素和盐酸川芎嗪。丹参川芎嗪注射液已被广泛的用 于心、脑和肾各个器官的保护性治疗【?。为了进一步明确该注射液保护缺氧、 缺血引起脑损伤的作用机制,通过在分子和细胞水平建立缺血性脑血管疾病试验 模型,研究丹参川芎嗪注射液在针对脑血管缺血缺氧损伤及其神经血管单元 成分 中的保护作用机制,为进一步研究丹参川芎嗪注射液在脑缺氧、缺血性损伤 保护 作用中的分子药理学机制奠定一定的理论基础。 .本论文研究的目的、方法、实验设计及研究意义。 ..研究目的: 通过建立新生大鼠的原代皮层神经元低氧损伤模型,探讨丹参川芎嗪注射液 对缺血、缺氧条件下对神经细胞的保护作用及相关机制;采用脂多糖 ,刺激大鼠的小胶质细胞,探讨丹参川芎嗪注射液对激 活的小胶质细胞的影响;利用.束激?神经细胞,模拟脑缺血早期的兴 奋性神经毒性损伤,造成神经细胞凋亡的模型,初步分析丹参川芎嗪注射液 的保 护作用及抗凋亡机制。 ..研究方法和技术: 细胞培养技术、荧光显微镜技术、免疫化学技术、、.技术、 等。 ..实验方案的设计: 江苏大学硕士学位论文 丹参川芎嗪注射液对低糖低氧损伤大鼠皮层神经元的保护作用研究,其实验 技术路线如下: 丹参川芎秦注射液对致小胶质细胞激活的影响的研究,其实验技术路线如 下:江苏大学硕士学位论文 丹参川芎嗪注射液对致.神经细胞凋亡的保护研究的技术路线如 下: . 神经细胞. 川芎嗪组 丹参川芎嗪注射液组 倒置 神经 汀. 相差 法测 细胞 和 检测 显微 染色检测 凋亡相 定神 镜观 经细 释放 各组神经 关基因 . 察各 胞的 率测 细胞的凋 组形 存活 定 亡情况 和 态学 率 的表达 变化 ..研究意义: 本研究选用新生大鼠的皮层神经元为研究对象,利用连二亚硫酸钠 与细胞共育诱导神经细胞的低糖、低氧损伤,通过观察皮层神经元一般形态 学及 凋亡相关形态学的改变,检测神经元存活率、神经细胞外液活性、活性 及一和蛋白的表达水平,研究丹参川芎嗪注射液对皮层神经元损伤的保 护作用。此外用.刺激.细胞株,观察?细胞的形态学变化, 检测细胞存活率和神经细胞外液活性;利用.检测凋亡相关基因. 和 的表达水平,探讨丹参川芎嗪注射液对.诱导的.神 经细胞凋亡的保护作用的机制。以上实验研究为进一步研究丹参川芎嗪注射液在 脑缺氧缺血性损伤保护作用中的分子药理学机制奠定了一定的实验基础。 江苏大学硕士学位论文 第二章丹参川芎嗪注射液对低氧损伤大鼠皮层神经元的保 护作用研究 在缺血性中风的治疗中血流重建或增强缺血区的血流供应是缺血脑组织修复 损伤的必需条件,但同时带来的再灌注损伤也是目前备受关注的问题。研究表明, 丹参川芎嗪注射液治疗急性脑梗死的临床疗效较好,且疗效优于复方丹参注射液。 其能够很好地降低血脂,显著改善急性脑梗死患者神经功能缺损评分的指标,并 改善血液流变学相关指标。为了在细胞水平研究丹参川芎嗪注射液对神经细 胞的保护作用,我们建立了原代皮层神经元低糖、低氧/复供损伤模型,探讨丹参 川芎嗪注射液对缺血缺氧条件下神经细胞的保护作用及机制。 .材料与方法 ..实验材料 ...实验动物 新生 大鼠,由中国医学科学院动物所提供,合格证号:京 ?。 ...药品与试剂 丹参川芎嗪注射液贵州拜特药业公司;/培养基公司; 甲基噻唑基四唑、胰蛋白酶、 公司;标准胎牛 血清和马血清产品;乳酸脱氢酶 , 测定试剂盒、活性氧簇 测定试剂盒南京建成 , , 生物工程研究所;兔抗鼠微管相关蛋白抗体 .抗体、罗丹明标记的羊抗兔二抗北京中杉试剂公司;其他为国 产分析纯。 ..实验方法 ...原代皮层神经细胞培养 取内新生大鼠只,%乙醇皮肤消毒后,剥离皮肤及颅骨,显 露出完整的脑组织,分离出双侧大脑皮层,用.’液反复漂沈,去除血管及江苏 大学硕士学位论文 ×脑膜。将皮层剪碎成 的组织块,加入.%胰蛋白酶,? 孵育 ,期间每隔 摇动一次。加入/培养基含%胎牛 /, 血清,青霉素 /,链霉素 /谷氨酰胺终止消化, /, ,离心,弃上清,加入/完全培养液 。轻柔吹打, 经目金属细胞网过滤,计数。以/密度接种于预先用.%多聚赖氨 酸铺被的孔培养板 培养皿 孵、孔培养板 吼或 /,置培养箱中,?、%、无菌、饱和湿度条件下培养。 /, 后,换以维持培养基含%添加物,青霉素 /,链霉素 , 谷氨酰胺,培养至 加入终浓度为 ./的阿糖胞苷作用 进行实验。 之后每隔 换半液,培养至 ..。原代皮层神经细胞低氧损伤模型的制备 模型制备前,神经细胞以无糖’平衡盐溶液洗涤次。每孔加入 终浓度为 / 。将神经细胞随机分为组: 的维持培养基,作用 ?正常对照组:/培养基培养,在制备低氧模型时同步换以新鲜维持培 / 养基;?低氧损伤组:换以终浓度为 ;? 的维持培养基作用 / 丹参川芎嗪处理组:换以 的维持培养基后,加入终浓度为 / ;?川芎嗪处理组:换以 的 /的丹参川芎嗪,共同孵育 。 维持培养基后,同时加入终浓度为/的川芎嗪,共同孵育 ...倒置相差显微镜下观察低氧损伤后神经细胞一般形态学变化 各组神经细胞孵育 后在倒置相差显微镜下观察低氧损伤后神经细胞以及 丹参川芎嗪和川芎嗪保护下神经细胞一般形态学变化。 ...免疫细胞化学检测神经细胞突起及细胞核的变化 将大鼠皮层神经细胞培养于 培养皿中,于培养第天制备低氧损伤 模型并进行.荧光染色及 核染色。操作过程:将培养液弃去, 以%低聚甲醛室温固定 .洗涤× :.% . , 作用 将细胞穿孑,再由孵育× ;滴加无关动物血清普通马血 清,孵育 后,加入兔抗鼠.抗体:,过夜,次 冲洗后× ,滴加罗丹明标记的羊抗兔:,同时加入 ./ ,常温孵育 后,由冲洗× ,吹干后立即由缓冲甘 油封固,于置荧光倒置相差显微镜下观察神经细胞突起及其细胞核的变化。 ... 检测药物作用后的神经细胞活性江苏大学硕士学位论文 于孔培养板中培养神经细胞,按“..分组,每组设孔,于培养第 天制备低氧损伤模型。然后吸净原培养液,迅速加入./的 ,置 于细胞培养箱继续培养 ,吸弃培养液,加入于培养液相同量的二甲亚砜 ,将培养板平行振荡 后,在酶联免疫检测仪上测定值 ,为空白对照。 神经元存活率试验组值.空白对照值/对照组值.空白对照值×% ... 释放率的测定 于孔培养板中培养神经细胞,按“..”分组,每组设孔,于培养第 天制备低氧损伤模型。吸出上述细胞培养液,每孔混匀后,取肛与山乳酸 ;然后加入 盐缓冲基质混合,?水浴 肛,?水浴 辅酶 / ;加入. ,.二硝基苯肼 ;再加入. / ,于?水浴 . ,于 处测定值。以空白培养基作为空白对照。将残留细 胞反复冻融,加入等体积的细胞培养液,细胞内测定方法同细胞外液。 释放率细胞外液 值/细胞外液 值细胞内 值×% ... 的测定 . 低氧损伤后,神经细胞内含量采用双乙酸双氯双氢荧光素 ,?? 一一’,’一 法进行检测。检测原理:’,’.二氯氢化荧光素二酯’,’. ,.进入细胞后,经酯酶作用脱去二酯生成’,’.二氯氢化荧光 素’,’.,,被超氧阴离子和过氧化氢等 氧化生成发荧光的’,’.二氯荧光素’,’.,,通过检 后, 测水平的变化即可反映水平的变化。神经细胞经作用 加入.终浓度为 ,以激发波长 ./,于?孵育 和发射波长 检测荧光强度。 ...线粒体膜电位的荧光检测 . 神经细胞进行低氧损伤后,吸弃原培养液,加入含 / , ,’,,‘一一,,,’ 的培养基,置于培养箱中孵育 ,以培养基洗涤× ,荧光倒置相差显 微镜下观察线粒体膜电位的变化。极化的线粒体显示红色荧光,去极化后则 由红 江苏大学硕士学位论文 色转换为绿色荧光,线粒体膜去极化后红色/绿色荧光强度比率的变化可反 映线粒 体膜功能的变化。 ... 活性分析 活化的可催化底物?.. .,..,产生黄色的.,,通过 / 测定其光密度来检测.的活性。神经细胞进行低氧损伤后, 离心 ,收集细胞。沉淀中加入 细胞裂解液确 /, /, /, /,% , 。取上清,法检测蛋 .,冰上放置 ,,离心 白浓度。活性检测于孔板中进行,每孔加入待测样品/,嬲弱. 底物 ,于 /,终体积为?,并设置空白对照。混匀后?孵育 处测定值。实验过程中同时制备标准曲线。最终.的活性以 正常对照组为标准,其余各组与之相比表示。 ... 检测、表达变化 / 离心 神经细胞进行低氧损伤后, ,收集细胞。加入山 细胞裂解液,冰上放置 , 离心 , 。取上清,法定蛋白 浓度。取 实验,即%.电泳,转膜,% 蛋白进行 室温封闭 ,加入一抗,过夜,漂洗次,加入辣根过氧化物酶标记的 二抗,显色。 ... 统计学处理 数据均以可表示,各组间的差异比较采用单因素方差分析. ,.为差异有统计学意义。 .结果 ..低氧损伤后神经细胞突起及细胞核的变化 正常培养的神经细胞胞体饱满,神经元之间形成网络,细胞核染色均一。低 氧损伤后,神经细胞数量减少,突起明显缩短,细胞核固缩、碎裂,呈现凋亡样 改变。丹参川芎嗪作用后,神经细胞损伤减轻,其中,神经细胞突起明显改善, 细胞核凋亡征象减轻。川芎嗪作用后,神经细胞损伤亦有减轻,细胞核凋亡征 象 有所改善见图。 江苏大学硕士学位论文 图神经细胞形态学变化正常对照组; 丹参川芎嗪组; 川芎嗪组 低氧损伤组; ..低氧损伤后神经细胞存活率的变化及药物的保护作用 经处理后,‘神经细胞存活率显著降低,与正常对照组比较差异有统 计学意义.。加入丹参川芎嗪及川芎嗪后,均能明显提高神经细胞存活 率,且丹参川芎嗪组.%优于川芎嗪组.%,两者与低氧损伤组比较 差异均有统计学意义氏.。丹参川芎嗪组与川芎嗪组比较差异有统计学意 义尸.。见图 ,、 邑 肘 们 烛 禽 再 嘣 最 正常对照沮 低氧损伤组 丹多?芎唼组 川芎囔组 图低氧损伤后神经细胞存活率的变化及药物的保护作用江苏大学硕士学位 论文 低氧损伤组与正常对照组比较,.;?幸丹参川芎嗪组与川芎嗪组比较,.; 撑丹参川芎嗪组与低氧损伤组比较,.。 ..低氧损伤后神经细胞释放率的变化及药物的保护作用 处理后,神经细胞释放率与正常对照组相比明显增加,差异有 统计学意义.,.。丹参川芎嗪作用及川芎嗪作用后,均显著减低了低氧损 伤后神经细胞的释放率,差异有统计学意义.。丹参川芎嗪组优于 川芎嗪组,两者比较差异有统计学意义.。见图。 ? 斛 餐 譬 兮 的蟠?踮如巧加圬加 正常对照组 低氧损伤组丹参川芎唼组 川芎唼组 图低氧损伤后神经细胞释放率的变化及药物的保护作用 .低氧损伤组与正常组比较,.;幸幸丹参川芎嗪组与川芎嗪组比较, .;??丹参川芎嗪组和川芎嗪组与低氧损伤组比较,.。 ..低氧损伤后神经细胞的变化及药物的保护作用 低氧损伤后,神经细胞水平较『常培养组明显增加,差异有统计学意义 氏.。丹参川芎嗪作用及川芎嗪单独作用后,均显著减低了神经细胞内 水平,与低氧损伤组比较差异均有统计学意义氏.。丹参川芎嗪组优于川 芎嗪组,两者比较差异有统计学意义尸.。见图。 江苏大学硕士学位论文 盆 正常对照组低氧损伤组 丹参川芎唼组川芎唼组 图低氧损伤后神经细胞的变化及丹参川芎嗪的保护作用 低氧损伤组与正常对照组比较,.;事丹参川芎嗪组与川芎嗪组比较, .;撑丹参川芎嗪组和川芎嗪组与低氧损伤组比较,.。 ..低氧损伤后神经细胞线粒体膜电位的变化及药物的保护作用 正常培养的神经细胞主要呈现均匀的橙红色,低氧损伤后细胞绿色荧光显著 增强,表明细胞受到损伤后线粒体膜电位增高尸.。丹参川芎嗪及川芎嗪 单独作用后均明显抑制了膜电位的增高,与低氧损伤组相比差异有统计学意 义 氏.。见图,图。 六正常对照组江苏大学硕士学位论文 图 神经细胞线粒体膜电位的变化 .酎彗雠艘欺取印毒;,哪目箍罨掣脚崔蝗掣埘 低氧损伤组 丹参川芎唼组 芎啧组 正常对照组 图低氧损伤后线粒体膜电位变化和药物的保护作用低氧损伤组与正常对照 红比较,.;撑丹参川芎嗪组和川芎嗪组与 与低氧损伤组比较,. ..低氧损伤后神经细胞的变化及药物的保护作用 一在细胞凋亡信号传导通路中起着重要的作用,其活性的高低与细胞 的凋亡有密切的关系。实验结果表明,在正常情况下,.活性较低;低氧 损伤 ,神经细胞内一的活性明显升高.,丹参川芎嗪作用及 川芎嗪单独作用后,均明显抑制了.的活化,使其活性降低。 一 一一 .、 一 型一姆???分母。,? 正常对照组低氧损伤组丹参川芎嚷组川芎唼组 江苏大学硕士学位论文 图低氧损伤后神经细胞的变化及丹参川芎嗪的保护作用 木低氧损伤组与正常对照组比较,.;撑丹参川芎嗪组和川芎嗪组与与 低氧损伤组比较,.。 ..低氧损伤后神经细胞、的表达变化及药物的保护作用 在正常培养的神经细胞中,/.的比值较低,而低氧损伤 后,其 /.的比值明显升高尺.,丹参川芎嗪和川芎嗪分别单独作用后,与 低氧损伤组比较,两者均明显降低了/.的比值且差异有统计学意义 尸.。 . . 土 鼍 慧. 曲 . 蠛黪绷斓黼黪 嗣譬黪 正常对照组 恹氧损伤组 丹参川芎唼组 川芎唼组 图低氧损伤后神经细胞.、的表达变化及药物的保护作用 一 枣低氧损伤组与止常对照组比较,.:丹参川芎嗪组和川芎嗪组与 与低氧损伤组比较,.。 .讨论江苏大学硕士学位论文 脑是机体代谢最为活跃的器官,其正常的功能活动必然依赖足够的氧气和葡 萄糖。脑组织缺血时,组织缺氧,葡萄糖减少,导致神经细胞氧化磷酸化能力 减 弱,无氧酵解增加,合成减少,离子泵功能部分失效,特别是.. 酶的功能减弱,改变细胞的膜电位,产生大量的氧自由基、蛋白质等物质,并 启 动细胞的凋亡程序,导致脑组织的损伤。低糖、低氧培养引起神经细胞损伤 是体 外模拟脑缺血的常用模型,本实验以物理性低氧与低糖联合致神经细胞损伤 为模 型,可较好地模拟了脑缺血所致神经损伤病理损伤过程?】。 脑组织受损时,由于缺血缺氧,会引起乳酸脱氢酶的显著升高,而 且活性的改变与脑组织的损伤程度呈一定的相关性【.】。活性氧簇 是需氧细胞在代谢过程中产生的,中、高浓度的可诱导细胞凋亡,低浓 度的自由基能够影响一系列信号转导途径。机体内的自由基通过其浓度调节 细胞的生长平衡。脑缺血时,生成增多,通过攻击线粒体诱导细胞色素 的释放,进而激活基因,诱导细胞的凋亡,此外还可通过损 伤细胞内的等方式诱导细胞的凋亡,从而进一步损伤脑组织【.。】。 是一组存在于细胞的胞质中且结构上相关的半胱氨酸蛋白酶,能够特 异地切断天冬氨酸残基的肽键,并通过一系列的级联反应导致细胞的凋亡, .在其中发挥着关键作用。在缺氧缺血性脑病中,. 表达量和蛋白的活性明显增加,介导神经细胞的凋亡,.的抑制剂能 够显著降低其活性,减少的断裂和细胞的死亡,延长脑组织缺血缺氧 的治疗时间窗【’。一是细胞重要的抗凋亡基因,在缺血再灌注损伤中 发挥重要的作用。.通过抑制细胞质中的细胞色素的释放,降低 .的活性,发挥抗细胞凋亡的作用,但.过度表达并不影响促凋 亡基因的表达 。具有较强的促凋亡功能,能与.形成异源二 。 聚体,阻断.的抑制凋亡功能 我们的实验表明,在体外,丹参川芎嗪药理效应上表现出对神经细胞的 保护作用,它能够减轻低氧、低糖环境下神经细胞的形态学损伤,同时明显降 低 细胞内氧自由基水平,降低胞内的释放率;在线粒体膜电位方面,丹参川芎 嗪能够提高低氧损伤的神经细胞线粒体膜电位的功能。 低糖、低氧损伤能够明显增加神经细胞的凋亡,形态学上表现为调往相关细 胞核形态学改变,丹参川芎嗪作用后,明显抑制了.的活化,使其活性降 低,一蛋白表达未见改变,而蛋白水平明显降低。/一比值明显降 低,说明月.参川芎嗪具有明显的抗神经细胞凋亡作用。 江苏大学硕士学位论文 第三章丹参川芎秦注射液对致小胶质细胞激活的影响 小胶质细胞是中枢神经系统主要的免疫效应细胞。脑缺血时,尤其在半暗带, 小胶质细胞过度激活,释放大量自由基、炎症因子和前炎症物质,对神经组织 造 成损伤。本部分实验采用/刺激神经元.胶质细胞共培养物,检测培 养液中炎性相关因子的表达,考察丹参川芎嗪注射液对小胶质细胞的作用。 .材料与方法 ..实验材料 丹参川芎嗪由贵州拜特公司提供,/培养基,购自公司,胰 蛋白酶、多聚赖氨酸购自;标准胎牛血清为产品, 测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;.检测试剂盒购于 公司;兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶抗体、兔抗鼠神经胶质酸性蛋白 抗体、兔抗鼠抗体、异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔 二抗由北京中杉试剂公司提供;其他为国产分析纯。 ..仪器与设备 微板光学测定仪公司,德国,透明平底孔板, 孔黑板公司,德国,细胞孵育箱三洋公司,日本,荧光显微镜 ,超净工作台北京半导体设备一厂。 ..实验方法 ...大鼠原代小胶质细胞的培养 多聚赖氨酸×储备液:溶于三蒸水成/,于二周内使用。 超净工作台内于每个. 培养瓶内.一多聚赖氨酸/,放置 备用。 新生的大鼠分离全脑,置于冰冷的/中,培养皿置于冰上。去 / 除嗅球和小脑,剥除脑膜和血管。剪碎组织,并转移组织于 基础液中。依次用移液管、、.吸头吹打分散,使成单细胞悬液。 用尼龙滤器过滤组织悬液,滤液于转离,二。 仔细弃上清,以完全培养液重悬细胞。 弃去培养瓶中的多聚赖氨酸,用无菌水沈培养瓶次,再用洗一遍,吸 头吸净,加入预热的完全培养液。江苏大学硕士学位论文 将细胞接种至培养瓶中,每细胞种于培养液,约每..个脑组织种于 一个培养瓶内。置于孵箱孵育。 ?后,换新培养液。 。 接种.,于。恒温摇床上, /,摇 摇下的小胶质细胞铺板且.用于实验。 ...大鼠原代皮层神经元.胶质细胞共培养 方法同实验一。滤液离心,细胞重悬后,计数,以׉接种至多聚赖氨酸 包被好的孔培养板。第三天换新的培养液。第天,细胞可用于实验。以神经 元、 星形胶质细胞和小胶质细胞特异抗体,进行免疫荧光染色,鉴定并计算细胞 组成 比例。 ...细胞的免疫鉴定 将大鼠皮层神经元接种于.多聚赖氨酸包被过的孔培养板,于培养第 天进行荧光染色检测,以确定培养物中细胞组成。过程如下:将培养液弃去, .,洗涤三次,%的多聚甲醛固定,.% 以.%的 ,甩去,滴加一滴非 .作用将细胞穿孔,再由孵育 免疫性动物血清采用的是普通马血清,孵育后甩去,各孔中分别滴加 兔抗鼠抗体、抗体、.抗体:,过夜,次同冲 洗后 ,滴加第二抗体一标记的羊抗兔抗体:常温孵育 ,置荧光显微镜下观察表达阳性细胞,对每种标记的细胞随机取个视野,计 算阳性细胞数。 ...细胞的刺激 细胞培养至天,给药组于处理前提前与细胞温孵,以/ 处理后检测各指标。 ...细胞培养液中含量的检测 、 皮层神经元.胶质细胞共培养物上清中的以法测定。吸取血清或培养 上清于:板中,加入等量的试剂。混合液于室温避暗孵育,测 定的吸光度。的浓度通过标准曲线计算得到。 ...细胞培养上清中的检测方法江苏大学硕士学位论文 按试剂盒说明,用包被抗体包被孔板,过夜。每孔加入洗涤液斗, 静置秒后甩尽液体,拍干。洗板次后,加入样品或不同浓度的标准品, 。孵育后,甩尽孔内液体,每孔加入洗涤液叫,静置秒后甩尽液 体,拍干。洗板次后,加入检测剂工作液内含生物素化的抗小鼠. 抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素,?孵育后,洗板次,然后加 入显色剂溶液叫孔,避光,?。若反应孔中有大鼠曰师吨,则 辣根过氧化物酶会使无色的显色剂显兰色,加终止液变黄。在 处测值, 通过标准曲线求出样品中.浓度。 ...数据处理 数据均以表示,各组间的差异比较采用单因素方差分析 ,.认为具有统计学意义。 .实验结果 ..一般形态学观察 神经元细胞培养后,大部分细胞贴壁,细胞体积增大,由圆形变为一不规 则形状,并有细小突起出现,部分细胞聚集; 后细胞聚集成团,突起增大、增 粗,形成稀疏的网络;神经元背景清楚,神经元之问形成网络;此后细胞突起 逐 渐增长,至第天,神经元网络清晰可见,底层星形细胞网络隐约可见,此时的 细 胞状态适于实验,如下图、和分别为第、和天的细胞形态 。 图.神经细胞形态学变化 . 、和分别为第、和大的细胞形态 ..细胞免疫鉴定 江苏大学硕士学位论文 、、分别为神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞的特异性标 志。实验将培养第天的大鼠皮层神经细胞进行了细胞免疫荧光化学检测并镜 下计 数拍照,三者比例为神经元.%、星形胶质细胞.%、小胶质细胞.%,如 下图所示:、和分别表现神经元细胞、星状细胞和小胶质细胞的、 。 和染色 图.免疫荧光鉴定神经细胞 .、和分别表现神经元细胞、星状细胞和小胶质细胞的、和染色 .. 含量测定 由下图可以看出,刺激培养物中小胶质细胞激活后,水平显著增加, 而丹参川芎嗪能够显著抑制的生成尸.,.,川芎嗪也有明显的 作用。 ‘ 卜, 川芎唼 丹参川芎唼 , 图.小胶质细胞内含量 . 宰料,.,正常;,., ;槲,., .. 含量测定江苏大学硕士学位论文 刺激培养物中小胶质细胞激活后,.仅水平显著增加,而丹参川芎嗪能 够显著抑制师.的生成.,.,而川芎嗪的作用更明显,优于丹 参川芎嗪。结果如下图所示。 善? : 葛 丹参川弓唼 芎唼/ 图.小胶质细胞内含量 . 幸幸幸正常对照组,.;蝌 处理组,. .讨论 小胶质细胞被广泛认为是中枢神经系统内的主要免疫效应器,参与诸如 脑病,帕金森病,阿尔兹海默病老年痴呆症,多发性硬化等人神经系统紊乱 疾病【一?。小胶质细胞对中枢神经系统损伤反应灵敏,能迅速增殖,增加或重新表 达抗原,迁移并变化成吞噬细胞样形态阿米巴样,同时爆发性分泌大量 细胞因子和细胞毒性物质。在损伤所致炎症后期,则以分泌等神经营养因子 为主,有利于神经元的营养及修复【】。小胶质细胞脑神经细胞之间相互接触的部 位一突触进行精密检查,在脑神经细胞受到损伤修复的过程中,或者是在脑的发 育阶段,小胶质细胞的这种健康检查和精密检查作用巨大。 是由存在于内皮细胞或神经元胞浆中的一氧化氮合酶 ,催化左旋精氨酸.产生的,在维持『常细胞的功能以及 介导某些病理损伤过程中都具有重要作用】。研究资料表明,在脑缺血中有 双重作用,即在脑缺血早期表现出保护作用,但持续性浓度增长可导致和 线粒体的功能损害,后期表现为神经毒性作用】。 脑缺血炎症级联反应发生后, 水平上调,在缺血后. 至最高 点。蛋白水平的增加伴随酶活性的增加和以及的衍生物过氧亚硝 酸盐产生增加【瑚】。由血管中的以及侵入到缺血脑组织中的中性粒细胞诱导 表达,在缺血脑组织中也有表达。研究表明,缺失的小鼠在后神经症江苏大学 硕士学位论文 状减轻,梗塞面积减小。而且,在中风个月后的病人脑脊液中代谢产物硝酸 盐的量仍然是增加的,表明以及的增加是伴随脑缺血的长期过程。及 其衍生物的毒性作用包括抑制合成酶,损伤,过氧亚硝酸盐的氧化损伤 等途径【加喇】。 .仅是一种具有广泛生物学功能的细胞因子,参与机体免疫应答和炎性反 应。后即可诱导产生. 。?能通过促进凝血、增加内皮细 胞通透性及诱导粘附分子或其他炎性介质表达,增力的通透性,加重缺血性 脑损伤【‘。在脑损伤后? 的过度表达对组织损伤机制主要有以下几 个方面】:?刺激细胞间粘附分子一.表达增高,破坏基底膜,促进 脑水肿形成。?损伤血管内皮细胞,从而使内皮细胞表面成为促凝状态,引发血 栓和出血。?影响血管舒缩活性物质的表达。?触发细胞凋亡。另外.对毛细 血管有直接毒性作用。可导致微小动脉痉挛,增加毛细血管通透性,进而开放, 加重外周白细胞浸润和脑水肿。还可激活多形核白细胞,增加白细胞.内皮 细胞粘附分子的表达,促使白细胞粘附于毛细血管,并逐渐渗透到脑组织陟。 另外,.也可促使星形胶质细胞中的.、.等因子的转录及表达, 起协同致炎作用。.【除具有对毛细血管直接毒性作用外,还可诱导强效血管活 性物质释放,导致血管收缩,减少局部脑血流量,并可增加毛细血管通透性, 进 一步加重的损害,促进脑缺血及水肿的发型”。 由上可知,炎症级联反应贯穿于脑缺血损伤的整个过程,炎性因子在介导脑 缺血后损伤以及脑水肿过程中起着重要作用。我们的研究结果表明,丹参川 芎嗪注射液抑制了缺血早期炎性细胞的激活,降低了缺血早期及后期、一【 等表达水平,因而对缺血后的炎症级联具有多方面的抑制作用,保护了内皮细胞 的完整性和功能,这可能是其发挥保护作用的关键机制。 丹参川芎嗪能明显抑制诱发的大量产生和炎症因子?水平的升 高,表明丹参川芎嗪对于缺血后的炎症反应具有明显的抑制作用。炎症过程贯穿 于脑缺血缺氧的整个过程,所以丹参川芎嗪对脑损伤的这种保护作用可能与抑制 炎症反应密切相关,从而保护了脑细胞的完整性,改善了动物脑缺血后的生存状 态。江苏大学硕士学位论文 第四章丹参川芎嗪注射液对致.神经细胞凋亡 的保护作用 脑缺血的极早期,血流的中断使细胞的氧和葡萄糖供应减少,从而导致能量 依赖的过程发生衰竭,能量损耗导致离子稳态失衡和神经递质释放及重摄取抑制, 如。过多的结合到离子型和受体上,引发一系列下游磷脂 酶和蛋白酶活化,降解维持细胞完整性的膜和蛋白【“引。 .细胞株来源于人类胚胎中脑,是一种分化程度较低的神经母细胞瘤, 其细胞形态和某些生理功能与正常神经元相似,因此被广泛用于神经损伤的分子 机制研究。已有证据表明,.细胞表达离子型及代谢性受体,可以被用 来研究兴奋性氨基酸所导致的神经细胞损伤过程】。丹参川芎嗪注射液治疗急 性脑梗死的临床疗效较好,能够显著改善急性脑梗死患者神经功能【】。为了研究 丹参川芎嗪注射液在细胞水平对神经细胞的保护作用,本部分实验采用作用于 ?神经细胞,模拟脑缺血早期的兴奋性神经毒性损伤,造成神经细胞凋亡 模型,并考察了丹参川芎嗪的保护作用及抗凋亡机制。 .材料和方法 ..材料 .细胞株由中国医学科学院基础所提供。磷酸川芎嗪注射液为贵州神 奇制药有限公司产品。丹参川芎嗪注射液为贵州拜特药业公司产品。/ 培养基,购自公司。胰蛋白酶、.、 、噻唑蓝均 购自。胎牛血清为产品。乳酸脱氢酶 , 钡定试剂盒购自南京建成生物工程研究所产品。一/购于 公司。细胞培养瓶和培养板为公司产品。 ..方法 ...细胞培养 .细胞在/ 培养基中培养。含有 %胎牛血清, /青霉 素,/链霉素,%谷氨酰胺的完全/培养基每~天换液一次, 。,%饱和湿度条件下培养。细胞呈对数增长时,加.%胰蛋白酶消化,江苏大学 硕士学位论文 完全培养基调整细胞浓度为 个/,接种在培养瓶、孔培养板中,加 入药物处理。 ...丹参川芎嗪对细胞的毒性作用 细胞以个/接种“至孔培养板。每孔分别加入丹参川芎嗪和川芎 嗪上/ ,各三个复孔,与细胞共同孵育。同时设置培养基对照组。 分别于孵育和检测加入,继续培养,检测值。设定正常细胞 存活率为%。实验重复三次。 ...丹参川芎嗪对.致细胞形态损伤的作用 细胞以×个/接种肛至孔培养板,每孔分别加入肛咖川芎嗪和 丹参川芎嗪预处理,各设三个复孔,然后加入. 使其终浓度为 ,继续孵育,于倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态。同时设置培养基 和.对照组,实验重复三次。 ...丹参川芎嗪对处理的.细胞存活率的影响 细胞以/接种肛至孔培养板,然后每:;入川芎嗪和丹参川芎 。?处理组和川芎嗪和丹参川芎嗪处理组分 嗪浓度为眄 ,预孵 ., 、 . 、 . 、 别更换为’缓冲液 . 、 . 、葡萄糖. 和 溶解的. ,培养基对照组更换为’缓冲液。作用 后,换新鲜培养液,继续培 养 后,吸出培养液,加入无血清的培养基配制的,终浓度为./, ?继续培养后,移走,染色的晶体在二甲亚砜中溶解,在处读取 值。以对照组细胞存活率为%,计算不同处理组细胞的存活率。 ...丹参川芎嗪对细胞释放的影响 细胞以个/接种至孔培养板,每孔分别加入/川芎嗪和 ,收集细胞上清液。 丹参川芎嗪预处理,然后加入.处理 各设三个复孔,同时设立对照组。按试剂盒说明书检测乳酸脱氢酶活性。 ...丹参川芎嗪对所致神经细胞凋亡的保护作用 .... 染色 和 细胞以个/接种“至孔培养板,每孔分别加入?/芎嗪和 ,收集细胞以沈 月.参川芎嗪.预处理,然后加入.处理 次,按个/重悬于 ,加入 山,使终浓度为‖,置于细胞 江苏大学硕士学位论文 培养箱中孵育 ;然后加入 ,使终浓度为/,置于细 胞培养箱中孵育 。洗细胞次,立刻于荧光显微镜下观察,以蓝紫外光激 发,在同一视野中观察荧光,同时照像。 . .检测凋亡相关基因、 的表达 收集处于对数生长期的细胞,以个/接种至培养瓶中,培养 后,细胞分别用川芎嗪、丹参川芎嗪和.处理,处理方式与上述相同,最后弃 ,反复吹打至澄 去培养液,收集细胞,离,