酶标板法监测棉蚜乙酰胆碱酯酶对杀虫剂的不敏感性

酶标板法监测棉蚜乙酰胆碱酯酶对杀虫剂的不敏感性 昆虫学报 第 43 卷 增刊 Vol . 43 , Suppl . AC TA EN TOMOL O GICA S IN ICA 2000 年 5 月 May , 2000 () 文章编号 : 045426296 2000增刊20032206 酶标板法监测棉蚜乙酰胆碱酯酶对 杀虫剂的不敏感性 冯国蕾 , 李梅 , 赵章武 , 何凤琴 ( )中国科学院动物研究所 , 农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室 , 北京 100080 摘要 : 用酶标板法测定了不同浓度有机磷和氨基甲酸酯杀 虫 剂 在 反 应 不 同 时 间 内 对 棉 蚜 A p his () gossy pii 乙酰胆碱酯酶 ACh E的抑制作用 。结果表明有机磷杀虫剂甲基 1605 , 辛硫磷 , 久效磷 , 氧乐果和乙酰甲胺磷对棉蚜 ACh E 均无明显的抑制作用 。当用 0101 mol/ L 灭多威与酶及底物反应 () 1 h 对北京棉蚜 敏感种群 ACh E 的抑制率可达 8214 % , 与反应 2 h 8914 %仅差 7 % 。因此以 0101 mol/ L 灭多威反应 1 h 测定棉蚜 ACh E 对它的敏感性是合理的 。通过测定北京地区寄主为鼠李和棉 花以及山东高密寄主为棉花的棉蚜种群中个体 ACh E 活性的分布和灭多威对其抑制的分布 , 表明 3 个棉蚜种群中 ACh E 个体频率的分布差异不大 , 而灭多威对三个种群个体 ACh E 的抑制率小于30 %的个体分别为 214 % 、16 %和 29 % 。抑制率大于 70 %的个体分别为 72 % 、33 %和 1 % , 与生 物测定结果一致 。因此 , 用酶标板法测定棉蚜个体 ACh E 对氨基甲酸酯的不敏感性频率可作为棉 蚜对氨基甲酸酯抗性的监测技术 , 为棉蚜化学防治提供依据 。 关键词 : 棉蚜 ; 酶标板法 ; 乙酰胆碱酯酶 ; 杀虫剂 中图分类号 : Q96519 文献标识码 : A 棉蚜 A p his gossy pi i Glover 是为害棉花 、西瓜 、黄瓜 、西葫芦 、茄子 、菊花等的主要害 虫 , 因其生命周期短 , 繁殖力强 , 严重地影响经济作物的产量 。目前使用杀虫剂防治棉蚜仍 是最主要的手段 。有关棉蚜对杀虫剂抗性的报道较多 。1980 年日本用杀虫剂防治西瓜和甜 2 1, 黄瓜和菊花上的棉蚜失败 。英国早在 1975 年在温室中开始使用抗蚜威防治葫芦科植 瓜 3 物和菊花上的棉蚜效果突出 , 使用几年后发现因棉蚜产生抗性 , 导致防治失败。美国至少 4 ,5 ( ) 有三个州 Mississippi , Califo r nia 和 Alabama报道了棉蚜对有机磷杀虫剂的抗性。我国 6 早在 1964 年就报道了棉田棉蚜对 1059 产生抗性, 随后有关棉蚜对杀虫剂的抗性报道很 7 ,9多 。 棉蚜对有机 磷 和 氨 基 甲 酸 酯 类 杀 虫 剂 的 抗 性 机 制 主 要 涉 及 非 特 异 性 酯 酶 和 ACh E 变 10 ,12。当然多功能氧化酶也是导致棉蚜对杀虫剂抗性和交互抗性的原因 。由于棉蚜匀浆构 10 后体内产生内源抑制剂以至于体外无法进行测定。为了提高害虫抗性水平 , 目前已成 功地使用快速 、简易和准确的滤纸酯酶方法测定个体棉蚜酯酶的活性 , 以监测田间蚜虫种群 13 ,14 中抗性棉蚜 、敏感棉蚜和杂合子棉蚜酯酶基因表现型的频率分布。但这方法并不适合于 ( )基金项目 : 国家 “九五”科技攻关项目和国家重点自然科学基金项目 批准号 : 39630210 收稿日期 : 1999207219 ; 修订日期 : 2000202224 〃32〃 氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性监测 。 本文用酶标板法测定棉蚜 ACh E 和氨基甲酸酯对 ACh E 的抑制作用 , 试图以快速简易准 确的方法监测田间种群中棉蚜对氨基甲酸酯类杀虫剂抗性 、敏感和杂合等个体表现型的频率 , 以利于抗性预测 。为指导轮换使用杀虫剂和延缓棉蚜抗性发展 , 提高综合治理水平提供依据 。 1 材料与方法 111 棉蚜 ( 采自中国科学院动物研究所院内木槿上的无翅成蚜 , 接种到棉苗上饲养后的棉蚜 京蚜 , ) ( ) ( 敏感种群; 北京地区鼠李上采集的棉蚜 京鼠蚜; 山东高密棉田内采集的棉蚜 高棉蚜 , ) 抗性种群。 112 试剂与仪器 () () 碘化硫代乙酰胆碱 A TCh I和二硫双硝基苯甲酸 D TNB, S I GMA 公司产品 ; Trito nX2100 , 上海化学试剂厂 ; 其他试剂均为纯 。 仪器 : 酶标仪 , B IO2RAD MOD EL 450 。 113 生物测定 10 () 参照孙耘芹等 1987的方法。测试药剂用丙酮配制 , 稀释 5,6 个浓度 , 用定量毛 细管点滴器将药液点滴在蚜虫背部 。每个浓度重复 3 次 , 另用丙酮作空白对照 。处理后的蚜 虫在正常条件下饲养 , 5 h 检查死虫数 , 计算 L D。 50 114 棉蚜乙酰胆碱酯酶 ( AChE) 活性的测定 μ( ) 取 50 头无翅成蚜以每头 60 L 磷酸缓冲液 含 011 % Trito n X2100 , p H714匀浆 , 在3 500 r/ min离心 10 min , 取上清液作为酶源于 4?C 冰浴中 。在 96 孔微量滴度酶标板中每个孔 μμμ先加 50L 磷酸缓冲液 , 在横列 A 的 1,12 列中加 3L 无水乙醇 , 横列 B, G 分别加 3L 不 () μ同浓度杀虫剂 无水乙醇配制, 每 3 个孔为重复 , 每孔加 20 L 棉蚜匀浆液 , 室温 25?C 保 μμ() () 持 10 min , 加 200 L 的 A TCh I 终浓度为 015 mmol/ L 和 D TNB 终浓度为 5 mol/ L 的 混合液 。横列 H 项除不加酶 , 其他相同作为空白对照以进行校正 。在酶标仪上 414 nm 间隔 时间为 0 , 015 h , 1 h , 和 2 h 测 OD 值 , 计算 ACh E 活力 。 115 棉蚜种群中个体 AChE 和杀虫剂对棉蚜 AChE 抑制率分布的测定 μ( 每个棉蚜种群中取 90 头棉蚜 , 分别以每头棉蚜加 60L 磷酸缓冲液 含 011 % Trito n X2 12 11)100 , p H714 ( ) (, 按 Moo res 等方法进行测定 , 抑制率 %对照酶活 - 抑制后剩匀浆 = ) 余酶活对照酶 活 ×100 。计 算 每 头 棉 蚜 ACh E 活 力 和 灭 多 威 对 ACh E 的 抑 制 率 , 按 李 梅/ 13方法画出频率分布图 。等 2 结果与分析 211 生物测定 灭多威对北京和山东高密棉蚜的毒性见表 1 。 34 昆虫学 报43 卷 (μ)表 1 灭多威对棉蚜的毒性 : g/ 蚜L D 50 (μ)Ta ble 1 The toxicity of methomyl to cotton aphid L D: g/ ap hid50 L DL D b 棉蚜种群 Pop ulatio n 5095抗性指数 Resistance index 100084 10082 00北京种群 Beijing 1657 ?01246 1 1( ( ))0100042,0100129 0100465,010254 10076 1038 105 009高密种群 Gao mi 1318 ?01335 2( ( ))0100335,010117 010211,01217 212 不同杀虫剂对棉蚜 AChE 的抑制作用 用北京棉蚜种群比较甲基 1605 、辛硫磷 、久效磷 、氧乐果 、乙酰甲胺磷 、残杀威和灭多 () 威对棉蚜 ACh E 的抑制作用 图 1。结果表明 , 不同浓度甲基 1605 、辛硫磷和乙酰甲胺磷对 棉蚜 ACh E 的抑制作用不明显 , 011 mol/ L 时这 3 种杀虫剂对 ACh E 还有激活作用 。不同浓度 的久效磷和氧乐果对棉蚜的 ACh E 有一定的抑制作用 , 其抑制率随浓度的增加稍有增加 , 在 最高 浓 度 011 mol/ L 时 , 其 抑 制 率 仅 分 别 达 到 2419 %和 2118 % 。残 杀 威 和 灭 多 威 对 棉 蚜 ACh E 的抑制作用在最高浓度 011 mol/ L 时 , 其抑制率可分别达到 6219 %和 5912 % , 但不同 浓度之间差异不明显 , 即使浓度提高 , 抑制率变化不大 。由此表明用酶标板法测定棉蚜个体 ACh E 对杀虫剂的不敏感性 , 只适合于氨基甲酸酯类杀虫剂如灭多威和残杀威等 , 而不适合 于大部分有机磷杀虫剂 。因此 , 酶标板法测试 ACh E 不敏感性可以作为氨基甲酸酯类杀虫剂 抗性的生化监测方法 。 213 不同反应时间对不同浓度灭多威对棉 蚜 AChE 抑制作用的影响 用北京 棉 蚜 种 群 比 较 在 不 同 反 应 时 间 不同浓 度 的 灭 多 威 对 棉 蚜 ACh E 的 抑 制 作 () 用 图 2。结果表明反应 015 h 时 , 01001 , 0101 和 0105 mol/ L 的 灭 多 威 对 棉 蚜 ACh E 的抑 制 率 分 别 为 60 % , 7517 % 和 7914 % ; 反 应 1 h 时 分 别 为 6817 % , 8214 % 和 图 1 不同杀虫剂对棉蚜 ACh E 的抑制作用 Fig. 1 Inhibitio n of different insecticides to 8517 % ; 反应 2 h 时分别为 7318 % , 8914 % acet ylcholinesterase in cot to n ap hids ( ) 和 9213 % ; 低 浓 度 灭 多 威 01001 mol/ L 反应 2 h 时 其 抑 制 率 仅 为 7318 % ; 0101 mol/ L 灭多威反应 1 h 和 2 h 时对 ACh E 的抑制率分别可达 8214 %和 8914 % , 二者仅差 7 % 。 当浓度提高到 0105 mol/ L 时 , 抑制率分别为 8517 %和 9213 % , 二者相差 3 % 。因此 , 认为采 用 0101 mol/ L 的灭多威反应时间 1 h 作为酶标板法测试棉蚜 ACh E 不敏感个体表现型比较合 适 。 214 不同棉蚜种群个体 AChE 活性的频率分布 ( ) 从北京和山东高密和鼠李上棉蚜种群中棉蚜 ACh E 活性的频率分布 图 3可以看到在OD 值 < 0130 的京鼠蚜有 86 % , 京蚜有 90 % , 高棉蚜有 87 %的个体 ; OD 值 > 0150 的 , 京蚜 和京鼠蚜均为 0 , 高棉蚜为 13 % 。因此从京鼠蚜 , 京蚜和高棉蚜的种群间个体 ACh E 的频率 分布推测差异不大 , 高棉蚜对灭多威的抗性可能与 ACh E 的变构有关 。 不同种群棉蚜 ACh E 活性的频率分布图 3 图 2 不同浓度灭多威在不同时间对 Fig. 3 Individual f requency of 棉蚜 ACh E 的抑制作用acet ylcholinesterase activity in Fig. 2 Inhibition of insecticides on acetylcholinesterase t hree cot to n ap hid pop ulatio ns in cot to n ap hids wit h different reactio n times 215 灭多威对不同棉蚜种群个体 AChE 抑制率分布 用 0101 mol/ L 灭 多 威 测 试 北 京 鼠 李 , 棉 苗和山东高密棉田的棉蚜种群个体 ACh E 的抑 ( ) 制率 分 布 图 4 。结 果 表 明 , 0101 mol/ L 的 灭多威对北京鼠李 、棉苗和山东高密棉田的棉 蚜种群中个体 ACh E 抑制率小于 30 %的个体作 为抗 性 个 体 , 表 现 型 分 别 为 214 % , 16 % 和 灭多威对不同棉蚜种群个体图 4 29 % ; 抑制率大于 70 %的个体作为敏感个体的 ACh E 抑制率的分布表现型分别为 7117 % , 33 %和 1 % 。棉蚜种群 Fig. 4 Frequency of inhibitio n rate by 个体 棉 蚜 ACh E 对 灭 多 威 的 不 敏 感 型 , 中 间 met ho myl of individual acetylcholinesterase 型 , 敏感型 的 比 例 : 京 鼠 蚜 为 1 ?11 ?3 ; 京 蚜 activit y in t hree cot to n ap hid pop ulatio ns 为 : 1?3?2 ; 高棉蚜为 33?80?1 。这清楚指出高 棉蚜种群中个体 ACh E 对灭多威的不敏感性个体比京蚜和京鼠蚜要高 。证明了灭多威抗性与 ACh E 不敏感性有一定关系 。因此使用酶标板法测定个体棉蚜 ACh E 对氨基甲酸酯不敏感性 的方法可以作为测定棉蚜对氨基甲酸酯抗性的监测技术 。 讨论3 ( ) 棉蚜对氨基甲酸酯杀虫剂的主要抗性机制是由于棉蚜体内乙酰胆碱酯酶 ACh E 变构 , 杀虫剂对其抑制不敏感而产生抗性 。1995 年报道了抗蚜威对温室中寄主黄瓜和菊花上棉蚜抗 ( ) 性的生化机制 , 抗蚜威对菊花上抗性棉蚜 ACh E 的抑制中浓度 I比敏感种群高出 900 倍 , 50 对底物的亲和性降低了 300 倍 , 证明了棉蚜对抗蚜威抗性的主要原因是由于 ACh E 的变构引 12 起的 。Moo res 等认为在棉蚜中至少有 2 个 ACh E 等位基因的变异 。本文用酶标板法测定灭 多威对北京地区鼠李 , 棉苗和山东高密棉田的棉蚜种群中个体 ACh E 活性频率分布 , 3 个种 36 昆虫学报43 卷 群除鼠李棉蚜种群内敏感个体比例较大外 , 北京棉苗和高密棉田的棉蚜种群间的差异不大 , 表明灭多威抗性与棉蚜 ACh E 活力关系不大 。而从测试灭多威对棉蚜个体 ACh E 的抑制作用 , 可看出北京地区寄生在鼠李上棉蚜种群对灭多威的不敏感性频率比较低 , 以抑制率小于 30 % 的个体作为抗性表现型 , 鼠李种群仅为 2 %个体 , 北京棉苗和山东高密棉田的棉蚜种群分别 为 16 %和 29 %的个体 , 抗性个体数明显有了增加 。以抑制率大于 70 %的个体作为敏感表现 型 , 鼠李上棉蚜种群中有 71 %个体 , 北京棉苗和高密的棉蚜种群分别为 33 %和 1 %个体 。高 密种群中敏感个体数明显有了降低 , 这与生物测定结果基本相符 。说明棉蚜个体 ACh E 的不 敏感性是氨基甲酸酯杀虫剂抗性的主要原因之一 。 本文用微量 酶 标 板 法 测 定 有 机 磷 杀 虫 剂 甲 基 1605 , 辛 硫 磷 和 乙 酰 甲 胺 磷 对 棉 蚜 个 体 ACh E 均无抑制作用 。用 015 %的氧乐果和久效磷抑制率仅达 20 %左右 , 各浓度之间与 ACh E 15 - 4 不敏感的相关性不明显 。高希武等用 119 ×10 mol/ L 浓度的氧乐果对 4 个地区桃蚜种群 的 ACh E 的抑制作用时 , 在反应 115 min 时平均抑制率达 3213 %,5519 % , 并提出了与抗蚜 威 , 马拉硫磷 , 氧乐果的抗性有一定相关性 , 由此说明棉蚜与桃蚜的抗性机制之间存在差异 , 尚待进一步研究 。 参 考 文 献 ( Ref erences) ( ) 1 ] Tanigucki T. 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The result s showed t hat t here were no inhibitio n of organop hosp hate insecticides , such as met hyl parat hio n , mo nocrotop hos , o met hoate and acep hate to t he ACh E of cot to n ap hid. By measuring t he ACh E activit y of individual cot to n ap hids o n cascara and o n cot to n seedling in Beijing and Gao mi , Shando ng Province , alo ng wit h t he inhibitory f requency of met ho myl to it , it was found t hat t he dist ributive f requency amo ng individual ACh E activities was similar amo ng t he t hree pop ulatio ns of cot to n ap hid tested. The individuals wit h inhibitory rate of met ho myl to individual ACh E be2 low 30 % in t he t hree different pop ulatio ns were amounted to 214 % , 16 % , 29 % , respectively. The in2 dividuals wit h inhibitory rate over 70 % , accounted for 72 % , 33 % and 1 % of t he t hree pop ulatio ns re2 spectively. The difference amo ng t hese t hree pop ulatio ns was noticeable , and t his result was in accord wit h t he outco me of biological measurement . Co nsequently t he met hod of microplate titer assay would be a bet2 ter forecast skill for deter minating insensitivit y of ACh E to carbamate insecticides in cot to n ap hid. It might be helpf ul for releasing pest resistance . Key words : cot to n ap hid ; microplate assay ; acet ylcholinesterase ; insecticide