血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定

实验八 血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定 为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。 分离纯化蛋白质的是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。 本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。其原理及操作如下： ㈠硫酸铵盐析 1. 试剂 饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。 磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。 磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。 2.操作  ①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。静置20min，以3000r/min离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。③倾去上清液，将沉淀溶于5ml磷酸缓冲液（0.01mol/L pH7.0），再加饱和硫酸铵3.2ml，此时溶液硫酸铵的饱和度约为33%，静置20min，以3000r/min离心15min，除去上清液，沉淀即为γ-球蛋白。 ㈡凝胶过滤脱盐 1.试剂  ①Sephadex G-25：用前以蒸馏水浸泡5h或在沸水浴中溶胀2h；②磷酸盐缓冲液（pH6.7，0.0175mol/L）：见前；③磷酸盐缓冲液（pH7.0，0.01mil/L）见前；④奈氏试剂；⑤20%磺酰水杨酸。 2.操作  ①取层析柱一根（1.5cm×20cm），垂直于固定架上，夹住流出口。加10ml磷酸缓冲液（0.0175mol/L, pH6.7）于柱中。将已溶胀好的Sephadex G-25倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液并搅拌成悬浮液，慢慢装入柱中，打开流出口，继续加入Sephadex G-25使自然沉降至15cm高，关闭出口。②打开出口，使柱中多余的磷酸缓冲液流出凝胶柱床面（切勿低于柱床面）。用吸管吸取盐析所得的蛋白质溶液2ml，沿管壁加入凝胶面上，打开流出口，让样品进入凝胶柱，再用滴管小心加入磷酸盐缓冲液至离凝胶面2～3cm高，编号，按顺序放在试管架上。③在收集的同时，检查蛋白质是否流出。于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按编号顺序），再分别加入1滴20%磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即示蛋白质已流出凝胶柱，如此直检查到蛋白质全流出为止。与此同时，再从含蛋白质的管中取出1滴于白色比色板中，加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去，合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。 ㈢DEAE-纤维素纯化免疫球蛋白G 1.试剂  ①DEAE-纤维素：DE-11、DE-22、DE-32、DE-52均可；②0.5mol/L HCl溶液；③0.5mol/L NaOH溶液；④pH6.7，0.0175mol/L磷酸盐缓冲液。 2.操作 （1）DEAE-纤维素的活化处理  称取20gDEAE-纤维素，浸泡过夜。次日倾去水，加0.5mol/L NaOH溶液100ml，轻轻搅拌。静置，沉降后倒出NaOH溶液，用蒸馏水洗至pH为8左右，倒出上清液。加0.5mol/L HCl溶液100ml，轻轻搅拌，静置10min，小心倒出HCl溶液，用蒸馏水洗至pH为6，待用。 （2）装柱  取层析柱一根（1.5cm×20cm），按照安装Sephadex G-25柱的方法装柱。待纤维素自然沉降后接通洗脱瓶让磷酸缓冲液（pH6.7，0.0175mol/L）流经柱床，待流出液的pH为6.7为止（充分平衡）。 （3）加样与洗脱  关闭洗脱瓶，让柱内缓冲液流出至纤维素柱面，关闭流出口，用吸管将已脱盐的γ-球蛋白沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床（勿使空气进入）。立即用滴管向柱内沿管壁加入磷酸缓冲液至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集，出现白色沉淀者，即含有纯的IgG，继续收集，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，置冰箱保存。 ㈣免疫球蛋白G纯度的鉴定 免疫球蛋白G纯度的鉴定办法很多，最常用的是电泳。免疫电泳、凝胶电泳等都可。 注： [1]如在柱层析时连接核酸蛋白检验仪，则免去用磺酰水杨酸检测的步骤。 [2]50%饱和的硫酸铵使血清中球蛋白沉淀，33%饱和的硫酸铵使γ-球蛋白沉淀。 [3]在粗提的γ-球蛋白溶液中，当pH为6.7时，除IgG外，其他杂质蛋白均带不同数量的负电荷。因此，当粗提的γ-球蛋白在pH为6.7的溶液中经DEAE-纤维素柱时，IgG不发生交换而直接流出，其余蛋白质则发生交换而吸附，从而能得到较纯的IgG。