病理切片的制作

病理切片的制作 病理切片的种类 病理切片的种类 1石蜡切片 2冰冻切片 3震动切片 4火棉胶切片 5塑料切片 病理切片的制作过程 病理切片的制作过程 ? 冰冻切片 石蜡切片 火棉胶切片 ? , ? , ? ——————————?取材?———————— ? ? ? 固定 ? ? ? 冰冻?———————— 冲水 ? ? ? ? ? 脱水——————————— ? ? ? ? ? ? 透明 乙醚酒精 ? ? ? ? ? ? 浸蜡 胶液渗透 ? ? ? ? ? ? 石蜡包埋 火棉胶包埋 ? ? ? ? ? 冰冻切片 切片 切片 ? ? ? ? ? 染色 染色 染色 ? ? ? ? ? 封固 封固 封固 取材 取材 1取材刀具必须锋利。 2切取标本不应该挤压和揉擦，不应使用有钩镊子或血管钳等手术器械镊 取标本，应选择病变或可疑病变的组织。必要时选取病变与正常组织交 界处。 3切取标本的原则是求准而不是求量多以不超过15x15mm为佳，厚度以 3—5mm为度， 4取材要及时，组织块必须争取时间及时固定。组织的固定以愈新鲜愈好。 5取材时对大体标本(肉眼标本)绘制图象，进行仔细描述。包括形状、 大小，硬度，颜色，病灶(或可疑病变)部位对所取的组织应定位编号。 6切取各组织块时，切勿挤压损伤，对典型或具有教学和科研价值的肉眼 标本， 7不能因取材而对标本造成人为的“病变”。肠粘膜组织上沾有少量粪便， 也不应以手拭去或以水洗去。 8固定液的量要充足，应为固定组织的10倍。 9组织采取应在正常与病灶交界之处。组织形状最好为方形或长方形状， 这样有利于制片。切不可以形状定位，组织厚薄要均匀。 10各组织块应包括各脏器的重要结构，如肾脏组织包括皮质部分和髓质部 分。在有浆膜的脏器(如胃等)组织块中，要至少有一块带有浆膜。 11组织内的钙化病灶或骨质，应在充分固定之后进行脱钙，组织内的非病 理性异物应予剔除。 固定的目的 固定的目的 ? 能防止细菌的腐蚀和组织的自溶 ? 保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞 内或组织液，糖元等，使细胞或组织基本 上保持与生活时的物质一样。 ? 使组织硬化，便于切块。 ? 对某些具有传染性的标本，能防止疾病的 扩散 ? 保存好大体标本。 ? 可增强染色的作用。 固定剂的种类 固定剂的种类 ? ?类:醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛， 丙烯醛，已二醛，丙二醛等。 ? ?类:氧化剂类，四氧化锇(奥酸)，高 锰酸钾，重铬酸钾等。 ? ?类:蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。 ? ?类:其他，氯化汞，苦味酸等。 ? ?类:蛋白沉淀，丙酮等。 固定剂的选择 固定剂的选择 1、渗透性强 2、组织在固定液的作用下，不应发生显著的 收缩和膨胀现象。 3、固定剂应该有利组织切片和染色，(1) 固定剂对固定后的组织应有利于染色剂的 染色。(2)固定剂能将组织或细胞中某些必 须观察的成分予充分固定而保存下来，以 便染色。 4、固定液应该同时也是一种较好的保存液。 固定的方法 固定的方法 ? 浸泡固定法 ? 灌流固定法 ? 微波固定法 ? 蒸汽熏蒸固定法 固定注意事项 固定注意事项 1.组织块不宜过大，一般以厚度5mm，长宽 不超过15×15mm。 2.固定液的量一般以组织块大小的20倍为宜， 3.必须选择渗透力强，又不是组织过度收缩 或膨胀的试剂作为固定液。 4.固定时间的长短因固定剂的不同要求而定， 也与气温、组织块的大小有关。 5.特殊要求的组织，常需特殊的固定液， 冲洗时应注意以下事项 冲洗时应注意以下事项 ? 水溶性的固定剂:需用流水冲洗。 ? 酒精溶剂的固定剂:应用同浓度的酒精浸洗。 ? 含苦味酸的固定剂:(苦味酸与甲醛混合液除 外)，须用70,酒精浸洗，以免水洗后固定作用 消失。 ? 含有升汞固定剂:组织经固定后应在冲洗剂,水 或酒精中加碘以洗去组织内汞的沉淀。 ? 含有铬酸的固定剂:组织在冲洗时最好置于暗处， 以免产生沉淀或使组织硬化而影响制片。 石蜡切片的制作 石蜡切片的制作 ? 脱 水 ? 透 明 ? 浸 蜡 ? 包 埋 ? 目的 ? 常用的脱水剂(酒精,丙酮,正丁醇,二氧乙 环) ? 脱水的基本原则:从低浓度酒精开始逐渐 升到高浓度酒精，以保持组织中的水分完 全脱净。 ? 目的 ? 透明剂:常用的有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，香 柏油等 ? 透明时间的长短因组织的大小而异。例如脑组织 和有血块的组织，就应该缩短在二甲苯内留置时 间，而一些肌肉组织和胃肠组织则应该稍延长在 二甲苯内留置时间，最好先投入酒精和透明剂等 量混合液半小时，再入透明剂，并更换一次透明 剂，待组织完全透明后进行浸蜡，一般需要半小 时至2,,3小时。 ? 概念54,60.C ? 较厚的组织需要较长时间才能使蜡浸入中 心，而且厚的组织常带入的透明剂比较多， 故需要多次浸蜡才能将透明剂除去。即使 少量透明剂也会沾污石蜡而产生结晶，致 使切片时切片易碎裂。为了尽可能排除透 明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。以熔 点较低的软石蜡作为第一步，然后再换为 熔点较高的石蜡作为第二步，第三步。 包埋 包埋 ? 将脱水、透明、浸蜡以后的组织块用石蜡 包埋，制成适当硬度的石蜡块，以便切成 薄片。 包埋 包埋 ? 1新蜡应在温箱内熔化一次，使其中所含的挥发性 物质蒸发，以免包埋冷凝时发生“蜡花”，即蜡 块中呈不均匀现象，而不能切片; ? 2石蜡凝结过程中，将包埋容器放入水中时动作要 慢; ? 3制作切片时，夏天用硬蜡包埋，冬天可用软蜡包 埋;软的组织用软蜡，硬的组织用硬蜡。 ? 4一般组织常用的包埋蜡熔点52,60?的石蜡， 如果需要切4um以下的切片，则用56,60?的石 蜡，较厚的切片(如胚胎连续切片)则用熔点52 ,54?的石蜡。 包埋 包埋注意事项 注意事项22 ? 5.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以 选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好 用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的 石蜡包埋。其熔点一般要求再60。C左右。 ? 6.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度 过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲， 收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的 温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可 造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。 ? 7.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也 恰好用完为宜。 ? 8.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平， 在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。 ? 9.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组 织块直立拉平，不要卷曲。 ? 10.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意 方向的一致，以利切片。 石蜡包埋程序 石蜡包埋程序 1 组织取材2毫米厚度，固定于福尔马林数小 时后再换以新鲜福尔马林固定数小时。 2 组织流水冲洗6,12小时。 3 70,酒精2,4小时。 4 80,酒精2,4小时。 5 95,酒精(?)2,4小时。 6 95,酒精(?)2,4小时。 7 100,酒精(?)2,4小时。 8 100,酒精(?)2小时。 9 二甲苯(?)0.5,1小时。 10 二甲苯(?)0.5小时。 11 浸蜡(?)2小时。 12 浸蜡(?)2小时。 13 组织包埋。 ? 切片前的准备 ? 粘片 切片前的处理 切片前的处理 ? 准备用品 ? 调整切片机 ? 修切石蜡块 粘片 粘片 ? 粘片的目的是将石蜡切片粘附在载玻片上， 借水的张力和一定的温度，使略皱的蜡片 伸展平整，以便染色、镜检。 石蜡切片常遇到的困难及矫正 石蜡切片常遇到的困难及矫正 1 切片不能形成蜡带，因室温过低。石蜡过硬和石蜡粘度不足。蜡边 过小或不平。可在石蜡内加一定比例的蜂蜡，使石蜡的粘度增 加。 2 蜡带弯曲，蜡带的两侧大小不等，刀不锐利。 3 蜡片成卷:刀不锋利或不清洁，刀的倾斜过大或石蜡过硬。 4 切片出现褶皱:石蜡太软或浸蜡不够，刀钝或倾斜度过小。 5 切片薄厚不等:组织在脱水及浸蜡过程中处理不当，刀钝或切片机 不佳或刀和组织块固定牢固。 6 组织块中的结缔组织呈不透明的白色状态而破碎:脱水不彻底， 透明不足而影响石蜡浸透。 7 切片呈碎卷状:脱水，透明及浸蜡时间过久或蜡温过高。 8 切片出现纵纹:刀刃有小缺口，石蜡不清洁，组织内有钙盐沉积。 9 切片出现皱纹:组织固定不牢，刀与刀台固定不紧。 10 蜡块底边成白色:刀的倾斜不足而碰撞的结果。 11 切片粘刀:刀刃不解，可用软布或手指沾二甲苯以反刀口方向向 刀口抹掉，稍加大刀倾斜度，刀钝。 12 蜡块向上运行时带走切片:刀钝，刀刃背面沾积有蜡，室温高或 用冰块冷却蜡块，也可能是蜡带的静电反应(室内过于干燥)。 冰冻切片的制作 冰冻切片的制作 ? (一)冷冻切片的种类 ? (二)冷冻切片的目的 ? (三)冷冻切片的制作方法 冷冻切片的种类 冷冻切片的种类 ? 冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻 切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环 制冷冰冻切片法，半导体致冷的冰冻切片 等 冷冻切片的目的 冷冻切片的目的 ? (1)在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术 不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。 ? (2)了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利 于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗。 ? (3)对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足 够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。 ? (4)在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 ? (5)显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及 肉瘤，某些科研组织等。 ? (6)某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 ? (7)神经病理学技术中的某些染色法如:Eager氏法，Marchi氏法， Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 ? (8)对某些物质所进行的免疫荧光的研究。 冷冻切片的制作方法 冷冻切片的制作方法 ? ?取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻 费时，大者难以切完整，最好为15×15mm。 ? ?取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速 放于冷冻台上，冰冻。?将冷冻好的组织块，夹紧于切片 机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ? ?调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞 密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5, 10um间。 ? ?调好防卷板。 ? ?应视不同的组织选择不同的冷冻度。 冰冻切片时的注意事项 冰冻切片时的注意事项 ? ?防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残 余和用柔软的纸张擦。 ? ?多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻 台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 ? ?放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”， 切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 ? ?组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前， 更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二 是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰 冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的 水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成 了冰晶。 ? ?当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在 室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以 此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 ? ?用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。 冰冻切片与空洞 冰冻切片与空洞 ? 1成因 ? 2 消除办法 成因 成因 ? 切片上行成空洞是由于在冰冻组时织形成 冰晶引起的，当冰晶溶解后在切片上留下 空洞 消除办法 消除办法 ? 1在冰冻前用20-30%的蔗糖浸泡组织; ? 2速冻法1)液氮2)干冰-丙酮 。