重铬酸钾法

重铬酸钾法 一、微量凯氏(kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下: nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1) 2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2) (nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可4 用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6(25即得。 二、双缩脲法(biuret法) 三、folin—酚试剂法(lowry法) 五、考马斯亮兰法(bradford法) (一)实验原理 双缩脲法(biuret法)和folin—酚试剂法(lowry法)的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由bradford建立的考马斯亮兰法(bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。 bradford法的突出优点是: (1)灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质,染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰lowry法的k+、na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。 此法的缺点是: (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford 在制作曲线时通常选用 g法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有:去污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠(sds)和0.1n的naoh。(如同0.1n的酸干扰lowary法一样)。 (3)标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 (二)试剂与器材 1. 试剂: (1)标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 (2)考马斯亮兰g—250染料试剂:称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材: (1)可见光分光光度计 2)旋涡混合器 ( (3)试管16支 (三)操作方法 1. 标准方法 (1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 (2)加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1mlh2o加5.0mlg—250试剂。 注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml) 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 g,250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量(mg) 光吸收值 (a595) (3)用标准蛋白质量(mg)为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。 2. 微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时(10,100mg/ml),可将取样量(包括补加的水)加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml h2o, 考马斯亮蓝g,250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。 六、紫外吸收法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的(nh4)2so4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因ph的改变而有变化，因此要注意溶液的ph值，测定样品时的ph要与测定标准曲线的ph相一致。 下面介绍四种紫外吸收法: 1. 280nm的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂(水或缓冲液)作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值a280。蛋白质浓度可控制在0.1,1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，a280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值(a1,1cm)有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与(a1,1cm)值(即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值)的关系。文献值a1,1cm,?称为百分吸收系数或比吸收系数。 蛋白质浓度 = (a280′10 )/ a1,1cm,280nm (mg/ml) (q 1%浓度?10mg/ml) 例:牛血清清蛋白 : a1,1cm=6.3 (280nm) 溶菌酶 : a1,1cm=22.8 (280nm) 若查不到待测蛋白质的a1,1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(bsa)。 标准曲线的测定:取6支试管，按下表编号并加入试剂: 管号 1 2 3 4 5 6 bsa(1.0mg/ml) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 a280 用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度a280，以a280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量(mg)为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的a280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管a280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的a1,1cm,280nm 2. 280nm和260nm的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克)，但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常: 纯蛋白质的光吸收比值:a280/a260 ? 1.8 纯核酸的光吸收比值: a280/a260 ? 0.5 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其a280和a260，由此吸收差值，用下面的经验，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×a280,0.74×a260 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。 3. 215nm与225nm的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 用已知浓度的标准蛋白质，配制成20,100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差: 吸收差d= a215 ,a225 以吸收差d为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。 本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，nacl、(nh4)2so4以及0.1m磷酸、硼酸和tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1n naoh, 0.1m乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005m以下才无显著影响。 4. 肽键测定法 蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50,500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值a238，以a238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。 进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。 本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。 2.2 土壤有机质主要测定方法 2.2.1重铬酸钾容量法——外加热法 2.2.1.1方法原理 在外加热的条件下(油浴的温度为180，沸腾5分钟)，用一定浓度的重铬酸钾——硫酸溶液氧化土壤有机质(碳)，剩余的重铬酸钾用硫酸亚铁来滴定，从所消耗的重铬酸钾量，计算有机碳的含量。本方法测得的结果，与干烧法对比，只能氧化90%的有机碳，因此将得的有机碳乘以校正系数，以计算有机碳量。 2.2.1.2主要仪器 沙浴或油浴消化装置、可调温电炉、秒表、自动控温调节器。 2.2.1.3试剂 重铬酸钾(K2Cr2O7，分析纯)，浓硫酸(H2SO4，分析纯)，硫酸亚铁(Fe SO4?7H2O，分析纯)，邻啡罗啉指示剂，邻啡罗啉(分析纯)。 2.2.1.4操作步骤 称取通过0.25mm(60目)筛孔的风干土样0.1,1g(精确到0.0001g)，放入一干燥的250ml中，用移液管准确加入0.8000mol?L-1(1/6K2Cr2O7)标准溶液5mL，用注射器加入浓H2SO45mL充分摇匀，管口盖上弯颈小漏斗，以冷凝蒸出的蒸汽。煮沸5min，取出试管(用油浴法，稍冷，擦净试管外部油液)。 冷却后，将试管内容物倾入250mL三角瓶中，用水洗净试管内部及小漏斗，使三角瓶内溶液总体积为60,70mL，保持混合液中(1/2 H2SO4)浓度为2,3 mol?L-1，加邻啡罗啉指示剂指示剂2,3滴，用标准的0.2 mol?L-1硫酸亚铁滴定，滴定过程中不断摇动内容物，溶液的变色过程中由橙黄?蓝绿?砖红色即为终点。记下Fe SO4滴定毫升数(V)。 每一批样品测定的同时，进行2,3个空白试验，即取0.500g粉状二氧化硅代替土样，其他步骤与试样测定相同。记下FeSO4滴定毫升数(V0)，取其平均值。 2.2.1.5结果计算 土壤有机碳(g?kg-1)= 式中:c——0.8000 mol?L-1 (1/6K2Cr2O7)标准溶液的浓度; 5——重铬酸钾标准溶液加入的体积(mL); V0——空白滴定用去FeSO4体积(mL); V——样品滴定用去FeSO4体积(mL); 3.0——1/4碳原子的摩尔质量(g?mol-1); 10-3——将mL换算为L; 1.1——氧化校正系数; m——风干土样质量(g); 2.2.2重铬酸钾容量法——稀释热法 2.2.2.1方法原理 基本原理、主要步骤与重铬酸钾容量法(外加热法)相同。稀释热法(水合热法)是利用浓硫酸和重铬酸钾迅速混合时所产生的热来氧化有机质，以代替外加热法中的油浴加热，操作更加方便。由于产生的热，温度较低，对有机质氧化程度较低，只有77%。 2.2.2.2试剂 试剂同2.2.1.3 2.2.2.3操作步骤 准确称取0.5000g土壤样品于500mL的三角瓶中，然后准确加入1mol?L-1(1/6K2Cr2O7) 溶液的10mL于土壤样品中，转动瓶子使之混合均匀，然后加浓HSO20mL，将三角瓶缓缓转动1min，促使混合以保证试剂与土24 壤充分作用，并在石棉板上放置约30min，加水稀释至250mL，加3,4滴邻啡 罗啉指示剂，用0.5 mol?L-1FeSO4标准溶液滴定至近终点时溶液颜色由绿变成暗绿色，逐渐加入FeSO4直至生成砖红色为止。 用同样的方法做空白测定(即不加土样)。 如果K2Cr2O7被还原的量超过75%，则须用更少的土壤重做。 2.2.2.4结果计算 土壤有机碳(g?kg-1)= 土壤有机质(g?kg-1)=土壤有机碳(g?kg-1)×1.724 式中:1.33——为氧化校正系数; c——为0.5 mol?L-1FeSO4标准溶液的浓度; 其他各代号和数字的意义同2.2.1.5。 2.2.3 ASI土壤有机质的测定 2.2.3.1方法原理 土壤有机质有90,以上是腐殖质组成的，土壤的腐殖质中的胡敏酸和富啡酸均溶于碱，且呈棕褐色，当用碱提取土壤中的腐殖质时，在一定的浓度范围内，腐殖质的量与其颜色呈正比，即提取液的颜色越深，土壤有机质的含量越高。在一定的波长条件下，进行比色，可测定土壤有机质的含量。 2.2.3.2试剂 Na0H、EDTA二钠、甲醇、Superflocl27。 2.2.3.3操作步骤取1 mL土样，放入样品杯中，用浸提剂加液器加入25 mL浸提剂，在搅拌器上10min，然后再加入25 mL Superflocl27溶液，摇匀后放置20min。再用专用稀释加液器取2 mL上清液，加10 mL水，用lcm光径的比色杯，在420nm波长处读其吸光度。 2.2.3.4结果计算在ASI方法中，可用以下公式计算土壤有机质含量: OM(,)=7(296A