大肠杆菌检测

1 绪论 一般情况下，大肠菌群是一种生存在人和动物肠道里面的无害细菌，其的生理代谢能够促进人和动物体内维生素B和维生素K的合成，以及合成具有杀菌功效的大肠菌群素。由此看来，大多数情况下适量大肠菌群对人体是有益无害的,但若是在食物中检测出有害性或过量的大肠菌群的时侯 ，感染者就有可能出现脱水性腹泻或者出血性腹泻，高烧，并且引起一系列的并发症，例如尿血，脑功能障碍等等。 2 材料与方法 2.1材料 2.1.1实验仪器 AKDL-II-16型艾柯超纯水机（成都康宁实验专用纯水设备厂），HH-6型数显恒温水浴锅（上海浦东物理光学仪器厂），HZT-A1000型电子天平（福州市电化学仪器有限公司），YXQ-LS-100A型全自动立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），QYC-2102C型恒温培养箱（常州市华普达教学仪器有限公司），容量瓶，烧杯，玻璃棒，小倒管，试管，锥形瓶，移液管，量筒，勺子，接种环，pH试纸，医用棉等。 2.1.2实验药品 氢氧化钠（分析纯，重庆江川化工有限公司），氯化钠（分析纯，重庆江川化工有限公司），乳糖（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司），牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司），煌绿乳糖胆盐肉汤（北京奥博星生物技术有限责任公司），1.6%溴甲酚紫乙醇指示剂。 2.2方法 大肠菌群MPN计数法:大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中的大肠菌群数系以100 mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 2.2.1乳糖蛋白胨培养液配制 配制方法：     (1)蛋白胨:10.0 g；（2）牛肉膏:3.0 g；（3）乳糖:5.0 g；（4）氯化钠:5.0 g；（5）1.6%溴甲酚紫乙醇溶液:2 mL；（6）氢氧化钠:10.0 g；（7）蒸馏水:1000 mL。 称取好上述蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠后加入1000 mL的蒸馏水于数显恒温水浴锅中加热溶解，待溶解完全后用配制好的氢氧化钠溶液调节乳糖蛋白胨培养基的pH值，使它的pH值在7.2-7.4之间, 最后用量程为1 mL的移液管吸取1 mL 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液加入刚配制好的乳糖蛋白胨培养基，适度振荡使之充分混匀，然后分装到带有小倒管的锥形瓶中，最后在全自动立式压力蒸汽灭菌器中以121 ℃高压灭菌22分钟，待冷至室温后备用。 按照以上乳糖蛋白胨培养液除蒸馏水以外，其他药品加2倍或3倍可配成二倍浓缩乳糖蛋白胨培养基和三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基。 2.2.2煌绿乳糖胆盐肉汤配制 称取好煌绿乳糖胆盐肉汤40.0 g，加入1000 mL的蒸馏水于数显恒温水浴锅中加热溶解，待溶解完全后用配制好的氢氧化钠溶液调节煌绿乳糖胆盐肉汤的pH值，使它的pH值在7.2 -7.4之间，分装到带有小倒管的试管中，然后在全自动立式压力蒸汽灭菌器中以121 ℃高压灭菌22分钟，待冷至室温后备用。 2.2.3检样制备 将25.0 g粉碎的方便面面饼粉装入盛有225 mL已灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇使之配制成1:10的方便面样品匀液。 选取1支量程为5 mL的已灭菌移液管吸取1:10方便面样品匀稀释液15 mL，沿着锥形瓶缓缓注入盛有135 mL已灭菌蒸馏水的试管内，充分振摇混匀，制成1:100的方便面样品匀液。 另选取1支量程5 mL的已灭菌移液管吸取1:100方便面样品匀稀释液15 mL，沿着试管壁缓缓注入盛有135 mL已灭菌蒸馏水的试管内，充分振摇混匀，制成1:1000的方便面样品匀液。 2.2.4乳糖初发酵实验 每个方便面样品匀液，分别选取3个连续适宜稀释度的方便面样品匀液（分别为1:10，1:100，1:1000），并且每个稀释度接种3瓶乳糖蛋白胨培养液，每瓶接种25 mL，放在温度为36±1 ℃恒温培养箱调控中培养24±2 h，观察锥形瓶里的倒管内是否有气泡产生，乳糖蛋白胨培养液颜色是否变色。在恒温培养箱24±2 h后，将产气的挑选出来进行下一步复发酵实验，没有产气的则继续在恒温培养箱中培养48±2 h，再一次将产气的挑选出来进行下一步复发酵实验。则没有产气的就可认定为大肠菌群的阴性。 2.2.5复发酵实验 用已灭菌的接种环从产气或者乳糖蛋白胨培养液颜色变黄的乳糖蛋白胨培养基中分别选取培养物质1环，接种在煌绿乳糖胆盐肉汤试管中，放在温度为36±1 ℃恒温培养箱调控中培养48±2 h，观察其的产气情况。若有产气的，则认定为大肠菌群阳性管，确定是否为大肠菌群阳性管后检索MPN表读出大肠菌群数。 现行GB17400-2003方便面卫生标准为每100克面饼所检出大肠菌群不得超过30个。