地灵丹汤对单侧输尿管梗阻大鼠模型肾间质纤维化的防治作用

地灵丹汤对单侧输尿管梗阻大鼠模型肾间质纤维化的防治作用 地灵丹汤对单侧输尿管梗阻大鼠模型肾间质纤维化的防治作用 作者: 宦红娣, 张景红, 郑士荣, 孟巍巍, 张军力【摘要】 目的: 研究中药复方地灵丹汤对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)致肾间质纤维化模型大鼠肾间质纤维化的防治作用及其可能机制。 方法: 将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、依那普利组及地灵丹组。采用UUO法建立肾间质纤维化大鼠模型，观察血尿素氮、血清肌酐和24 h尿蛋白定量及肾组织病理改变，并采用免疫组织化学法检测转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF β1)、α 平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin, α SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)及层黏连蛋白(laminin, LN)的表达。 结果: 第7天模型组肾间质大量炎症细胞浸润及胶原表达，TGF β 1、FN和LN表达面积百分率较假手术组明显增加(P0.05);地灵丹组间质纤维化面积较模型组减少(P0.05)。第14天地灵丹组和依那普利组肾间质TGF β 1、α SMA、FN和LN表达面积百分率较模型组减少(P0.05)，BUN、SCr和24 h尿蛋白无明显差异。第21天地灵丹组SCr、肾间质纤维化和TGF β1表达面 积百分率较依那普利组和模型组下降(P0.05)。 结论: 地灵丹能减轻单侧输尿管梗阻模型大鼠的蛋白尿和肾间质纤维化，抑制TGF β 1、α SMA、FN和LN的表达。在较长时间应用后，地灵丹对模型大鼠的肾功能保护作用优于依那普利。 【关键词】 地灵丹; 肾间质纤维化; 转化生长因子β1; α 平滑肌肌动蛋白; 纤维连接蛋白; 层黏连蛋白; 大鼠 Objective: To investigate the preventive and therapeutic effects and the possible mechanisms of Dilingdan Decoction (DLDD), a pound Chinese herbal medicine, on rats with renal tubulointerstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction (UUO). Methods: Sixty SD rats were randomly divided into sham operated group, untreated group, enalapril treated group and DLDD treated group. Blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (SCr), urine protein quantization in 24 hours and pathological changes of the obstructed kidney were observed. The expressions of transforming growth factor β1 (TGF β1), alpha smooth muscle actin (α SMA), fibronectin (FN) and laminin (LN) were detected by immunohistochemical method and colored multimedia pathological image analysis system. Results: Massive inflammatory infiltrates and collagen expression in renal interstitial in the untreated group were observed on the 7th day. Compared with the sham operated group, percentages of area of TGF β1, α SMA, FN and LN expressions in the untreated group were markedly increased (P0.05), while the percentage of area of interstitial fibrosis was decreased in the DLDD treated group as pared with the untreated group (P0.05). On the 14th day, the percentages of area of TGF β1, α SMA, FN and LN expressions were declined in two treated groups as pared with the untreated group (P0.05), but had no statistical difference in biochemical indicators, including BUN, SCr and 24 hour urinary protein. On the 21st day, the level of SCr and the percentage of area of TGF β1 expression in the DLDD treated group were lower than those of the enalapril treated group (P0.05). Conclusion: DLDD can reduce the excretion of urinary protein and the degree of interstitial fibrosis, and significantly inhibit the expressions of TGF β1, α SMA, FN and LN. DLDD is superior to enalapril in protecting renal function after long time application in rats. Keywords: Dilingdan Decoction; renal interstitial fibrosis; transforming growth factor beta1; alpha smooth muscle actin; fibronectin; laminin; rats 肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)是各种原发或继发性肾脏疾病持续发展导致肾功能不可逆损害的病理过程，其主要的病理特征为肾间质纤维细胞的增生和细胞外基质如?、?、?和?型胶原，纤维连接蛋白(fibronectin, FN)，层黏连蛋白(laminin, LN)的过度积聚。它是各种肾脏疾病发展到慢性肾功能衰竭的共同途径，其中转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF β1)被公认为是最主要的致纤维化因子,1, 2,。国内外学者对肾间质纤维化的研究日益重视。有研究证实血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)类药物具有一定的抗纤维化作用，但临床效应尚不理想。本研究基于数十年的临床观察和分析，经反复筛选，以生地黄、丹参和仙灵脾等组成的中药复方地灵丹汤(Dilingdan Decoction, DLDD)，采用动物实验，观察地灵丹汤对肾间质纤维化的保护作用，探讨其在肾间质纤维化防治中的价值。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1. 1.1 主要试剂与仪器 兔抗大鼠肾组织TGF β1多克隆抗体、兔抗大鼠肾组织α 平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin, α SMA)多克隆抗体、兔抗大鼠肾组织FN多克隆抗体、兔抗大鼠肾组织LN多克隆抗体、即用型SABC试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色剂、生物素化山羊抗小鼠IgG抗体(以上试剂均购自武汉博士德公司)、Masson染色试剂盒(上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司)。图像分析仪、BX51系统显微镜(OLYMPUS公司)、分析软件(Image pro Plus version 4.1 for Windows)均由上海中医药大学实验中心图像分析室提供。 1. 1.2 实验药品 地灵丹汤由中国人民解放军第八五医院中药制剂室制备，由生地黄20 g，仙灵脾20 g和丹参15 g组成，按以上处方比例水煎2次，浓缩成1:1(即含生药1 g/ml)的水溶液，高温高压灭菌，密封，4 ?冰箱保存备用。马来酸依那普利片，10 mg/片，上海现代浦东药厂有限公司生产，国药准字H31021938。 1. 1.3 实验动物 雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量180,220 g，购于上海西普尔 必凯实验动物有限公司，合格证号: SCXK(沪)2017 0002。由上海中医药大学实验动物中心提供并饲养。 1.2 实验方法 1.2.1 模型制作 采用大鼠单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)法,3,建立肾间质纤维化模型，以2% 戊巴比妥钠(2 ml/kg)腹腔注射麻醉后，开腹结扎左侧输尿管近肾盂段，剪断输尿管，然后逐层缝合。假手术组手术入路方式同UUO组，进入腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管。 1.2.2 实验分组 所有动物在用药期间自由进食和饮水，饲养环境为每笼5只，温度(21?2)?，湿度(55?2)%。按体质量随机分为4组: 假手术组6只、模型组18只、依那普利组18只和地灵丹组18只。地灵丹组和依那普利组分别于手术后24 h给药，地灵丹组以地灵丹煎剂4 ml灌胃(相当于成人剂量50倍)，1次/d;依那普利组按10 mg/(kg?d)给药(溶于蒸馏水中配成1 mg/ml溶液)，1次/d;假手术组和模型组于术后24 h开始给予生理盐水4 ml灌胃。 1.3 检测指标及方法 1.3.1 肾脏病理检查 随机选取模型组、依那普利组和地灵丹组6只大鼠分别于术后第 7、14和21天处死;假手术组中的6只大鼠于术后第7天处死。处死大鼠取肾脏组织予常规石蜡包埋切片、HE染色下观察肾小管及间质病变。肾间质纤维化面积采用Masson染色法，光学显微镜下(×400)随机选取10个不含肾小球和血管的不重叠视野，以肾间质蓝或绿色染色区为阳性目标区，用彩色多媒体病理图像分析系统进行灰度变换后，以阳性区域占该视野面积百分率的平均值表示病变程度。 1.3.2 血尿素氮和肌酐检测 所有大鼠眼眶静脉采血1 ml，Eppendorf管内0,4 ?冰箱保存，采用HITACHI 7170型全自动生化分析仪检测(中国人民解放军第八五医院生化室)血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和血清肌酐(serum creatinine, SCr) 1.3.3 24 h尿蛋白定量检测 分别于处死前1天将大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液，双缩脲比色法检测尿蛋白定量。 1.3.4 免疫组织化学检测 肾组织中TGF β 1、α SMA、FN和LN的表达采用免疫组化方法检测。3 μm厚石蜡切片常规脱腊和水化后，经3,过氧化氢孵育10 min灭活内源性过氧化氢酶，蒸馏水洗3次。进行热抗原修复，将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中加热至沸腾后断电(间隔5,10 min后重复一次)，冷却，用PBS(pH 7.2,7.6)洗涤2次。滴加5, BSA封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。分别滴加兔抗大鼠FN、LN、α SMA和TGF β1(1:100)抗体，4 ?冰箱过夜。PBS洗涤2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37 ? 20 min。PBS洗2 min×3次。滴加试剂SABC，37 ? 20 min。PBS洗5 min×4次。DAB显色，镜下控制反应时间，苏木素轻度复染后脱水、透明和封片。显微镜下(×400)随机选取10个不含肾小球和血管的不重叠视野，以肾间质棕褐色染色区为阳性目标区，用彩色多媒体病理图像分析系统进行灰度变换后，计算阳性区域占该视野面积百分率，以10个视野的平均值表示纤维化病变程度。 1.4 统计学方法 计量数据采用x?s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用两因素方差分析及最小显着差异t检验比较组间差异，P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 各组大鼠BUN、SCr和尿蛋白定量 造模后第7天，各组BUN、SCr和尿蛋白定量比较差异无统计学意义。第21天依那普利组和地灵丹组SCr含量与尿蛋白定量均较模型组低(P0.05)，且地灵丹组SCr水平低于依那普利组，差异有统计学意义(P0.05)。见表1。 表1 各组大鼠BUN和SCr以及24 h尿蛋白定量(略) Table 1 Results of BUN, SCr, and urine protein quantization in 24 hours in different groups ?P0.05, vs untreated group; ?P0.05, vs enalapril treated group. 2.2 肾脏病理改变 实验第7天假手术组大鼠肾间质组织胶原染色主要位于肾小管基膜、系膜区和肾小管间的毛细血管周围。模型组大鼠肾间质染色表现为肾小管上皮细胞萎缩，肾小管腔扩张，间质炎症细胞和成纤维细胞增生;地灵丹和依那普利药物组也有以上表现，但肾小管上皮细胞萎缩和肾小管腔扩张程度较模型组明显减轻，间质纤维化面积少(P0.05)。第14天可见肾间质大量炎症细胞浸润，成纤维细胞局灶大量出现，肾小管局灶性萎缩或扩张，间质灶性纤维化。模型组最重，出现了肾小管断裂;依那普利组肾间质纤维化面积较模型组明显减少(P0.05)。第21天模型组大鼠肾间质大量炎症细胞和成纤维细胞，肾小管大面积萎缩、扩张或塌陷，肾间质大面积纤维化;地灵丹组和依那普利组肾间质纤维化面积百分率较假手术组明显减少(P0.05)，且地灵丹组少于依那普利组(P0.05)。见表2。 表2 各组大鼠肾间质纤维化面积百分率(略) Table 2 Percentages of interstitial fibrosis area in rats in different groups *P0.05, vs sham operated group; ?P0.05, vs untreated group; ?P0.05, vs enalapril treated group.。