α-淀粉酶活力的测定

α-淀粉酶活力的测定 α-淀粉酶活力的测定 姓名___学号___ 一、实验目的: 1. 掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理及其实验方法。 二、实验原理: α-淀粉酶 - 是一种内切酶 - 只能水解α-1, 4糖苷键 - 不能水解α-1,6糖苷键 - 不能水解α-1,6糖苷键附近的α-1,4糖苷键 - 产物为糊精、低聚糖、麦芽糖和少量葡萄糖 α-淀粉酶活力测定的方法 1(反应底物: 可溶性淀粉 2(反应环境: 60?，pH为6.0，常压 。 3(产物: 还原性葡萄糖 4(活力测定方法: 1)测定还原糖产生速度 2)测定淀粉遇碘显色力下降的速度 3)测底物粘度下降的进度 • 还原糖与黄色的 3,5- 二硝基水杨酸显色反应来测定. • 生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比. • 以每克酶在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小. 三、试剂与仪器: 1、仪器 (1)电子天平 (2)容量瓶 100mL (3)试管 (4)恒温水浴锅 (5)紫外可见分光光度计 (6)烧杯 250 mL 2(试 剂 (1)1% 可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉(以绝干计)1. 000g(精确至 0.001g，用水调成浆状物(在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。然后，以30mL 水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至 100mL。此溶液需要当天配制。 (2)0.4mol/L 氢氧化钠: 称取 1.6g 氢氧化钠，溶于少量蒸馏水，定容至 100 mL. 1 (3)磷酸缓冲液(pH6.0): 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)45.23g、柠檬酸(C6H8O7?H2O)8.07g，用水溶解并定容至1000mL。配好后用pH计校正。 (4)3,5- 二硝基水杨酸:精确称取 1g 3,5- 二硝基水杨酸溶于 20mL 1mol/L 氢氧化钠中,加入 50mL 蒸馏水,再加入 30g 酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水稀释至 100mL ,盖紧瓶塞,防止CO2进入. (5)麦芽糖液(1mg/ml):称取0.100g麦芽糖,溶于少量蒸馏水,定容至100mL . (6)α-淀粉酶:枯草芽孢杆菌生成，最适pH 5.5-7.5,最适温度 50~70? 四、测定步骤: 1. 麦芽糖标准曲线的制作: 取25ml刻度试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液(lmg/ml) 0, 0.2, 0.6, 1.0, 1.4, 1.8, 2.0 ml ,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达 2.0ml ,再各加 3 , 5 -二硝基水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热5min .取出冷却,用蒸馏水稀释至25 m1 .混匀后用分光光度计在520 nm 波长下进行比色,记录吸光度.以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量(mg)为横坐标,绘制标准曲线. 2. 待测酶液的制备: 称取酶粉0.1g，精确至0.0002g，先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至100mL，摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。 3. 酶反应 (1)取试管3支,标明1支为对照管, 2支为测定管. (2)于每管中各加酶液 l ml ,在对照管中加入 4 m1 0.4mol/ L 氢氧化钠. (3)在3支试管中各加入 1ml pH6.0 的磷酸缓冲液. (4)将3支试管置60?恒温水浴中保温 15min ,再向各管分别加入60 ?下预热的1,淀粉溶液 2m1 ,摇匀,立即放入60 ?恒温水浴中，1支准确计时保温5min ，1支准确计时保温10min .取出后向测定管迅速加入 4 ml 0. 4mol/ L 氢氧化钠,终止酶活动,准备测糖. 4. 活力测定 (1)取步骤3中酶作用后的溶液2m1, 分别放入相应的3支试管 中. (2)各加入2m1 3,5- 二硝基水杨酸试剂.以下操作同标准曲线制作. (3)根据样品比色吸光度,从标准曲线查出麦芽糖浓度,最后进行结果计算. 2 五、计算: C x8 mLx1000 α-淀粉酶活力(umol/min?g)= ------------------------ Mx Tx0.001 式中: C - 测定用样液中麦芽糖的浓度(mg/mL); M - 麦芽糖的相对分子质量(360.31 g/mol); T - 反应时间(min); 0.001- 所取的酶量(g); 六、实验结果: 3