脊柱黄韧带骨化细胞COX2、VEGF的表达及其意义

脊柱黄韧带骨化细胞COX2、VEGF的达及其意义 脊柱黄韧带骨化细胞COX2、VEGF的表达 及其意义 第15卷第1期 2006年2月 中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESEJOURNALOFHIsOCHEMIRYANDCyX?lM?SIRY Vo1.15.No.1 Feb-2006 脊柱黄韧带骨化细胞COX2,VEGF的表达及其意义 秦德安张佐伦李晓东刘峰崔新刚 (山东大学省立医院骨科,济南250021;长治市第二人民医院骨科,长治046000) (摘要)目的探讨脊柱黄韧带骨化韧带细胞COX2,VEGF表达及其临床意义.8例胸椎黄韧带骨化症手术 取得的黄韧带标本,做COX2,VEGF免疫组化染色,分析两者表达及相互关系;原代培养黄韧带细胞,分常规(N),低 氧(0),塞来昔布药物作用(D)三组,做COX2,VEGF免疫细胞化学染色和ELISA测定上清液VEGF.结果8例中, 6例共阳性表达COX2和VEGF,2例COX2阳性和VEGF弱阳性,直线相关分析吸光度值,相关系数r一0.8461(P< 0.05).N组细胞COX2阳性表达,VEGF弱阳性,0组两者均强阳性,D组10ttmol/L两者弱阳性,2O一100ttmol/L均阴 性.N组上清液VEGF浓度(5.379士0.245)mg/L,显着低于0组的(13.256士0.138)mg/L,D组2O一100ttmol/L各 组浓度显着低于对照组.结论脊柱黄韧带骨化细胞异常分泌COX2和VEGF,促进局部血管新生,是骨化必备条件.选 择性COX2抑制剂可能控制疾病发展或防止术后复发. (关键词)黄韧带骨化;环氧合酶2;血管内皮生长因子;塞来昔布 (中图分类号)R681.532(文献标识码)A E?PRESS10NANDCHINICALSIGN?1ICANCE0F0a(2ANDVEGFINCE】LI0F SPALLIGAT?ENTI】M1.A?刀?OSS?CI1ON QinDean,ZhangZuolun,LiXiaodong,LiuFeng,CuiXingang (DepartmentofOrthopedics,ShandongProvincialHospital,ShandongUniversity,Jinan250021; DepartmentofOrthopedics,TheSecondChangzhiPeople'SHospital,Changzhi046000,China) (Abstract3ObieetiveTodiscusstheexpressionandclinicalsignificanceofCOX2andVEGFincells ofspinalligamentumflavumossification.Methods8samplesofthoracicossificationofligamentumflavum (TOLF)wereobtainedduringoperation.COX2andVEGFimmunohistochemistry(IHC)wasperformed, andtheexpressionandrelationshipswereanalyzed.Ligamentumflavumcells(LF? s)wereculturedunder normal(N),hypoxia(O)andcelebrex-treated(D)conditionrespectively,andthenCOX2,VEGFimrnu— nocytochemicalstainingandELISAtestofsupernatantVEGFwereapplied.ResultsSixofeightcasesex- pressedbothCOX2andVEGFpositively,while2casesexpressedo0X2positivelyandVEGFweakly. Theabsorbency(A)valuewasanalyzed,andthecorrelationcoefficientrwas0.8461(<0.05).LFCs expressedCOX2positivelyandVEGFweaklyingroupNandexpressedbothmostintenselyingroup0. LFCsexpressedbothweaklyunder10ttmol/Landnegativelyunder20— 100ttmol/LingroupD.Thecon— centrationofVEGFingroupNwas(5.379?0.245)mg/L,lowerthanthatingroupO(13.256 ? 0.138)mg/LTheconcentrationingroupDtreatedwith20—100ttmol/Lwaslowerthanthatinthecon— trolgroup.ConclusionLFcSfromTOLFsecreteCOX2andVEGFabnormallyandstimulate vasculogene- sis,whichisindispensabletoossification.TheselectiveCOX2inhibitormaypreventtheaggr avationand recurrenceafteroperation.. , (Keywords3Ossification;Ligamentumflavum;COX2;VEGF;Celebrex 脊柱黄韧带骨化病因不明,研究表明其本质是 在韧带退变基础上的软骨内异位骨化,导致黄韧带 骨化的因素是各种生长因子或细胞因子,骨形成蛋 (收稿日期)2005-04—11(修回日期)2005-07—12 (作者简介)秦德安,男(1974年),主治医师,在读博士生. *通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed) 白(瑚)和转化生长因子p(TGFI3)在黄韧带 骨化的发病中具有重要作用[h引.研究证实,黄韧 带骨化初期有丰富血管增生,是BMP阳性细胞的 来源,对骨化有重要意义[1].已证实血管内皮生长 因子(VEGF)是血管增生最主要刺激因子.异位 骨化目前最有效预防药物是非甾体类抗炎药 (NSAIDs)[3],环氧合酶(COX)抑制剂是其主要 第1期秦德安等.脊柱黄韧带骨化细胞C0x2,VEGF的表达及其意义45 药物.环氧合酶是花生四烯酸合成前列腺素的关键 酶,有COX1和COX2两种亚型.基于以上研究, 通过观察脊柱黄韧带骨化组织,细胞表达COX2, VEGF和选择性COX2抑制剂塞来昔布对细胞的 影响,探讨骨化病因,寻求一条新的研究途径和治 疗,预防方法. 和方法 1.材料8例胸椎黄韧带骨化症(TOLF)的 未骨化区黄韧带手术标本,DMEM培养基(Gib- co),新生牛血清(FI,杭州四季青),2.5g/L 胰酶和lg/LI型胶原酶(Sigma公司).四甲基偶 氮唑蓝(MTT,鼎国公司),二甲基亚砜(DM— S0,华美公司),塞来昔布(合肥森瑞),塞来昔 布溶于DMSO并保存于一2O?,在所有实验组培 养液中DMSO的终浓度不大于1mL/L,对细胞生 长无明显影响.鼠抗人VEGF,COX2单抗,SP一 9000试剂盒,均为即用型,浓缩型显色剂, 均为北京中山产品.人?,GF_ELISA试剂盒(R &D,美国). 方法 2. 2.1免疫组化染色标本用1O中性福尔马 林溶液固定,常规石蜡切片,COX2,VF_~F免疫 组化染色(SP法),按说明书操作.用已知阳性乳 腺癌片作阳性对照,正常黄韧带标本作阴性对照, PBS代替一抗作空白对照.结果判断:细胞 质无颗粒状染色为阴性,黄色颗粒为弱阳性,棕黄 色颗粒为阳性,棕色颗粒为强阳性.用BI-2000免 疫组化分析软件,收集COX2,VEGF染色吸光度 (A)值,做直线相关分析. 2.2细胞培养,ELISA和黄韧带细胞(LF— Cs)免疫细胞化学染色无菌切取胸椎黄韧带骨 化症后路手术椎板问未骨化区黄韧带1cm3,I)- Hanks液漂洗去血迹,剪除非韧带组织,在含无 血清DMEM(含双抗各100U/m1)青霉素瓶中剪 碎至lmma,1g/L胶原酶37?,5C02孵箱中消 化3O一60min,以含1OFCS-DMEM终止,将组 织小块间距5mm接种于瓶底预先涂有血清的 25mL培养瓶内,加入少量培养液湿润组织块, 37?,5Co2孵箱中培养,过夜再小心加入培养 液,尽量勿使组织块飘浮,前3—4d勿做观察,以 后每周换液两次,待细胞生长至8O一9O汇合 时,用2.5g/I胰酶消化传代.取对数生长期的第 2,3代细胞以1×10.L-1接种于放有盖玻片的6孔 培养板上,置37?,5Co2孵箱中培养2—3d, 收集上清液,离心去沉淀,--20?保存备测.取出 盖玻片,冷丙酮室温固定15min,SP法COX2, VEGF染色,PBS代替一抗作对照.染色观察细 胞95以上为黄韧带细胞.采用双抗夹心ELISA 法,测定上清液VEGF浓度,按说明书操作,在 结合有VEGF抗体的微量滴定板中加入100~L倍 比稀释的?GF标准品和样品,孵育30min,以 缓冲液洗涤3次,加入酶标抗体孵育30min,洗涤 3次,加入底物液反应20min,终止反应,450nm 波长下测定吸光度(A)值,由VEGF蛋白标准曲 线得出其浓度. 2.3低氧刺激组(O)将细胞长至8O汇 合的6孔培养板置于90N2,5C02,502低 氧培养箱培养24h,收集上清液,取出盖玻片,按 以上方法做ELISA和LFCs免疫细胞化学染色 (SP法). 2.4塞来昔布组(D)塞来昔布溶液加入6 孔培养板,终浓度0,10,20,40,80和 100/~mol/L,常规培养LFCs3—5d,在一定时间 内,收集上清液,不同浓度各设6个复孔,ELISA 法测VF_~F浓度.各浓度组LFCs做免疫细胞化 学染色. 2.5塞来昔布细胞抑制实验(M1vr法) 将对数生长期LFCs消化接种于96孔板,每孔含 5新生牛血清的DMEM培养液200~L,细胞数 为1×1OL_..加入终浓度分别为1O,2O,4O,8O 和100t~mol/L塞来昔布溶液,不加细胞孔作空白 对照调零,不加药物孔作阴性对照,每组设6个复 孔,37?,5C02培养72h后倾去培养基,各孔 加入5g/LMTT20/~L,继续培养4h.弃培养液, 加入DMSO150vL,振荡仪上室温振摇15rain,酶 标仪490nm波长测吸光度(A)值.计算细胞的 存活率一[(药物组A一空白对照组A)/(阴性对 照组A一空白对照组A)3×100. 2.6统计学处理采用SPSS10.0软件,数 据采用均数士标准差(士s)表示.对COX2和 VEGF免疫组化A值采用直线相关分析和t检验; 两样本均数比较采用配对设计t检验;不同浓度药 物处理组与对照组比较采用Dunnettt检验. 0,.'文 l'll:一 0— ,一一 ' ' .', , ' ? 【, ,, ^ - 1 - ^ , 一:' . l-,,一- 0' . , ..':.' ,? , 一鑫\-. 1/, 一 a 3 第1期秦德安等.脊柱黄韧带骨化细胞CA)X2,VEGF的表达及其意义—47 结果 1.免疫组化正常黄韧带组织纤维排列, 韧带细胞稀少,COX2和VEGF染色阴性,8例 TOLF组织,纤维排列紊乱,韧带细胞增生,6例 LFCs共表达COX2和VEGF(图1),胞质有棕黄 色颗粒.2例COX2阳性表达,VEGF弱阳性表 达,COX2,VEGF染色平均吸光度A值分别为 0.875土0.034,0.741土0.088,直线相关分析r一 0.8461(P<O.05). 2.细胞生长观察IFCS生长缓慢,约7— 10d见有细胞从组织小块边缘萌出(图2),呈典型 成纤维细胞形态,长梭形,多角形,约25d可达到 8O汇合.低氧刺激24h后LFCs形态,数目无明 显改变.塞来昔布组LFCs培养5d后,8O一 100~mol/I组LFCs出现形态改变:细胞变扁平, 胞核浓缩,胞质内出现空泡,细胞表面出现漂浮 物,0—20~mol/L组LF?s形态无明显改变. 3.免疫细胞化学染色常规培养条件下, U,Cs的COX2阳性表达(图3A),VEGF弱阳性 表达,与免疫组化染色结果一致;低氧条件下两者 均强阳性表达(图3B);塞来昔布lO/xmol/L组 LFCs在培养3d后,COX2和VEGF表达呈弱阳 性,仅见少数细胞胞质轻度黄染,2O—lO0~mol/L 组LFCs的CO)【2和VEGF表达阴性(图3C). 4.MTT细胞存活率在20,40~mol/L组显 着低于对照组(P<O.05),80,100~mol/L组进 一 步降低(P<O.01),抑制作用具有浓度依赖性 (图4). l2O l0o 8o 6O 言4OU 《2O O 020406O8O100 Concentrationofcelebrex(mol/L) 图4不同浓度塞来昔布对LFCs活力影响(MTT法) Fig.4Effectofdifferentconcentrationofcelebrex onactivityofLFCs.(~-t-s,n一6).P<005,.P< 0.01.vscontrolgroup(MTTmethod) 5.培养上清液VEGF浓度塞来昔布组随药 物浓度增加,上清液VEGF浓度整体呈下降趋势, 塞来昔布可抑制VEGF释放,并呈剂量效应关系 (图5). O2O406O8O100 Concentrationofcelebrex【umot/L) 图5不同浓度塞来昔布对?GF的影响(?』SA法) Fig.5Effectofdifferentconcentrationofcelebrex onconcentrationofVEGF(士s,n一6).P<0.05, 一P<001,vScontrolgroup(ELISAmethod) 讨论 脊柱黄韧带骨化属予韧带异位骨化,一旦发 病,即呈进行性压迫脊髓,神经根,目前尚无有效 内科防治办法,唯手术切除减压.但手术风险很 大,少数患者术后几年在其它部位黄韧带又发生骨 化,致手术效果不理想,因此寻找药物防治方法非 常必要.为此,学者们进行了大量探索.目前认为 韧带骨化发生在退变的基础上,骨化必伴血管生 成,骨化初期的血管增生标志着骨化的开始[?,有 VEGF的参与[4],韧带的成纤维细胞是VEGF的 重要来源.异位骨化临床多见,NSAIDs是目前最 有效的预防异位骨化形成的药物,其中,选择性环 氧合酶2(CO)(2)抑制剂塞来昔布近年研究和应 用较多. VEGF是重要的血管生成调节物质,胚胎时期 广泛表达,正常成年组织不表达或低水平表达.研 究显示VEGF具有明显的成骨作用,可以加速骨 折的愈合.Bouletreau等[】认为缺氧和VEGF高 表达可能促进局部内皮细胞分泌BMPs,从而加速 损伤愈合,认为VEGF的成骨作用可能通过BMPs 来介导. 环氧合酶(COX)有COXl和COX2两种亚 一/嚣量一0山>Joc0I】扛cu3u0u 中国组织化学与细胞化学杂志第15卷 一般不表达或低表达,在 型,COX2为诱导型酶, 受到各种刺激如损伤,缺氧时,内皮细胞,巨噬细 胞,成纤维细胞等表达迅速上调[6],参与多种病理 生理过程.COX2的转录调节是骨代谢的强力调节 因子,对骨折愈合必不可少,选择性COX2抑制 剂可完全阻断骨形成[7].COX2和VEGF关系密 切,COX2的增加可促进VEGF的表达[8],从而 共同促进局部血管生成. 研究已证实乳腺癌组织高表达COx2和 VEGF,故将其作为免疫组化阳性对照.实验发 现,病变韧带及细胞持续表达COX2,产生炎症反 应,表明炎症对韧带骨化起一定作用.通过低氧刺 激,证实LFCs能高表达COX2,VEGF,从而推 测低氧也可能是黄韧带骨化的原因之一,体内黄韧 带退变肥厚,反复创伤使局部微环境缺氧,刺激韧 带成纤维细胞增生并异常分泌COX2,VEGF,从 而促进局部血管生成和内皮细胞分泌BMPs,骨化 开始.使用选择性COX2抑制剂塞来昔布作用于 培养细胞,通过抑制COX2来影响VEGF的表达, 推测COX2抑制剂可通过抑制血管生成达到预防 和控制TOLF.利用这一机制,选择性COX2抑制 剂已广泛用于治疗骨关节炎,类风湿性关节炎和强 直性脊柱炎等. 需要指出,黄韧带骨化一旦压迫脊髓,当前唯 手术能解决问题.可能的话,选择性COX2抑制 剂仅能用于控制疾病发展或防止术后复发,其对脊 柱韧带骨化的作用尚需进一步研究.' 参考文献 (1)王哲,王全平,张俊华,等.骨形成蛋白在黄韧带骨 化中的表达定位.第四军医大学,2002,23(4): 341-343 (2]NakataniT,MaruiT,HitoraT,eta1.Mechanical stretchingforcepromotescollagensynthesisbycultured cellsfromhumanligamentumflavtanviatransforIIlillg growthfacmr-beta1.JOrthopRes,2002,2O(6): 1380-1386 (3]尹峰,张光健,印心奇.异位骨化及其研究进展.中 华骨科杂志,1998,18(4):240-242 (4]SteinbrechDS,MehraraBJ,SaadehPB,etaLVDGF expressioninanosteoblast-likecelllineisregulatedbya hypoxiaresponsemochanism.AmJPhysiol,2000,278 (4):C853-860 (5]BouletreauPJ,WarrenSM,SpeetorJA,eta1.Hypoxia andVEGFup-regulateBMP2mRNAandproteinex- pressioninmicrovascularendodlelhlcells:Implications forfracturehealing.HastReconstSurg,2002,109 (7)l238@2397 (6]DemasiM,ClelandLG,JohnsonRJ,etaLEffectsof hypoxiaontheexpressionandactivityofcyclooxygenase 2infibroblast-likesynoviocytes:interactionswithlOS- ocyte-derivedsolublemediators.ArthritisRheum, 2004,5O(8):2441—2449 (7]SimonA,ManigrassoM,O'ConnorJ.Cyclo-oxygen- ase2functionisessentialforbonefracturehealing.J BoneMinerRes,2002,17(6):963-976 (8]谢传高,王兴鹏,董育玮,等.C-0x2抑制剂celebrex 对胰腺癌PC3细胞系VEGF表达的影响.中国癌症 杂志,2003,13(5):459-461