鸡肝微粒体细胞色素P450酶系检测方法的建立

鸡肝微粒体细胞色素P450酶系检测的建立 鸡肝微粒体细胞色素P450酶系检测方法的 建立 中国兽医科学2006,36(02):147—15O VeterinaryScienceinChina 中图分类号:S859.7文献标识码:A文章编号:1673—4696(2006)02—0147—04 鸡肝微粒体细胞色素P450酶系检测方法的建立 杨海峰,江善祥 (南京农业大学动物医学院,江苏南京210095) 摘要:为建立鸡肝微粒体细胞色素P450(CYP450)酶系活性的测定方法,应用超速离心法提 取了12只60日龄依莎公鸡的肝微粒体,采用Bradford法测定肝微粒体蛋白含量,紫外分光光度 法测定CYP450酶系活性.结果显示,肝微粒体蛋白含量为11.32mg/g?1.43mg/g,CYP450含 量为0.71nmol/mg~O.08nmol/mg,NADPH一细胞色素C还原酶活性为3.01nmol/(min?mg) ?0.26nmol/(min?mg),AND活性为2.36nmol/(min?mg)?0.18nmol/(min?rag),ERND活 性为1.21nmol/(min?mg)?0.11nmol/(min?mg),AH活性为0.25nmol/(min?mg)?0.03 nmol/(min?mg).结果明,建立的鸡肝微粒体CYP450酶系的检测方法灵敏可靠,重复性较好. 关键词:细胞色素P450;肝微粒体;鸡;方法学 Methodologicalstudyondeterminationofactivitiesofhepatic microsomalcytochromeP450sinchickens YANGHai—feng.JIANGShan—xiang (CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalI-Iniversity,Nanjing210095,China) Abstract:Twelve60一day— oldcockswereselectedtoestablishamethodfordeterminationofactivities ofhepaticmicrosomalcytochromeP450s.Livermicrosomewasdistilledbydifferentvelocitycentrifuga— tion.TheBradfordmethodwasusedtomeasuretheconcentrationofproteininlivermicrosome.Activities ofcytochromeP450sweremeasuredbyspectrophotometry.Proteinconcentrationinhepaticmicrosome was11.32mg/g11.43mg/g,contentofcytocbromeP450was0.71nmol/mg~0.08nmol/mg,activityof NADPH—cytochromeCreductasewas3.O1nmol/(min?mg)? 0.26nmol/(min?mg).theactivityofAND was2.36nmol/(min?rag)? 0.18nmol/(min?mg),theactivityofERNDwas1.21nmol/(min?mg)? 0.11nmol/(min?mg),andtheactivityofAHwas0.25nmol/(rain?mg)? 0.03nmol/(min?mg).Re— suitssuggestedthattheestablishedmethodfordeterminingcontentsandactivitiesofhepaticmicrosomal cytochromeP450sinchickenswassensitive,reliablewithgoodreproducibility. Keywords:cytochromeP450;livermicrosome;chickens;methodology 细胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)是 一 类主要存在于肝细胞微粒体上的一组同工酶,药 物在动物体内的I相代谢反应主要依赖CYP450催 化完成,CYP450活性的强弱决定着机体对药物代 谢的速率].与此同时,CYP450的活性也能被许 多药物诱导或抑制,从而引起药物间的相互作用. 然而兽医临床用药很少考虑CYP450活性对药物代 谢的影响,由此增加了兽药疗效下降,中毒和残留的 发生率,进而影响了动物性食品安全.因此,对食品 动物CYP450活性的研究已成为兽医临床药理学研 究的新课题.目前,肝微粒体CYP450的研究多集 中于实验动物(大鼠,小鼠),植物和昆虫,而关于鸡 或其他食品动物的报道则很少],国内仅有关于 猪[4和牛l5]CYP450的几篇报道.因此,为在肝微 粒体水平研究药物在动物体内的代谢情况,有必要 建立灵敏,可靠的CYP450酶系检测方法.本试验 收稿日期:2005—10—28;修回日期:2006一O1—18 作者简介:杨海峰(1981一),男,江苏南通人,硕士生,E-mail:yhf8142@sina.eom.江善 祥为通讯作者,教授,主要从事兽 医药理与毒理学研究,E—mail:auvy@sina.eom 148中国兽医科学第36卷 以食品动物鸡为研究对象,采用差速离心法制备微 粒体,用紫外分光光度法测定CYP450酶系的含量 和活性,同时建立了鸡肝微粒体CYP450酶库,旨在 为鸡CYP450的系统研究提供可靠的手段,最终为 指导兽Nit$床合理用药提供理论依据. l材料 1.1实验动物 1日龄依莎雄性雏鸡,南京青龙山鸡场提供,按 常规方法笼养和免疫预防,自由饮水和采食,饲料为 全价日粮.饲养至60日龄,选取12只健康,体重相 近(400~450g)的鸡用于试验. 1.2主要试剂 Tris,考马斯亮蓝G一250,牛血清白蛋白:国药 集团化学试剂有限公司提供;NADPH:Roche公司 产品;细胞色素C:Sigma公司产品;红霉素:上海华 舜生物有限公司提供;CO气体:南京苏碳气体 有限公司产品;其余试剂为国产化学试剂,纯 AR. 1.3主要仪器和设备 低温高速离心机,低温超速离心机:Beckman 公司产品;紫外分光光度计:日本岛津公司产品;数 显恒温水浴锅:国华电器有限公司产品;微型漩涡混 合仪:上海沪西分析仪器厂生产;电子天平:北京塞 多利斯天平有限公司提供;气体采集袋:大连光明气 体化工技术中心产品. 2方法 2.1肝微粒体的制备 鸡禁食12h后颈静脉放血处死,尽量放出血 液,迅速剖开腹腔和胸腔,取出肝,用预冷生理盐水 洗净,滤纸擦干,称重,计算相对肝重.参照文献 [6,7],用超速离心法制备肝微粒体,即靠肝门静脉 处取肝4g,剪碎后按质量体积比1:3的比例加入 预冷的0.05mol/LTris—HC1缓冲液(含0.2mol/I 蔗糖,pH7.4),用玻璃匀浆器匀浆.将匀浆液以 4?,12000Xg离心20min后取上清液,再4?, 105000Xg超速离心60min,红色沉淀即为肝细胞 微粒体组分.将微粒体沉淀取出后用含250mL/L 甘油的KC1磷酸盐缓冲液(0.15mol/LKC1—0.1 mol/LPBS,pH7.4)悬浮,每1g肝加悬浮液1mL, 用微型漩涡混合仪混匀后分装,一8O?存放. 2.2Bradford法对肝微粒体蛋白含量的测定 2.2.1牛血清白蛋白曲线的制备_8取7支 试管,标号,依次在试管中分别加入0,0.01,0.02, 0.04,0.06,0.08,0.10mLBSA溶液(1mg/mL), 各管用超纯水补足至0.1mL,得到0,0.1,0.2, 0.4,0.6,0.8,1.0mg/mL系列浓度的BSA溶液 0.1mI;然后加入5mLBradford试剂应用液,立即 混匀,25?水浴10min后,以空白管为对照,用紫外 分光光度计在595nm波长处进行比色,测定各管 D值.以系列浓度的牛血清白蛋白为横坐标, D值为纵坐标,进行线性回归,计算牛血清白蛋 白线性回归方程. 2.2.2微粒体样品中蛋白质浓度的测定对标准 蛋白定量的同时,另取试管加入1:20稀释的微粒 体悬液0.1mL,每个样品均作重复管,以后操作同 上,测定各样品的D值,依据线性回归方程计算 样品中蛋白质含量,并换算成每1g肝中所含的微 粒体蛋白含量. 2.3CYP450含量的测定_g 取微粒体悬液0.3mL,0.1mol/LPBS缓冲液 (pH7.4)5.7mI加至试管中,加入0.1g/mL连二 亚硫酸钠4OL,立即混匀,静置2min,等量分装到 2个比色杯中,分别作为对照和样本,向样本池缓慢 通入CO60S,稳定2min,以对照杯调零,紫外分光 光度计从400nm向500nm扫描.CYP450含量计 算公式如下: A一(D450一D49o)XN?(0.091XC) 其中,A为CYP450含量(nmol/mg),N为检测 样本的稀释倍数,C为检测样本的蛋白质浓度 (mg/mL)., 2.4NADPH-细胞色素C还原酶活性的测定 取微粒体悬液0.2mL,0.1mol/LPBS(含0.1 mmol/LEDTA)缓冲液5.6mL,5mg/mL细胞色 素C0.2mL于试管中,混匀,等量分装于对照杯和 样品杯.样品杯内加5mg/mLNADPH溶液2O L,立即混匀,每分钟测定一次D...,连续测定3 min.按下面公式计算结果: A一?DssoX1000?(19.1XC) 其中,A为NADPH一细胞色素C还原酶活性 [nmol/(min?mg)],?Ds5为每分钟Dss的增 加值,C为稀释后样品的蛋白质浓度(mg/mL). 2.5氨基比林一N一脱甲基酶(AND)活性的测定 2.5.1甲醛标准曲线的制备分别取0,0.1,0.2, 0.4,0.8和1.0mL甲醛工作液(0.1mmol/L)加至 试管中,各试管用超纯水补足至2.0mL,加入Nash 试剂2.0mL,6O?水浴10rain,自来水冷却,420 nm处测定各管的吸光度.以D4柏值为纵坐标,甲 醛浓度为横坐标,绘制甲醛标准曲线. 第2期杨海峰等:鸡肝微粒体细胞色素P450酶系检测方法的建立149 2.5.2AND活性的测定m取甘油一KCI磷酸盐 缓冲液1.7mL,加微粒体蛋白悬液0.1mL和20 mg/mL氨基比林溶液0.1mL,37C水浴温孵2 min后,测定管加10mmol/LNADPH溶液0.1 mL,空白管加蒸馏水0.1mL,37?水浴30min.各 管均加150g/LZnSO40.35mI,混匀,冰浴5rain, 加饱和Ba(OH):0.35mI,混匀,放置5min后 3000r/min离心5min.取上清液2.0mL,加Nash 试剂2.0mL,以后操作同甲醛标准曲线制备.根据 D和标准曲线计算酶活性. 2.6红霉素一N一脱甲基酶(ERND)活性的测定 反应体系中,红霉素终浓度为0.4mmol/L,其 余步骤同AND活性的测定. 2.7苯胺-4-羟化酶(AH)活性的测定 2.7.14一氨基酚标准曲线的制备取50~mol/L 4一氨基酚0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL,用60 mL/L三氯醋酸(TCA)补足至1mI,加10mL/L4一 氨基酚1mL,混匀,加1mol/L碳酸钠1mL,混匀, 室温放置30min,空白管调零,630nm处测吸光度. 以D值为纵坐标,4一氨基酚浓度为横坐标,绘制 4一氨基酚标准曲线. 2.7.2AH活性的测定Ll取1.0mmol/LNAD— PH溶液1.0mL和盐酸苯胺溶液0.5mL,置于10 mI试管内混匀,对照管加0.1mol/IPBS缓冲液 (pH7.4)1.0mL,取代NADPH溶液,37?水浴2 min.各管加0.5mL微粒体悬液,37?水浴再温孵 30min,加冰冷的200mL/LTCA1mL终止酶反 应,冰浴5min,11000×g离心10min,取1mL上 清于另一试管,以后操作同4一氨基酚标准曲线的制 备.根据D和标准曲线计算酶活性. 3结果 3.1牛血清白蛋白标准曲线 以系列浓度的牛血清白蛋白为横坐标,以 D值为纵坐标绘制的标准曲线见图1.此标准 曲线的线性回归方程为: 一0.6169x+0.0008,r一0.999 3.2甲醛标准曲线 以系列浓度的甲醛为横坐标,D…值为纵坐标 绘制的标准曲线见图2.其线性回归方程为: Y一1.9582x+0.0049.r一0.9986 3.34-氨基酚标准曲线 以系列浓度的4一氨基酚为横坐标,D值为纵 坐标绘制的标准曲线见图3.其线性回归方程为: Y一0.0096x一0.0012.r一0.9981 0.20.40.60.81.01.2 牛血清白蛋白浓度/(mg?mL一) Concentrationsofbovinealbumin 图1牛血清白蛋白标准曲线 Fig.1Thecalibrationcurveofbovinealbumin 0,25 0.20 E0.15 日0.10 0.05 0 0.o20.o40.o60.080.100.12 甲醛浓度/(m0l?mL-) Concentrationsofformaldehyde 图2甲醛标准曲线 Fig.2Thecalibrationcurveofformaldehyde Q6 Q5 4 ;Q3 誉0-2 Ql 0 — l 4-氨基酚浓度/(nmol?mL-) Concentrationsof4-amino—hydroxybenzene 图34-氨基酚标准曲线 Fig.3Thecalibrationcurveof4-amido-hydroxybenzene 3.4肝微粒体蛋白浓度和CYP450酶系活性 应用Bradford法测定鸡肝微粒体蛋白含量,紫 外分光光度法测定CYP450酶系活性,结果见表1. 4讨论 4.1试验结果表明:?差速离心法制备的肝微粒体 纯度较高,优于钙离子沉淀法和聚乙二醇法,酶活性 保持良好.?Bradford法测定鸡肝微粒体蛋白浓 度,稳定性和重复性良好,且快速简便.?CYP450 76543210 0000000 山uQ 150中国兽医科学第36卷 含量测定采用CO还原差示光谱法,即CYP450经 连二亚硫酸钠还原后可与一氧化碳结合,在波长 450nm处出现最大的特征性吸收峰,利用消光系数 可定量测定CYP450含量.同时测定了CYP450在 420nm处的D值,吸收峰不明显,表明失活的 CYP450含量很少.?NADPH一细胞色素C还原酶 活性测定中,以氧化型细胞色素C为电子受体,在 550nm处测量还原型细胞色素C生成速度,以此反 映CYP450的还原能力.?底物代谢法测定AND, ERND和AH活性时,AND和ERND分别对氨基 比林和红霉素进行N一脱氨基反应产生甲醛,甲醛与 Nash试剂显色而被定量检测;AH活性测定的原理 是,AH对苯胺进行4一羟化反应,反应生成的4一氨基 酚可根据Schenkmen法进行定量检测. 4.2从以上试验结果可以看出,本试验建立的鸡肝 微粒体CYP450酶系检测方法灵敏可靠,重复性好, 可作为食品动物CYP450酶系检测的参考方法,能 用于检测鸡肝微粒体水平药物代谢和药物对鸡肝微 粒体CYP450活性的影响. 参考文献(References) [1] [2] [3] GonzalezFJ.RoleofcytochromesP450inchemicaltoxicity andoxidativestress:studieswithCYP2E1[J].MutationRe— search,2005,569:101—110. 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